具有内葡聚糖酶活性的酶的制作方法

专利名称：具有内葡聚糖酶活性的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有内葡聚糖酶活性的酶，生产该酶的方法，及含有本发明酶的酶制剂。
内葡聚糖酶(EC no.3.2.1.4)是一组水解酶，它催化纤维素，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟甲基纤维素)地衣淀粉，在β—1.4中混有β—1.3键的葡聚糖如谷物β—D—葡聚糖或木葡聚糖(XyLogLucan)及其它含有纤维素部分的植物材料中的1.4—β—D—配糖键。正式名称为内—1.4—β—D—葡聚糖4—葡聚糖基水解酶，但在本发明说明书中使用缩写的术语内葡聚糖酶。可以参考的文献有R.F.Gould，″Cellulases and their Application″，Advances in Chemistry Setries 55，American ChemicalSociety(1969)，T.M.Wood，″Properties and Mode ofActior of Cellulases″，in Biotechnology andBioengineering Symposium，no.5，John Wiley，111-137(1975)，Y.-H.Lee and L.T，Fan″，Propetties andMode of Actior of Cellulose″，Advances inBiochemical engineering 17，101-129(1980)，J.Gokesφyr and J. Eriksen，″Cellulases″in A.H.Rouse， Microbial Enzymes and Bioconversions，Academic Press，283-230(1980)，T.-M.Enveri，″MicrobialCellulases″in W.M.Fogarty，Microbial Enzymes andBiotechnology，Applied Science Publishers，183-224(1983).
已发现内葡聚糖酶是由各种生物植物和微生物生产的，并已鉴定了各种特性的内葡聚糖酶。如Fry等人(1992)，Nishitani和Tominaga(1992)，Hayashi等人(1984)，McDougall和Fry(1991)及WO 93/17101公开了已在各种植物中鉴别出木葡聚糖特异性的内葡聚糖酶。发现所有这些酶都有转移酶活性(按如Fry等人，1992和Nishitani等人1992定义的)，因此，不能将其算作真正的内葡聚糖酶。迄今为止，未在微生物中鉴定出木葡聚糖特异性的内葡聚糖酶。
Beldman等人(1985)(Trichoderma viride)及WO 93/20193(Aspergillus aculeatus)中描述过微生物内葡聚糖酶，而后一篇参考文献仅是在本发明优先权日之后才公开。此外，Sharma等人，1991，Oci等人，1990，和GilRes等人1991描述过微生物内葡聚糖酶。
可以很好地将内葡聚糖酶用于降解植物细胞壁和细菌多糖中存在的纤维素成分。具有高木葡聚糖降解活性的内葡聚糖酶对于降解具有高木葡聚糖含量的细胞壁物质，如在葡萄酒和水果加工工业中，对于果胶提取以及从纺织纤维中除去半纤维素均是特别有用的。
本发明的目的是提供表现出有用的底物特异性的新内葡聚糖酶以及以比到目前为止可能有的更好的产率和更高的纯度，生产内葡聚糖酶的方法。另一目的是提供新产品，其中，要么提高要么降低相对于原产物中比例的内—β—1.4—葡聚糖酶的比例。可以单独或与其它酶结合起来，用本发明的内葡聚酶和新产物降解植物细胞壁组织。
因此，本发明第一方面涉及一种表现出内葡聚糖酶活性的酶，所述酶由含有至少一种下列部分序列的DAN序列编码(a) ATTCATTTGTG GACAGTGGAC (SEQ ID No 1)(b) GTTGATCGCA CATTGAACCA (SEQ ID No 2)(c) ACCCCAGCCG ACCGATTGTC (SEQ ID No 3)(d) CTTCCTTACC TCACCATCAT (SEQ ID No 4)(e) TTAACATCTT TTCACCATGA (SEQ ID No 5)(f) AGCTTTCCCT TCTCTCCCTT (SEQ ID No 6)(g) GCCACCCTGG CTTCCGCTGC CAGCCTCC (SEQ ID No 7)(h) GACAGTAGCA ATCCAGCATT (SEQ ID No 8)(i) AGCATCAGCC GCTTTGTACA (SEQ ID No 9)(j) CCATGAAGTT CACCGTATTG (SEQ ID No 10)(k) GCACTGCTTC TCTCCCAGGT (SEQ ID No 11)(l) GTGGGCGGCC CCTCAGGCAA (SEQ ID No 12)(m) ACGCTCCTCC AATTTTCTCT (SEQ ID No 13)(n) GGCTTGGTAG TAATGAGTCT (SEQ ID No 14)(o) GGCGCAGAGT TTGGCCAGGC (SEQ ID No 15)(p) CAACATCCCC GGTGTTCTGGG (SEQ ID No16)在本发明中，术语“内葡聚糖酶活性”用于说明水解任何纤维素物质，如纤维，纤维素衍生物，地衣淀粉、β—D—葡聚糖，或木葡聚糖中存在的1.4—β—D—配糖键的能力。可以用本领域已知的方法，及根据本文材料和方法及实施例部分中描述的实例确定内葡聚糖酶活性。将1单位内葡聚糖酶活性(如，CMCU，AVIU，XGU或BGU)定义为每分钟从葡聚糖底物生产1μmol还原糖，葡聚糖底物是如，CMC(CMCU)，酸胀长微晶纤维素(AVIU)，木葡聚糖(XGU)或谷物β-葡聚糖(BGU)。按本文材料和方法部分中的描述确定还原糖。将内聚糖酶对底物的特异活性定义为每mg蛋白质的单位数。
在另一方面，本发明涉及表现出内葡聚糖酶活性的酶，该酶(i)由含有或下列部分序列的至少一种所包合的DNA序列编码AAAGATTCATTTGTGGACAGTGGACGTTGATCGCACATTGAACCAACCCCAGCCGACCGATT-GTCCTTCCTTACCTCACCATCATTTAACATCTTTTCACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCCGCTGCCAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACCGCCGGTGACTTCACCCTGTACAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGGCACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGGCGACACCATCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAAGAGCTATGCCAACG (SEQ ID No 17) orCAGCATCTCCATTGAGTAATCACGTTGGTGTTCGGTGGCCCGCCGTGTTGCGTGGCGGAGGCTGCCGGGAGACGGGTGGGGATGGTGGTGGGAGAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACCGGAAAACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGGGATAAATGAGATTGAATGGTGGCCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGTACATACAATGCATATACCAATTATACCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID No18)或者由与编码具有内葡聚糖酶活性的多肽的序列同源的序列编码，(ii)与抗体有免疫反应性，所述抗体是由i)中定义的DNA序列编码并得自棘孢曲霉CBS 101.43，的高纯度内葡聚糖酶激发产生的，和/或(iii)是木葡聚糖特异性的。
在本发明中，术语“木葡聚糖特异性”用于说明酶在木葡聚糖底物上表现出高度的活性，而仅当在其它含纤维素的底物如羧甲基纤维素，纤维素或其它葡聚糖上是低活性的。
可以将对木葡聚糖的内葡聚糖酶特异性定义为一种相对活性，可以确定为通过将所述酶在最佳条件下分别与木葡聚糖和其它被检测底物一起培养得到的还原糖的释放。例如，可以将特异性定义为木葡聚糖对β—葡聚糖的活性(XGU/BGU)或木葡聚糖对羧甲基纤维素的活性(XGU/CMCU)或木葡聚糖对酸胀微晶纤维素(XGU/AVIU)。
在下列说明中，将由上述特性i)到iii)定义的酶称为内葡聚糖酶II型(或缩写为内葡聚糖酶II或EGII)。
在本发明中，术语“得自”不仅用于说明由菌株CBS 101.43产生的内葡聚糖酶，而且指由从菌株CBS 101.43分离的DNA序列编码并在用所述DNA序列转化的宿主生物中生产的内葡聚糖酶。
在本发明中，术语“同系物”指由DNA编码的多肽，在特定条件下(如在5xSSC中预浸并在5xSSC，5xDenhardt′s溶液、和50μg声处理变性的牛犊胸腺DNA液中于-40℃预杂交1小时，接着在用50μCi 30—P—dCTP标记探针补充的相同溶液中，于-40℃杂交18小时，用ZxSSC，0.2％SDS，于40℃洗3次共30分钟)所述DNA与同编码本发明内葡聚糖酶的DNA相同的探针杂交。更具体地说，该术语指一种DNA序列，它与上述编码本发明内葡聚糖酶的任何序列有至少70％的同源性，如与上述任何序列有至少75％，至少80％，至不85％，至少90％或甚至95％的同源性。该术语包括上述DNA序列的任何修饰，如不会产生由该序列编码的另一种多肽氨基酸序列的核有酸取代，但所述取代与宿主生物密码子的使用相一致，并将含有任何所述DNA序列的DNA构建体导入所述宿主生物，或者是会产生不同氨基酸序列的核苷酸取代，并因此，可能会产生不同蛋白质结构，所述不同蛋白质结构可能会产生一种与天然酶相比，有不同特性的内葡聚糖酶突变体。其它可能修饰的实例是将一个或多个核苷酸插入所述序列，在所述序列两末端的任何一端加入一个或多个核苷酸，或者在所述序列两末端之一或序列内缺失一个或多个核苷酸。
还有一方面，本发明涉及表现出内葡聚糖酶活性的酶，该酶iv)由含有或下列部分序列所包括的DNA序列编码GACAGTAGCAATCCAGCATTAGCATCAGCCGCTTTGTACACCATGAAGTTCACCGTATTGGCACTGCTTCTCTCCCAGGTGTGGGCGGCCCCTCAGGCAAACGCTCCTCCAATTTTCTCTGGCTTGGTAGTAATGAGTCTGGCGCAGAGTTTGGCCAGGCCAACATCCCCGGTGTTCTGGG (SECID No19)或者由一种与编码具有内葡聚糖酶活性的多肽的序列同源的序列编码，和/或v)与由抗高纯度内葡聚糖酶产生的抗体有免疫反应性，所述内葡聚糖酶由iv)中所定义的DNA序列编码并得自棘孢曲霉CBS 101.43在下列说明中，由特性iv)和v)所定义的酶称为内葡聚糖酶IV型(或缩写为内葡聚糖酶IV或EGIV)。
在另一方面，本发明涉及用于降解植物细胞壁成分的酶制剂，在如上述表现出内葡聚糖酶活性的酶中富集所述的制剂，以及涉及所述酶制剂的各种用途。
已经发现本发明的II型内葡聚糖酶对木葡聚糖有令人惊奇高的特异性并且对该底物有很高的特异性。
本发明的II型内葡聚糖酶优选的是XGU/BGU，XGU/CMU和/或XGU/AVIU比率(如上定义的)高于50，如75，90或100的酶。
此外，若对木葡聚糖的活性为100％，则II型内葡聚糖酶优选的是基本没有对β—葡聚糖的活性和/或表现出最多3％如最多2％或约1％对羧甲基纤维素和/或微晶纤维素的活性。另外，本发明的II型内葡聚糖酶优选的是基本没有转移酶活性，一种对于大多数植物源木葡聚糖特异内葡糖酶均可观察到的活性。
正如从下列实施例可以明显看出，本发明的II型内葡聚糖酶可以是从真菌棘孢曲霉得到的。以前未描述过具有II型内葡聚糖酶特异性的微生物内葡聚糖酶。已描述过来自植物的木葡聚糖特异性内葡聚糖酶，但这些酶有转移酶活性，因此，无论木葡聚糖的广泛降解是多么令人满意，都必须认为它们次于微生物的木葡聚糖特异性内葡聚糖酶。微生物酶的其它优点是，通常可以在微生物宿主中以比其它来源的酶高的数量生产。
在本发明的一个实施方案中，IV型内葡聚糖酶仅表现出很低的木葡聚糖活性。尤其是，IV型内葡聚糖酶可以基本没有木葡聚糖降解活性。此外，IV型内葡聚糖酶表现出令人惊奇高的β—葡聚糖异性和特异活性。
可以用一般方法分离本发明的酶，包括—用适当的载体，从曲霉属克隆DNA文体，—用所述载体转化适宜的酵母宿主细胞，—在适当的条件下培养宿主细胞以表达由DNA文库中克隆所编码任何所需酶，和
—通过确定由所述克隆生产的酶的任何内葡聚糖活性来筛选阳性克隆。
下文实施例1中将更详细地描述该筛选方法。
可以例如通过筛选棘孢曲霉，如菌株CBS 101.43(可以从CentraaLbureau Voor SchimmeLcuLtures公开得到)的CDNA文库，并挑选表达适当酶活性的克隆，从而分离编码所述酶的DNA序列，所述酶活性即由酶水解含葡糖的聚合物(如纤维素，谷物β—葡聚糖或木葡聚糖)中两个葡萄糖分子间β—1.3和/或β—1.4键的能力而定义的内葡聚糖酶活性。然后用标准方法，如在实施例1中描述的，从克隆中分离适当的DNA序列。希望通过用相似的方法筛选另霉、木霉属的菌株，尤其是T.harzianum，T.reesie，镰孢属的菌株，尤其是尖镰孢霉或腐质霉属的菌株的CDNA文库，可以得到编码同源酶的DNA序列。
另外，可以用熟知的方法，很方便地通过使用在本文公开的DNA序列基础上制备的寡核苷酸探针，如20链节探针从任何上述生物的DNA中分离编码本发明内葡聚糖酶的DNA。例如，可以以上述部分核苷酸序列a)—p)的任何一个为基础，制备适宜的寡核昔酸探针。
随后，将DNA序列插入重组表达载体中。这可以是任何很方便地适用于重组DNA方法的任何载体，载体的选择经常取决于它所导入的宿主细胞。因此，载体可以是自我复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，如质粒。此外，载体可以是若导入宿主细胞后，被整合到宿主细胞基因组中并与其所整合的染色体一起复制的载体。
在载体中，应经操作将编码内葡聚糖酶的DNA序列与适当的启动子和终止序列相连。启动子可以是在所选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，并且可得自编码与宿主细胞同源或异源蛋白质的基因。用于连接分别编码内葡聚糖酶、启动和终止于DNA序列并将其插入适当载体的方法是本领域专业人员熟知的(参见，例如，SambrooR等人，Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
用编码本发明酶的DNA序列转化的宿主细胞优选的是真核细胞，特别是真菌细胞如酵母或丝状真菌细胞。特别是，细胞可以属于曲霉属，最好是米曲霉或黑曲霉。可以用包括本身已知的方法中，原生质体形成和原生质体转化接着再生细胞壁的方法转化真菌细胞。在EP238023(Novo NordisR A/S的)中描述了用曲霉属作为宿主微生物，该内容引入本文作为参考。宿主细胞也可以是酵母细胞，如酵母属的菌株，特别是啤酒酵母。
在另一方面，本发明涉及按照本发明生产酶的方法，其中在允许所述酶生产的条件下，培养用编码所述酶的DNA序列转化的适宜的宿主细胞，并从培养物中回收所得的酶。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是任何适于研究的宿主胞生长的常规培养基。可以很方便地将表达的内葡聚糖酶分泌到培养基中并用熟知的方法将其回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离出细胞，用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，接着用层析法如离子交换层析，亲和层析等。
可以用因此纯化的内葡聚糖酶免疫用于生产抗体动物。更具体地，可以按N.Axelsen等人在A Manual of QuantitativeImmccnoelectrophoresis Blackwell ScientificPublications，1973，Chapter 23，或A.Johnstone和R.Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell ScientificPublications，1982(更具体的PP.27—31)中描述的方法，通过免疫兔子(或其它啮齿动物)得到抗内葡聚糖酶的抗血清。通过例如盐沉淀(CNH)2SO4)，接着渗析和离子交换层析，如在DEAE—Sephader上，从抗血清中可以得到纯化的免疫球蛋白。通过Outcherlony双扩散分析(O.Outchterlony，Handbook ofExperimental Immunology(D.MWeir，编)，BlackwellScientific Publications，1967，PP，655—706)，通过交叉免疫电泳(N.Aaxelsen等人，同上文，Chapter 3和4)或通过火箭免疫电泳(N.Axelsen等人，Chapter 2)完成蛋白质的免疫化学特征描述。
按照本发明，生产出的内葡聚糖酶基本不合有其它的植物细胞壁降解酶。这使得有可能单独或与其它酶如半乳聚糖酶和木聚糖酶结合起来使用该酶，以得到具有特定应用的最佳酶组合。由此可以设计仅降解植物细胞特定部分的酶组合物。以前用市售的纤维素酶，半纤维素酶和/或果胶酶制品不可能得到这种特异性的降解。
本发明提供宽特异性范围的内葡聚糖酶。因此，已发现本发明的II型内葡聚糖酶具有高度的木葡聚糖特异性，而IV型内葡聚糖酶降解纤维素和纤维素衍生物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，混有β—1.3—1.4的葡聚糖如谷物β—葡聚糖。事实上，发现本发明的IV内葡聚糖有很高的β—葡聚糖降解能力。
这使得可将内葡聚糖酶用在需修饰或全部或部分降解的纤维素、木葡聚糖和混有β—1.3—1.4的葡聚糖或这些底物的衍生物的方面。
由于该酶降解大麦的β—葡聚糖并由此降低麦芽汁的粘度并改善其过滤性，对混有β—1.3—1.4的葡聚糖的活性使得EGIV和其同系物可用于啤酒酿造目的。在啤酒酿造中，与其他内葡聚糖酶相比，高度的β—葡聚糖特异性是一种优点，这是由于可以降低由β—葡聚糖引起的粘度而同时不会降解对于麦芽汁过滤性所必需的且在啤酒酿造者消耗谷物时起助滤剂作用的纤维素结构。最后，对混有β—1.3—1.4的葡聚糖的活性使得该酶可用于加入到动物饲料中以改善饲料的摄取。
本发明II型内葡聚糖酶对木葡聚糖的活性以及IV型内葡聚糖酶对纤维素的活性对于水果和蔬菜的处理有用的。例如可以将内葡聚糖酶用于高产率的果汁加工中，如苹果和梨的压碎处理。根据使用的酶组合，可以使果汁澄清或悬浮物保持稳定。可以将内葡聚糖酶用于葡萄的磨碎压汁处理，以使葡萄酒的产率更高，气味更芳香，颜色更好。可以用内葡聚糖酶促进从柑桔属的皮、苹果，或甜菜中提取果胶并用于纯化其它工业胶如瓜耳胶和刺槐豆胶，由于重组酶具有可以以不含有果胶解酶或胶降解酶如甘露聚糖酶的方式生产出它们的优点。
必须得从植物纤维如棉花，亚麻纤维、大麻纤维中且在其用于纺织前，除去象木葡聚糖这样的半纤维素。对于该目的，II型内葡聚糖酶具有特异性地除去木葡聚糖而不会破坏纤维素的优点。这种内葡聚糖酶可以单独或与其它对纤维中果胶物质有活性的酶(如果胶酶)一起使用。
此外，可以用本发明内葡聚糖酶和其类似物处理纤维素纤维或富含纤维素纤维的物质。例如，可以在造纸工业中使用内葡聚糖酶以改善纸浆的排放，且处理织物如棉花织物以得到更光滑的织物。
也可以用本发明的内葡聚糖酶从含有混有β—1.3—1.4的葡聚糖和木葡聚糖的如植物物质中生产寡糖。可以用所得的寡糖作为如食品中的添加剂。
按上文，本发明优选的酶制剂类型是一种用本发明的内葡聚糖酶，如II型内葡聚糖酶和/或IV型内葡聚糖酶，优选地与一种至少1.1富集因子一起富集的酶制品。用该方法，可以得到细胞壁降解能力提高的酶制品。
用本发明酶富集的酶制品可以，例如是含有多酶活性的酶制品，特别是含有多种植物细胞壁降解酶如Pectines，PectinexUltra SP，Celluclast或Cellu2yme(均得自Novo NordiskA/S)的酶制品。在本发明中，术语“富集的”指由于加入了用上述方法制备的本发明酶，如用1.1富集因子，很方便地提高了酶制品的内葡聚糖酶活性。
另外，用表现出内葡聚糖酶活性的酶富集的酶制品可以是合有本发明酶作为主要酶组份的酶制品，如单组分酶制品。
可以按本领域熟知的方法制备酶制品，并且它可以是液体或于制品形式。例如，酶制品可以是颗粒或微颗粒形式。可以按本领域熟知的方法将制品中所包括的酶进行稳定化处理。
本发明的酶制剂，除本发明的内葡聚糖酶外，还包含一种或多种其它的植物细胞壁降解酶，例如具有纤维素解，木聚糖解或果胶解活性的酶，如木聚糖酶，阿拉伯聚糖酶(arabinanase)，鼠李半乳糖醛酶，果胶己酰基酯酶，半乳糖苷酶，聚半乳糖醛酶，果胶裂解酶，果胶酸盐裂解酶，内葡聚糖酶，或果胶甲基酯酶。用属于曲霉属的微生物，优选的黑曲霉，棘孢曲霉，泡盛曲霉，米曲霉，其它酶也是可生产的。所述制剂能够提供极好的总液化力并且因此明显降低苹果榨汁和相似生物物质的粘度。
应理解可以将酶制剂用于上述目的。从这方面看，以本领域已知的方法为基础，可以确定本发明酶制剂的剂量以及使用酶制剂的其它条件。
用旋转粘度计连续续监测2小时以上，按精细磨碎的苹果汁中总粘度(＝浆液十结构粘度的函数)降低来确定酶制剂的总液化力。
用附图进一步说明本发明，其中

图1是质粒pYHD17的限制图谱。
图2是质粒PHD414的限制图谱。
图3说明在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中测量的EGII，EGIII和EGIV的最佳PH值。将每种酶的最佳活性定义为100％。
图4，1小时后，与新鲜酶的活性(100％)，在不同PH按剩余活性测量的EGII和EGIII的PH稳定性图5为EGII和EGIII的最佳温度，将每种酶的最佳温度定为100％，和图6，在水中不同温度下预培养1小时后，与新鲜酶的活性(100％)相比，按剩余活性测量的EGII和EGIII的温度稳定性。
在下列实施例中将进一步描述本发明，所述实施例不象权利要求那样以任何方式限制本发明的范围。
材料和方法供体生物从在含大豆的发酵培养基中生长，同时搅拌以确保足够进气的，棘孢曲霉CBS 101.43中分离mRNA。生长3—5天后，收获菌丝体，然后立即冷冻在液氮中并于-80℃贮存。
酵母菌株所用的啤酒酵母菌株是yNG231(MATα，leu2，ura3—52，his4—539，pep4—δ1，cir+)或JG169(MATα；ura 3—52；Leu2—3；112；his 3 D200；pep 4—113；prclHIS 3；prb/LEU2；cir+)。
构建表达质粒用SpeI切割市售质粒pYESII(Invitrogen)，用Klenow DNA聚合酶+dNTP填平并用ClaI切割。在琼脂糖凝胶上将DNA按大小分级分离，然后电洗脱纯化给2000bp的片段。用ClaI/PvuII切割相同的质粒，并经电洗脱纯化约3400bp的片段。将这两个片段与合有酵母TPI启动子的平头末端的sphI/EcoRI片段相连。该片段来自一种质粒，在该质粒中TPI启动子来自啤酒酵母(CfT.Albers and G.Kawasaki，J.Md.Appl.Genet，1，1982，PP.419z—434)且经稍微修饰所述修饰指通过缺失构成该位点核心的4bp而除去内部的SphI位点。此外，用BalI外核酸酶处理来除去多余的启动子游序列，接着加入SphI接头。最后，在位置-10加入EcoRI接头。这些修饰完成后，启动子被包括在SphI—EcoRI片段中。与原启动子相比其效果似乎未受到修饰的影响。图1中列出了所得质粒pYHD17。
制备无RNase的玻璃制品，尖嘴和溶液将在RNA分离中所用的全部玻璃制品均于220℃烘烤至少12小时。用0.1％焦碳酸乙二酯(DEPC)的EtoH将Eppendorf管，吸管尖和塑料柱处理12小时并高压灭菌。在37℃，将所有缓冲液和水(除含Tris的缓冲液)用0.1％DEPC处理12小时，并高压灭菌。
提取总RNA通过用硫氰酸胍处理，接着通过一个5.7M cscl垫层(Chirgwin等人，1979)超离心，并且下列改变制备总RNA。用研钵和杵在液N2中将冷冻的菌丝体磨成精细的粉末，接着在预冷的咖啡研磨机中研磨，并立即悬浮在5体积的RNA提取缓冲液(4M GuSCN，0.5％月桂基肌氨酸钠，25mM柠檬酸钠，PH7.0，0.1Mβ—巯基乙醇)中。将混合物在RT°搅拌30分钟，并离心(30分钟5000rpm，RT°Heraeus Megafuge 1.0R)以沉淀细胞碎片。收集上清液，仔细地例入5.7MCsCl垫层(5.7MCsCl，0.1M EDTA，PH7.5，0.1％DEPC；使用前高压灭菌)使其分层，每12.0mlCscl垫层用26.5ml上清液，然后离心以得到总RNA(Beckman，SW 28 rotor，25000rpm，RT°，24小时)。离心后，仔细除去上清液，切出含RNA的试管底层并用70％ETOH漂洗。将总RNA沉淀小转移到Eppendorf试管，悬浮于500ul TE，PH7.6(如果困难，在65℃间断加热5分钟)，酚提取，在-20℃用乙醇沉淀(2.5体积EtOH，0.1体积3M NaAc，PH5.2)。通过离心收集RNA，用70％EtOH洗涤，并再悬于最小体积的DEPC—DIW中。通过测量OD260/280确定RNA浓度。
分离Poly(A)+RNA用寡(dT)—纤维素亲和层析(Aviv &Leder，1972)分离poly(A)+RNA。在10ml1×柱加样缓冲液(20mMTris—Cl，PH7.6，0.5M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)中预0.2克寡(dT)纤维素(Boehringer Mannheim)，加到DEPC处理的，填塞的塑料柱(Poly Prep Chromatogramhy Column，Bio Rad)上，用20ml1×加样缓冲液平衡。在65℃，将总RNA加热8分钟，在冰上猝灭5分钟，然后，将1体积2×柱加样缓冲液加到在该柱上的RNA样品中。收集洗脱液，将洗脱液再加样2—3次。并在每次加样前按上述加热样品并在冰上猝灭。用10体积1×加样缓冲液洗涤寡(dT)柱，然后用3体积培养基盐缓冲液(20mM Tris—Cl，PH7.6，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)洗涤，接着用预热到65℃的3体积洗脱缓冲液(10mM Tris—Cl，PH 7.6，1mM EDTA，0.05％SDS)洗脱poly(A)+RNA，收集500μl馏分。读出每个所收集部分的OD260，收集含各部分的mRNA，并在-20℃将其用乙醇沉淀12小时。通过离心收集poly(A)+RNA，将其再悬于DEPC—DIW中，并在-80℃以5—10μg等份贮存。
Northern印迹分析在1.2琼脂糖-2.2M甲醛凝胶(Sambrook等人，1989)中将来自各菌丝体的poly(A)+RNA(5μg/样品)电泳，并用10×SSC(Sambrook等人，1989)作为转移缓冲液印到尼龙膜(Hybond-N，Amersham)上。在各杂交中使用三种随机引发的(Feinberg &Vogelstein，1983)32P—标记的cDNA探针1)编码来自棘孢曲霉的聚半乳醛糖酶的1.3kb Not I—SpeI片段(在丹麦专利申请DK1545/92中有描述)，2)编码棘孢曲霉内葡聚糖酶的1.3kb NotI—SpeI片段(DK 0419/92中描述过)和3)编码棘孢曲霉半乳聚糖酶的1.2kbEagI片段(在WO 92/13945中描述过)。在5×SSC(Sambrook等人，1989)，5×Dinhardt′s溶液(Sambrook等人，1989)，0.5％SDS(W/V)和100μg/ml变性鲑精子DNA中，用浓度为ca.2ng/ml的探针，在65℃经16小时完成Northern杂交，接着在65℃，用5×SSC(2×15分钟)，2×SSC，0.5％(1×30分钟)，0.2×SSC，0.5％SDS(1×30分钟)，和5×SSC(2×15分钟)洗涤。在-80℃放射自显影12小时后，按制造商的说明从滤器上除去探针#1并再用探针2杂交，最后用探针#3杂交。用Bethesda Research Laboratories的RNA梯作为大小标记物。
CDNA合成第一条链的合成用发夹修饰，通过RNase H方法(Gubler&Hoffman 1983，Sambrook等人，1989)，从5μg棘孢曲霉合成双链cDNA。在70℃，将poly(A)+RNA(在5μl DEPC处理的水中含5μg)加8分钟，在冰上猝灭，并以50μl的终体积与反转录酶缓冲液(50mM Tris—CL，PH8.3，75mM kcl，3mMgcl2，10mMDTT，Bethesda Research Loboratories)混合，该缓冲液含每种dNTP/mM(Pharmacia)，40单位人胎盘核酸酶抑制剂(RNasin，Promega)，10μg寡(dT)12-18引物(Pharmacia)和1000单位Superscript II RNASE H-反转录酶(Bethesda ResearchLaboratories)。将反应混合物在45℃温育1小时，合成第一链CDNA。
第二条链的合成合成后，加入30μl 10mMTris—cl，PH7.5，1mMEDTA，通过加入40μg糖原载体(Boehringer Mannheim)，0.2体的10M NH4Ac和2.5积96％EtoH，在-20℃，将mRNAcDNA杂交物乙醇沉淀12小时。离心回心杂交物，用70％EtoH洗涤，空气干燥并重悬于250μl含各100μM dNTP，44单位大肠杆菌DNA聚合酶((Amersham)，6.25单位RNase H(Bethesda Reasearch Laboratories)和10.5单位大肠杆菌DNA连接酶(New England Biolabs)的第二链缓冲液(20mM Tris-Cl，PH 7.4，90mMkcl，4.6mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，16μMβ NAD+)中。通过在16℃将反应试管温育3小时，完成第二链cDNA的合成，加入EDTA达到20mM终浓度停止反应，接着用酚提取。
绿豆核酸酶处理加入2体积96％EtoH，0.1体积3M NaAc，PH5.2，在-20℃，将双链(ds)CDNA乙醇沉淀12小时，离心将其回收，用70％EtoH洗涤，干燥(SpeedVae)，并重悬于30μl含36单位绿豆核酸酶(Bethesda Research Laboratories)的绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc，PH4.6，300mM NaCl，1mM ZnSO4，0.35mMDTT，2％甘油)中。通过在30℃将反应温育30分钟，修剪单链发夹DNA，接着加入70μl 10mM Tris—Cl，PH7.5，1mM EDTA，酚提取，在-20℃用2体积96％EtoH，0.1体积3M NaAc，PH.5.2乙醇沉淀2小时。
用T4 DNA聚合酶切成平整末端在50μl含各0.5mM dNTP，7.5单位T4 DNA聚合酶(Invitrogen)的T4 DNA聚合酶缓冲液(20mM乙酸Tris，PH 7.9，10mM MgAc，50mM KAc，1mM DTT)中，通过于37℃将反应混合物温育15分钟，用T4 DNA聚合酶将ds DNA切成平整末端。加入EDTA达到20mM的终浓度，从而停止反应，接着酚提取和醇沉淀。
衔接物连接和大小选择填平反应后，在30μl合600pmolBstxI衔接物和5单位T4连接酶(Invitrogen)的连接缓冲液(50mMTris—Cl，PH 7.8，10mM MgCl；2，10mM DTT，1mM ATP，25μG/ml牛血清白蛋白)中，通过将反应混合物在16℃温育12小时，将cDNA与非回文结构的BstxI衔接物(1ug/ul，Invitrogen)相连。在70℃加热5分钟停止反应，用琼脂糖凝电渌(0.8％HSB—琼脂糖，FMC)，将衔接的cDNA按大小分级分离以分离未连接的衔接物和小cDNA。用0.7kb的截段(cwt—off)按大小选择cDNA，并在10mM Tris—Cl，PH 7.5，1mM EDTA中用100伏，将cDNA从琼脂糖凝胶中电洗脱1小时，按上述在-20℃经12小时酚提取及乙醇沉淀。
构建cDNA文库经离心回收衔接的ds cDNA，用70％EtoH洗涤并重悬于25ml DIW中。在大量的文库连接前，在10μl各含1μ dscDNA(页应试管#1—#4)，2单位T4连接酶(Invitrogen)和50ng(试管#1)，100ng(试管#2)和200ng(试管#3和#4)Bst XI裂解的酵母表达载体pYES 2.0载体Invitrogen或yHD13的连接缓冲液(与上文同)中完成四种试验连接。在16℃温育12小时完成连接反应，于70℃加热5分钟，将各1μl的连接物电击穿(200Ω，2.5ky，25μF)到40μl感受态的大肠杆菌1061细胞(在1升LB—培养液中OD600＝0.9，用冷DIW洗涤两次，用20ml 10％甘油洗1次，重悬于2ml 10％甘油中)中。将1ml SOC加到每种转化混合物中，在37℃细胞生长1小时，将50μl铺在LB+氨苄青霉素盘(100μg/ml)上，在37℃生长12小时。
用最佳条件，在40μl含9单位T4连接酶的连接缓冲液中完成大量的连接，将反应物在16℃温育12小时。在70℃加热5分钟使连接反应停止，在-20℃乙醇沉淀12小时，离心回收并重悬于10μlDIW中。用与上述相同的电击穿条件，将1μl样品转化到电感受态的大肠杆菌1061细胞中，滴定转化的细胞，将文库平铺在5000—7000 c.f.u/板的LB十氨苄青霉素板上。将3ml培养基加到每个平板中，刮掸细菌，加入1ml甘油，于-80℃作为库贮存。剩余的2ml用于DNA分离。如果DNA的数量不够，从而不能得到所需数量的酵母转化体。则从在-80℃，用50μl细菌原种接种，然后过夜繁殖的500ml培养基(TB)中制备大量的DNA。
构建酵母文库为了确保在酵母中检测所有的细菌克隆，在原库中，将比细菌克隆数大5倍的酵母转化体定为极限。
将1μl来自个体库的纯化质粒DNA(100ng/μl)电击穿(200Ω，1.5ky，25μF)至40μl感受态啤酒酵母JG 169细胞(在500ml YPD中OD600＝1.5，用冷DIW洗涤两次，用冷1M山梨醇洗1次，再悬于0.5ml 1M山梨醇中，Becker & Guarante，1991)。加入1ml 1M山梨醇后，将80μl样品铺在SC+葡萄糖—尿嘧啶上，以得到250—400c.fu/板并在30℃温育3—5天。
构建曲霉菌表达载体载体pHD414是质粒p775(在EP238023中描述过)的衍生物。与该质粒的较起来，pHD414在启动子和终止子之间有一系列唯一的限制位点。通过除去终止于3′末端约200bp长的片段(含不需要的RE位点)，随后除去启动于5′末端约250bp长的片段(也含有不需要的位点)，构建质粒。用NarI(位于pUC载体)和xbaI(终止于的3′)裂解除去200bp区，然后用Klenow DNA聚合酶十dNTP填平产生的末端，在凝胶上纯化载体片段并再连接载体片段该质粒称为pHD413。用StuI(位于启动于的5′末端和Pvu II(在pUC载体中)切割pHD413，在凝胶上分离并再连接。在作为质粒pHD414图谱的图2中列出于质粒pHD414，其中“AMG终止于”指黑曲霉葡糖淀粉酶终止于，和“TAKA启动于”指米曲霉TAKA淀粉酶启动了。
转化米曲霉或黑曲霉(一般方法)用米曲霉或黑曲霉孢子接种100ml的YPD(Sherman等人，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory，1981)并在37℃震荡培养约2天。通过米拉滤布(miracloth)过滤收集菌丝体，并用200ml的0.6M MgSO4洗涤。将菌丝体重悬于15ml 1.2M MgSO4 10mM NaH2PO4，PH＝5.8中。将悬浮液在冰上冷却，加入1ml含120mgNovozym234，batch 1687，并在37℃缓慢搅动温育1.5—2.5小时，直到在显微镜下检查的样品中观察到大量原生质体。
通过米粒滤布(miracloth)过滤悬浮液，将滤物转移到无菌试管中并用5ml 0.6M山梨醇，100mM Tris-HCl，PH＝7.0覆盖。以100g离心15分钟，从MgSO4垫层的顶部收集原生质体。将2体积STC(1.2M山梨醇，100mM Tris—HCl，PH＝7.5，10mM CaCl2)加到原生质体悬浮液中，并以1000g将混合物离心5分钟。将原生质体球重悬于3ml STC中并再离心成球。重复该步骤。最后将原生质体重悬于0.2—ml STC。
将100μl原生质体悬浮液与10μl STC中5—25μg的适当DNA混合。将原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉amds基因的质粒)混合。将混合物在室温放25分钟。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH29576)，10mM CaCl和10mM Tris—HCl，PH＝7.5并仔细混合(两次)，最后加入0.85ml相同溶液，并仔细混合。将混合液在室温放25分钟，以2500g离心15分钟，然后将小球重悬于2ml 1.2M山梨醇。沉淀多次后，将原生质体铺在适当的板上。将原生质体铺在含1.0M蔗糖，PH＝7.0，10mM乙酰胺作为氮源及20mMCsCl的基本板(CoveBiochem.BioPhys.Acta 113(1966)51—56)上以抑制背景的生长。在237℃培养4—7天后，检出孢子，扩散每个菌落。重复该方法，第二次分离后将单个菌落的孢子作为定义的转化体贮存。
培养基YPD10g酵母提取物，20g胨，水加到810ml.高压灭菌，加入90ml 20％葡萄糖(无菌过滤的)。
YPG—琼脂25g/l Bactoagar，15g/l葡萄糖，5g/l k2pO4，0.5g/lMgSO4-7H2O，将PH调到5.0。高压灭菌。
10 XBasal盐66.8酵母氮基，100g琥珀酸，60g NaOH，加1000ml水，无菌过滤。
SC—URA90ml 10XBasal盐，22.5ml 20％酪蛋白氨基酸，9ml1％色氨酸，加806ml水，高压灭菌，加入3.6ml 5％苏氨酸和90ml20％葡萄糖。
SC—H琼脂7.5g/l没有氨基酸的酵母氮基，11.3g/l琥珀酸，6.8g/l NaOH，5.6g/l酪蛋白氨基酸不含维生素，0.1g/l色氨酸和20g/l琼脂(Bacto).在121℃高压灭菌20分钟。高压灭菌后，每450ml琼脂加入55ml 22％半乳糖溶液和1.8ml 5％苏氨酸溶液。
YNB—I琼脂3.3g/l KH2PO4，16.7g/l琼脂，将PH调到7。在121℃高压灭菌20分钟。高压灭菌后，每450ml琼脂加入25ml 13.6％不含氨基酸的酵母氮基，25ml 40％葡萄糖溶液，1.5ml 1％L—亮氨酸溶液和1.5ml 1％组氨酸溶液。
YNB—1液体培养基按YNB—1琼脂的组合物，但没有琼脂。
FC—4—琼脂35g/l琼脂，30g/l大豆粉15g/l麦芽糖糊精(Glucidex 6)5g/l Bacto胨。PH7，在121℃高压灭菌40分钟。
FG4培养基30g/l大豆粉，15g/l麦芽糖糊精(Glucidex 6)，5g/l Bacto胨，121℃高压灭菌40分钟。
AZCL—木葡聚糖从Megazyml，Australia得到。
AZCL—HE纤维素从Megazyml，Australia得到。
描述本发明酶的特征SDS—PAGE电泳按Laemli方法(Laemmli，1970；Christgau，1991)的修改方案，用Mini—Leak 4电泳单位(Kem—En—Tec，Copenhage)完成SDS—PAGE电泳。简言之，用12％丙烯酰胺；0.2％BIS丙烯酰胺；0.1％SDS；0.375 M Tris PH8.8；0.04％APS(过硫酸铵)&0.04％TEMED覆盖分离的凝胶。聚合6—15小时后，用4.5％丙烯酰胺；0.075％BIS—丙烯酰胺；0.1％SDS；66.5mM Tris PH6.8；0.4％W/W APS(过硫酸铵)&0.04％TEMED覆盖积层凝胶用跑样缓冲液(25mM Tris—base；0.192M甘氨酸，&0.05％SDS)填满电极槽，然后在其上载上含样本缓冲液的样品，凝胶以2—4mA/凝胶过夜跑样，以10—30mA/凝胶快跑。随后除去凝胶，用考马斯(Commassie)或银染色。
等电聚焦按制造商的说明，在Multiphor电泳单位AmphooinePAG盘PH 3.5—9.5(Pharmacia，Upsala)上完成等电聚焦。电泳，将凝胶进行考马斯或银染色。
考马斯和银染色仔细地从玻璃板上除去凝胶，并在约100ml的下列溶液中，在缓慢转动的摇床上培养。
考马斯染色1)在40％V/V乙醇；5％V/V乙酸中30分钟2)在40％V/V乙醇；5％V/V乙酸+0.1％考马斯R250中30分钟3)在40％V/V乙醇，5％V/V乙醇中脱色，直到背景消褪到足够的程度。
4)最后，将凝胶在保存液(5％V/V乙酸，10％V/V乙酸，5％V/V甘油)中培养，在两张赛璐玢膜之间空气干燥。
银染色1)在40％V/V乙醇；5％V/V乙酸中30分钟2)在40％V/V乙醇；5％V/V乙酸中20分钟3)在0.0057％W/V APS(0.25mM)k 20分钟4)在0.1％W/V AgNO3中60分钟5)为了显影，将凝胶浸在显影剂(0.015％甲醛；2％W/VNa2CO330—60秒)中，然后在第二轮显影剂中培养凝胶，直到得到令人满意的蛋白质染色(5—15分钟)。最后在保存液(5％V/V乙酸，10％V/V乙醇；5％V/V甘油)中培养，并在两张赛璐玢膜之间空气干燥。
标准培养为了描述酶的特征，在含有1ml底物(AZCL底物或来自Megazyme的纯多糖)的Eppendorf试管中完成培养。将0.5ml0.4％AZCL底物悬浮液与0.5ml 0.1M最佳PH的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合，加入10μl适当稀释的酶溶液。在于95℃加热20分钟失活前，于30℃在Eppendorf Thermomixers中培养15分钟(如果没有另外具体说明)。分三份进行培养。产生一个白点，其中加入了酶但立即失活。离心后，在微滴定板中，测量上清液在620nm的吸收值并去掉白点。
测量该酶对不同纯度多糖来自Mega Zyme的木葡聚糖和β—葡聚糖，CMC(Aqualon的Blanose)和Avicell(Merck的微晶纤维素)的活性。使用前，室温下，用85％正磷酸将Avicell泡胀1小时，然后用丙酮和水洗涤。在0.1M最佳PH的乙酸盐缓冲液(如果没有特别的说明)中制成0.5％溶液/不同底物的悬浮液，向1ml底物中加入10μl酶溶液，在按上述加热失活前，在30℃培养15分钟。通过在微滴定板中与PHBAH试剂反应，确定还原的糖，该试剂含0.15g对羟苯甲酸酰肼(Sigma H-9882)，0.50 g酒石酸钾钠(Merck 8087)及共0.0ml的2％NaoH。减去空白的结果。用葡萄糖作标准。
对Mega Zyme的底物(EG II对AZCL—木葡聚糖，EGIII对纯β—葡聚糖，EGIV对AZCL—β—葡聚糠)测定最佳PH值。0.5ml 0.4％的底物与0.5ml 0.1M各种PH的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合，加入10μl适当稀释的酶溶液。按上述进行培养。
在0.1M上述最佳PH的乙酸盐缓冲液中检测不同内葡聚糖酶对不同AZCL底物的特异性。
在用酶培养最佳PH的AZCL—β—葡聚糖前，通过将酶在0.1M各种PH的柠檬酸/磷酸三钠缓冲液中放1小时，从而测定PH稳定性。
通过在各种温度，最佳PH，将酶与AZCL—β—葡聚糖底物一起温育15分钟，从而测定最佳温度。
在与有关底物于30℃温育前，通过在各种温度，将用水稀释的酶放1小时，来测量温度稳定性。
通过在0.025到1.5％(EG II对木葡聚糖和EGIV对β—葡聚糖)的底物浓度培养，测量反应速率(V)，描绘出作为S函数的S/V，完成线性的回归分析，找出斜率(＝1/Vmax)和截距(km/Vmax)并计算Km和特异活性(＝Vmax/E)，其中E是加入的酶量，从而测量出Km和特异活性。
为了进行凝胶过滤层析，制成1％溶液/上述提到的多糖悬浮液。加入适量的酶，在加热失活前，分别培养0，1，2，4，和24小时。将25μl样品注射到一列三个TSK柱(PWG4000，PWG3000，PW G2500)中，用0.4M乙酸缓液PH3.0以0.8ml/min洗脱糖。通过Shimadzu RI检测器确定洗脱的糖，并收集数据，用Dionex软件进行加工处理。用右旋糖(Sersa的)作为分子量标准。
实施例1按上文描述的，在大肠杆菌中构建棘孢曲霉CBS 101.43的文库，该文库由50个库中的约1.5×106克隆组成。
从该文库的20个克隆中分离DNA并使其经cDNA插入分析。发现插入频率＞90％，插入片段的平均大小为约1400bp。
将来自某些库的DNA转化剂酵母中，并从每个库得到含200—500酵母菌落的50—100个平板。将这些菌落刮掉，并于-80℃贮于甘油中。
将文库的酵母细胞铺在YNB琼脂上，达到总共约250,000个菌落。每平板的菌落数从250到500不等。生长3-5在天后，将琼脂平板复制铺板到几套SC—H琼脂板上并鉴定3种不同的内葡聚糖酶。
一套复制平板合0.1％AZCL木葡聚糖(Megazyme)。将这些平板在+30℃培养2-4天。将II型内葡聚糖酶和III型内葡聚糖酶阳性菌落鉴定为由兰色晕环包围的菌落。
另一组复制平板合0.1％AZCL—HE纤维素。将这些平板在30℃培养2-4天。将III型内葡聚糖酶和IV内葡聚糖酶鉴定为由兰色晕环包围的菌落。
将酶阳性菌落细胞在琼脂上铺成分开单个菌落，并鉴定生产酶的单个菌落并用上述方法选择。
描述阳性菌落的特征得到作为单个菌落的阳性菌落，用生物素化多接头引物，直接从酵母菌落扩增cDNA插入片段，用磁珠(Dynbead M—280，Dynal)系统纯化，然后用链终止方法(Sanger等人，1977)和Sequense系统(United StatesBiochemical)测定每个cDNA克隆的5′末端，从而逐个描述其特征。权利要求2中列出用AZCL木葡聚糖筛选得到的酶基因的部分DNA序列，权利要求6中列出了用AZCL-HE纤维素筛选得到的酶基因的部分DNA序列。得到了III型内葡聚糖酶的部分DNA序列。发现该序列与Ooi等人，1990公开的序列，有基本的同源性。下列实施例包括了III型内葡聚糖酶，以便说明本发明内葡聚糖酶和现有技术内葡聚糖酶之间表现出的差异。
实施例2分离DNA
用下列的一般方法，由两种不同的分离物分离DNA。
将分离物接种到50ml玻璃试验管中的20mlYNB—1液体培养基中。将试管在30℃振荡2天。在300rprm离心10分钟，收集细胞。
将细胞重悬于1ml 0.9M山梨醇，0.1M EDTA，PH 7.5。将小球转移到Eppendorf试管，并以全速离心30秒。将细胞重悬于0.4ml0.9M山梨醇，0.1M EDTA，14mM巯基乙醇，加入100μl 2mg/mlZymolase，并将悬浮液在37℃温育30分钟，然后离心30秒。将小球(原生物球)重悬于0.4ml TE。加入90μl的(1.5ml 0.5M EDTA.PH8.0，0.6ml2M Tris—cl.pH 8.0，0.6ml 10％SDS)，将悬浮液在65℃温育30分钟。加入80μl 5M KOAc，将其悬浮在冰上温育至少60分钟，并以全速离心15分钟。将上清液转移到一个装有EtOH，(室温)的新鲜试管中，接着完全但缓慢混合并离心30秒。用冷70％EtoH洗涤小球，离心30秒并在室温下干燥。将小球重悬于50μlTE(Tris—EDTA)并离心25分钟。将上清液转移到一新鲜试管中，加入2.5μl 10mg/ml RNase，接着在37℃温育30分钟，然后加入500μl异丙醇，同时缓慢混合。将混合物离心30秒，除去上清液。用96％EtoH漂洗小球，在室温干燥。将DNA溶解在50μl水中，达到约100μl/ml的浓度。
用标准方法将DNA转化到大肠杆菌中。分离两个大肠杆菌菌落，用切割DNA插入片段的限制酶HindIII和xbaI分析。
确定几个阳性克隆的DNA序列权利要求2中列出了编码本发明II型内葡聚糖酶的基因的部分DNA序列，权利要求6中列出了编码本发明IV型内葡聚糖酶的基因的部分DNA序列。
实施例3
表达内葡聚糖酶为了表达本发明的内葡聚糖酶，用HindIII/xbaI消化编码内葡聚糖酶的DNA，在凝胶上按大小分级分离，纯化相当于内葡聚糖酶基因的片段。随后将该基因与HindIII/xbaI消化的pH414相连得到质粒pAEG II和pAEGIV。
在大肠杆菌中扩增DNA后，将质粒pAEG II和pAEGIV转化到上述的米曲霉中。
将每个转化体接种在培养皿中央的FG琼脂上。在30℃温育4天后，用塞钻法除去直径4mm的塞状物。
将一组塞状物植入木葡聚糖覆盖的凝胶上，所述凝胶合1％AZCL木葡聚糖和1％琼脂糖的适当PH的缓冲液，在30℃过夜温育。分别按上述鉴定II型内葡聚糖酶和III型内葡聚糖酶的活性。最佳转化体有直径明显大于米曲霉背景的晕。这表明有米曲霉中II型内葡聚糖酶能有效表达。
将另一组塞状物植入HE—纤维素覆盖的凝胶中，所述凝胶含0.1％AZCL—HE纤维素和1％琼脂糖的适当PH的缓冲液，在30℃过夜温育。按上述分别鉴定III型内葡聚糖酶和IV型内葡聚糖酶的活性。最佳转化体具有直径明显大于米曲霉背景的晕。这表明在米曲霉中能有效表达IV型内葡聚糖酶。
补料发酵随后，通过补料发酵表达酶的米曲霉来分别生产EGII，EGIII和EGIV。用于发酵的培养基含有麦芽糖糊精作为碳源，脲作为氮源和酵母提取物。
通过将研究的米曲霉宿主细胞的一摇瓶培养物接种到含3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中进行补料发酵。在34℃，PH5.0培养24小时后，连续补充另外的开始用的碳和氮源。保持碳源作为限制因子，且它可确保氧能过量存在。继续补料培养4天，然后回收酶。
实施例4描述II型和IV型内葡聚糖酶的特征纯化EGII以5000xg离心表达重组酶的米曲霉发酵的培养物上清液，并通过一个0.2μm滤器以除去菌丝体。用带有10KDa膜的Fitronultracette或Amicon超滤装置，将35—50ml过滤的上清液超滤以浓缩10倍。在用相同装置连续两轮的超滤过程中，用20mM Tris PH7.0将该浓缩物稀释100倍。将该超滤样品以2ml/分加样于用20mMTris PH 7.0平衡的Pharmacia HR16/10.Fast Flow QSepharose阴离子交换柱上。用完样品后，用2个柱体积的20mMTris PH7.0洗涤该柱；用在20mM Tris PH7.0中0到0.4M NaCl线性增加的NaCl梯度洗脱结合的蛋白。蛋白洗脱物在约50mMNaCl。用SDS—PAGF确定该酶的分子量为约35KDa，由IEF确定的等电点为3.4。
用纯化的酶进行特征描述纯化III型内葡聚糖将来自表达重组酶的米曲霉发酵培养物上清液(表达水平应至少为0.5mg/ml上清液)以5000xg离心20分钟，通过一个0.2μm滤器过滤以除去菌丝体。用带有3KDa膜的Amicon YM03超滤装置将35—50ml过滤的上清液超滤以浓缩10倍。用相同装置连续两轮超滤过程中，用20mM Tris PH 8.0将浓缩物稀释100倍。将该超滤样品以1.5ml/分加样于用20mM Tris PH 8.0平衡的PharmaciaHR 16/10 Fast Flow Q Sepharose阴离子交换柱上。加完样品后，洗涤使III型内葡聚糖通过柱，而污染的不纯部分仍与柱结合。该部分中III型内葡聚糖酶的纯度大于95％。用SDS—PAGE确定该酶的分子量为约26KDa，由IEF确定的等电点为5.5。
用该纯化的酶进行特征描述，对于EG IV，用发酵上清液进行特征描述。
最佳PH值在图3中可看到不同酶的最佳PH值。EGII的最佳PH值为约3.0，EGIV为约3.5。从最佳PH值可以看出，EG II和EG IV均是在PH2.5到4.0表现出最佳活性的酸性内葡聚糖酶，而EGIII的最佳PH值为4.0到6.0。
底物特异性在下列表中看出，与最佳底物(100％)相比，按不同酶从不同多糖释放的还原糖而确定的相对活性酶 EGIIEGIIIEGIVAVICEll 1％ 0％ 3％CMC 1％ 2％ 11％β—葡聚糖 0％ 100％100％木葡聚糖 100％ 31％ 0％可以从这些结果计算出不同内葡聚糖酶的特异性酶 EGII EGIIIEGIVXGU/BGU∞ 0.31 0
XGU/CMC 104 18 0XGU/AVIU 114 ∞ 0BGU/XGU 0 3.2 ∞BGU/CMC 0 58 9.4BGU/AVIU 0 ∞ 25在下列表中可以看到对AZCL底物确定的底物特异性的结果酶EGIIEGIIIEGIVHE-纤维素 1％ 100％100％β—葡聚糖0％ 36％ 56％木葡聚糖 100％ 33％ 1％Curdlan 0％ 2％ 4％从该特异性结果看出，与EGIII和EGIV相比，EGII对木葡聚糖是极特异性的。EGIII对所有类型的底物均有活性而EGIV不能降解木葡聚糖，并且对β—葡聚糖非常特异性。(用还原糖和AZCL底物得到的结果中，有一些差异。对此的解释是，某些AZCL底物比其它的更敏感。AZCL—HE—纤维素似乎比AZCL—β—葡聚糖更敏感)。
按上文材料和方法部分的描述确定EGII和EGIII的Km和特异活性。从下列表中清楚地看出，从线性回归分析得到的对1/Vmax和Km/Vmax的标准误差计算酶的截距。
酶底物Km 特异活性r20/0 底物单位/mgEGII 木葡聚糖0.242-0.306106-1190.98EGIIIβ—葡聚糖 0.136-0.207165-1860.98最佳温度值和温度/PH稳定性EGII和EGIII有相似的最佳温度值(最佳活性在30℃和60℃之间)和温度稳定性(高达60℃时稳定1小时)但EGIII在高PH对EGII更稳定。
可证实底物特异性的凝胶过滤色谱表明EGII将木葡聚糖完全降解成已知是木葡聚糖重复II单位(Fry.1989)的约7-9残基的低聚物。EGIII降解木葡聚糖的程度很低，而EGIV根木不降解木葡聚糖。EGIII对β—葡聚糖的降解程度大，降解成DP 3-4及更高的低聚物。这与β—葡聚糖由经单个β—1.3键间隔的一排3-4个β—1.3键连接的葡萄糖单位组成相一致。这些结果表明，与DNA序列的部分同源性无关，这三种内葡聚糖酶在底物特异性以及最佳PH值和稳定性方面有明显的不同。参考文献Aviv， H.& Leder，P.1972.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.691408-1412.Becker，D.M.& Guarante，L.1991.Methods Enzymol.194182-187.Chirgwin，J.M.，Przybyla，A.E.，MacDonald，R.J.& Rutter，W.J.1979.Biochemistry 185294-5299.Gubler，U.& Hoffman，B.J.1983.Gene 25263-269.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.& Maniatis，T.1989.MolecularCloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor，NY.Sanger，F.，Nicklen，S.& Coulson，A.R.1977.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463-5467.McDougall，G.J，and Fry，S.C，J.Plant Physiol.，1991，Vol.137332-336.Beldman，M.F.G.et al.，Eur.J.Biochem.，1985，Vol.146301-308.Hayashi，T.et al.，Plant Physiol.，1984，Vol.75605-610.Nishitani，K.and Tominaga，R，The Journal of Biol.Chemstry，1992，Vol.267，No.2921058-21064.Fry，S.et al.，Biochem.J.，1992，Vol.282821-828.Fry，S.，Journal of Experimental Botany，1989，Vol.40，No.2101-11.Christgau，S.，et al.，1991，″Pancreatic β-cells express twoautoantigenic forms of glutamic acid decarboxylase，a 65kDahydrophilic form and a 64kDa amphiphilic form which can be bothmembrane-bound and soluble.″ .J.Biol.Chem.，266，p.21157-212664.Laemmli，U.K.，1970，″Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head of bacteriophage T4″.，Nature，227，p.680-685.Sharma，S.et al.，1991，″Physical characterization of isozymesof endo-β-l，4-glucanase and β-l，4-glucosidase from Aspergillusspecies″，FEMS Microbiology Letters 7999-104.Ooi，T.et al.，1990，″Complete nucleotide sequence of a genecoding for Aspergillus aculeatus cellulase (FI-CMCase)″，Nucleic Acids Research，Vol.18，No.195884.Gilkes，N.R.et al.，″Domains in Microbial β-1，4-GlycanasesSequence Conservation，Function，and Enzyme Families″，Microbiological Reviews，1991，Vol. 55，No. 2303-315.
序列目录(1)一般资料(i)申请人(A)姓名Novo DorDisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)国家丹麦(F)邮政编码(zIP)DK—2880(G)电话+45 44448888(H)传真+4544493265(I)电传37304(ii)发明题目棘孢曲霉内葡聚糖酶(iii)序列数19(iv)计算机可读形式(A)介质类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PCDOS/MS DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型CDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(A)生物棘孢曲霉(C)个体分离物CBS 101.43(XI)序列描述SEQID NO1ATTCATTTGT GGACAGTGGA C(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型CDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO2GTTGATCGCA CATTGAACCA(2)SEQID NO3的资料(i)序列特征
(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拍扑结构线性(ii)分子类型CDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO3ACCCCAGCCG ACCGATTGTC(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型CDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ IDNO4CTTCCTTACC TCACCATCAT(2)SEQID NO5的资料(i)序列特征
(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO5TTAACATCTT TTCACCATGA(2)SEQID NO6的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型CDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO6AGCTTTCCCT TCTCTCCCTT(2)SEQID NO7的资料(i)序列特征
(A)长度28bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型CDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCACCCTGG CTTCCGCTGC CAGCCTCC(2)SEQID NO8的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO8GACAGTAGCA ATCCAGCATT(2)SEQID NO9的资料(i)序列特征
(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO9AGCATCAGCC GCTTTGTACA(2)SEQID NO10的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO10CCATGAACTTCACCGTATTG(2)SEQID NO11的资料(i)序列特征
(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO11GCACTGCTTC TCTCCCAGGT(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO12GTGGGCGGCC CCTCAGGCAA(2)SEQID NO13的资料(i)序列特征
(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO13ACGCTCCTCC AATTTTCTCT(2)SEQID NO14的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO14GGCTTGGTAG TAATGAGTCT(2)SEQID NO15的资料(i)序列特征
(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO15GGCGCAGAGT TTGGCCAGGC(2)SEQ ID NO16的资料(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO16GAACATCCCC GGTGTTCTGGG(2)SEQID NO17的资料(i)序列特征
(A)长度347bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO17AAAGATTCAT TTGTGGACAG TGGACGTTGA TCGCACATTG AACCAACCCC AGCCGACCGATTGTCCTTCC TTACCTCACC ATCATTTAAC ATCTTTTCAC CATGAAGCTT TCCCTTCTCTCCCTTGCCAC CCTGGCTTCC GCTGCCAGCC TCCAGCGCCG CACACTTCTG CGGTCAGTGGGATACCGCCA CCGCCGGTGA CTTCACCCTG TACAACGACC TTTGGGGCGA GACGGCCGGCACCGGCTCCC AGTGCACTGG AGTCGACTCC TACAGCGGCG ACACCATCGC TTGTCACACCAGCAGGTCCT GGTCGGAGTA GCAGCAGCGT CAAGAGCTAT GCCAACG(2)SEQ ID NO18的资料(i)序列特征(A)长度294bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无
(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQID NO18CAGCATCTCC ATTGAGTAAT CACGTTGGTG TTCGGTGGCC CGCCGTGTTG CGTGGCGGAGGCTGCCGGGA GACGGGTGGG GATGGTGGTG GGAGAGAATG TAGGGCGCCG TGTTTCAGTCCCTAGGCAGG ATACCGGAAA ACCGTGTGGT AGGAGGTTTA TAGGTTTCCA GGAGACGCTGTATAGGGGAT AAATGAGATT GAATGGTGGC CACACTCAAA CCAACCAGGT CCTGTACATACAATGCATAT ACCAATTATA CCTACCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA(2)SEQID NO19的资料(i)序列特征(A)长度181bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iii)反义无(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO19GACAGTAGCA ATCCAGCATT AGCATCAGCC GCTTTGTACA CCATGAAGTT CACCGTATTGGCACTGCTTC TCTCCCAGGT GTGGGCGGCC CCTCAGGCAA ACGCTCCTCC AATTTTCTCTGGCTTGGTAG TAATGAGTCT GGCGCAGAGT TTGGCCAGGC CAACATCCCC GGTGTTCTGGG
权利要求
1.一种表达内葡聚糖酶活性的酶，所述酶由含有至少一个下列部分序列的DNA序列编码(a) ATTCATTTGTG GACAGTGGAC (SEQ ID NO 1)(b) GTTGATCGCA CATTGAACCA (SEQ ID NO 2)(c) ACCCCAGCCG ACCGATTGTC (SEQ ID NO 3)(d) CTTCCTTACC TCACCATCAT (SEQ ID NO 4)(e) TTAACATCTT TTCACCATGA (SEQ ID NO 5)(f) AGCTTTCCCT TCTCTCCCTT (SEQ ID NO 6)(g) GCCACCCTGG CTTCCGCTGC CAGCCTCC (SEQ ID NO 7)(h) GACAGTAGCA ATCCAGCATT (SEQ ID NO 8)(i) AGCATCAGCC GCTTTGTACA (SEQ ID NO 9)(j) CCATGAAGTT CACCGTATTG (SEQ ID NO 10)(k) GCACTGCTTC TCTCCCAGGT (SEQ ID NO 11)(1) GTGGGCGGCC CCTCAGGCAA (SEQ ID NO 12)(m) ACGCTCCTCC AATTTTCTCT (SEQ ID NO 13)(n) GGCTTGGTAG TAATGAGTCT (SEQ ID NO 14)(o) GGCGCAGAGT TTGGCCAGGC (SEQ ID NO 15)(p) CAACATCCCC GGTGTTCTGGG (SEQ ID NO 16)
2.一种表达内葡聚糖酶活性的酶，所述酶i)由含有或包括于至少一个下列部分序列的DNA序列编码AAAGATTCATTTGTGGACAGTGGACGTTGATCGCACATTGAACCAACCCCAGCCGACCGATT-GTCCTTCCTTACCTCACCATCATTTAACATCTTTTCACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCCGCTGCCAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACCGCCGGTGACTTCACCCTGTACAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGGCACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGGCGACACCATCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAAGAGCTATGCCAACG (SEQ ID NO17) orCAGCATCTCCATTGAGTAATCACGTTGGTGTTCGGTGGCCCGCCGTGTTGCGTGGCGGAGGCTGCCGGGAGACGGGTGGGGATGGTGGTGGGAGAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACCGGAAAACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGGGATAAATGAGATTGAATGGTGGCCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGTACATACAATGCATATACCAATTATACCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO18)或一种与同源且编码一种具有内葡聚糖活性的多肽的序列，和/或(ii)与抗体有免疫反应性，所述抗体抗具有上述i)中所定义特性并得自棘孢曲霉CBS 101.43的纯化内葡聚糖酶和/或(iii)是木葡聚糖特异性的。
3.根据权利要求2的酶，按在酶与有关底物培养期间所释放的还原糖为基础确定的，所述酶对木葡聚糖的活性比对羧甲基纤维素，β—葡聚糖或Avicell的活性高至少50倍。
4.根据权利要求2或3的酶，它基本没有对β—葡聚糖的活性和/或基本没有转移酶活性。
5.根据权利要求2—4的酶，它对羧甲基纤维素和/或Avicell的活性最多为3％。
6.一种表达内葡聚糖酶活性的酶，该酶iv)由含有或包括于下列部分序列的DNA序列编码GACAGTAGCAATCCAGCATTAGCATCAGCCGCTTTGTACACCATGAAGTTCACCGTATTGGCACTGCTTCTCTCCCAGGTGTGGGCGGCCCCTCAGGCAAACGCTCCTCCAATTTTCTCTGGCTTGGTAGTAATGAGTCTGGCGCAGAGTTTGGCCAGGCCAACATCCCCGGTGTTCTGGG (SEQ ID NO19)或与编码具有内葡聚糖酶活性的多肽的序列同源和/或V)与抗体有免疫反应性，所述抗体抗具有iv)中所定义特性并得自棘孢曲霉CBS101.43的纯化内葡聚糖酶。
7.根据权利要求6的酶，它基本没有对木葡聚糖酶的活性。
8.根据权利要求1—7的任一酶，它可以从微生物中得到。
9.根据权利要求8的酶，它可从丝状真菌或酵母中得到。
10.根据权利要求9的酶，它是从曲霉属，木霉属，青霉属，镰孢属，地霉属(Geotricum)或腐质霉属的菌株中得到。
11.根据权利要求10的酶，其中所述酶得自曲霉的菌株，特别是棘孢曲霉，黑曲霉或米曲霉的菌株。
12.根据权利要求11的酶，它由从棘孢曲霉CBS101.43的DNA文库中分离的DNA序列编码。
13.编码权利要求1—12任一酶的DNA构建体。
14.含有编码权利要求1—12任一酶的DNA序列的重组表达载体。
15.含有权利要求14重组表达载体的细胞。
16.根据权利要求15的细胞，它是真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母或丝状真菌细胞。
17.根据权利要求16的细胞，其中，所述细胞属于曲霉属的菌株，特别是黑曲霉或米曲霉的菌株。
18.生产达内葡聚糖酶活性的酶的方法，该方法包括在允许所述酶生产的条件下，培养权利要求15—17任一细胞，并从培养物中回收酶。
19.一种用于降解植物胞壁组分的酶制品，所述制品是由权利要求1—12任一表达内葡聚糖活性的酶富集的。
20.根据权利要求19的制品，它还含有半乳聚糖酶，木聚糖酶，阿拉伯聚糖酶，果胶乙酰基酯酶，聚半乳醛糖酶，鼠李半乳醛糖酶，果胶解裂酶，果胶酸盐裂解酶或果胶甲基酯酶。
21.权利要求1—12任一酶或权利要求19或20的酶制品的用途，作为降解或改变纤维素的试剂。
22.根据权利要求21的用途，作为降解或改变植物细胞壁的试剂。
23.根据权利要求21或22的用途，用于葡萄酒或果汁的制备，果胶纯化，啤酒酿造过程或饲料的制备。
全文摘要
一种表现内葡聚糖酶活性的酶，该酶由含有至少一个下列部分序列的DNA序列编码(a)ATTCATTTGTG GACAGTGGAC(b)GTTGATCGCA CATTGAACCA(c)ACCCCAGCCG ACCGATTGTC(d)CTTCCTTACC TCACCATCAT(e)TTAACATCTT TTCACCATGA(f)AGCTTTCCCT TCTCTCCCTT(g)GCCACCCTGG CTTCCGCTGCCAGCCTCC(h)GACAGTAGCA ATCCAGCATT(i)AGCATCAGCC GCTTTGTACA(j)CCATGAAGTT CACCGTATTG(k)GCACTGCTTC TCTCCCAGGT(l)GTGGGCGGCC CCTCAGGCAA(m)ACGCTCCTCC AATTTTCTCT(n)GGCTTGGTAG TAATGAGTCT(o)GGCGCAGAGT TTGGCCAGGC(p)CAACATCCCC GGTGTTCTGGG可以通过重组技术生产该酶并可用于降解植物细胞壁。
文档编号C12N1/15GK1114356SQ9410900
公开日1996年1月3日 申请日期1994年6月22日 优先权日1992年12月23日
发明者H·达尔伯格, L·N·安德森, L·V·考夫德, M·S·卡比南, S·克里斯格 申请人:诺沃挪第克公司