用截短的纤维素酶组合物处理含纤维素的织物的方法和组合物的制作方法

专利名称：用截短的纤维素酶组合物处理含纤维素的织物的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用纤维素酶处理含棉织物和不含棉纤维素织物的改进方法以及通过这些方法产生的织物。具体来说，本发明的改进方法涉及使含棉织物和不含棉纤维素织物与包含纤维素酶的组合物的水溶液接触，该组合物包含一种或多种截短的纤维素酶。
现有技术状况在制造期间或制造之后的短时间内，含棉织物可用纤维素酶处理以赋予织物合乎需要的性质。例如，在纺织工业中，纤维素酶用于改进含棉织物的手感和/或外观、从含棉编织表面除去纤维、赋予含棉斜纹粗棉布等石头洗涤的(stone washed)外观。
尤其是，日本专利申请58-36217和58-54032、Ohishi等的“通过纤维素酶改善棉织物”以及JTN 1988年12月杂志文章“新消息—减轻处理以软化棉织物的手感”都公开了含棉织物用纤维素酶处理导致织物改进的手感。通常认为这种纤维素酶处理除去降低织物重量的棉细毛和/或表面纤维。这些影响的组合赋予织物改进的手感。
另外，迄今在本领域中已知可在搅拌和回落(cascading)条件下用纤维素酶溶液处理含棉编织织物，例如，通过使用喷射，其目的在于除去在这些编织的织物中常见的碎纤维和线。
从纤维素织物制作的服装，如棉斜纹粗棉布，由于用于使服装制品的制造、处理、装配容易并典型地具有新鲜的黑色染色外观的定型组合物的存在而纹理僵硬。靛染色的斜纹粗棉布的一个合乎需要的特征是染色线变更为白线，这使斜纹粗棉布表现出蓝底白色。
在长期的穿着和洗衣之后，服装制品，具体来说是斜纹粗棉布，可在服装面料和接缝上、以减轻的形式变化定位的区、在颜色的深度或密度上变化。此外，衣服通常的褪色、接缝中一些皱折、在织物面料上一些褶皱经常出现。另外，在洗衣之后，从织物中实质上除去定型物，这导致更柔软的手感。在最近的几年中，这样的穷困的(distressed)或“石头洗涤的(stonewashed)”外观，尤其是在斜纹粗棉布服装中，对大多数公众变得十分合乎需要。
先前用于产生穷困的外观的方法包括服装制品或制品的石头洗涤(stonewashing)在具有大约1至10英寸颗粒大小的浮石(pumice)和具有由于加工的磨损性质产生的更小的浮石颗粒的大盆中。典型地，当服装湿到足够的时期时，使服装制品和浮石滚翻以使浮石磨损织物以在织物面料中产生更淡颜色的定位的织物磨损区和在接缝中类似的减轻区。另外，浮石软化织物，并产生类似于织物大范围的磨损和洗衣产生的有微毛的表面。这种方法产生了上述的合乎需要的蓝底白色。
使用浮石有几个缺点，包括对发动机的过载破坏、对运输机制和洗涤转筒的机械破坏、从摩擦产生的环境废物问题、与手工从服装口袋除去石头有关的工作开支。
对于在石头洗涤中与浮石相关的问题，在搅拌和回落的条件下，即在旋转式转筒洗涤机中，纤维素酶溶液用于代替浮石，以赋予斜纹粗棉布“石头洗涤的”的外观(美国专利4,832,864)。
纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-D-葡聚糖键)并产生作为主要产物的葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。纤维素酶可由许多微生物产生，包括几种不同的酶类别，这些类别包括那些鉴别为外纤维二糖水解酶(CBH)、内葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)的酶(Schulein，M，1988，酶学方法235-242)。
在这些类别之内，酶可分成单个组分。例如，由丝状真菌Trichodermalongibrachiatum(下面作为T.longibrachiatum)产生的纤维素酶由至少两个CBH组分(即CBHI和CBHII)、至少四个EG组分(即EGI、EGII、EGIII和EGV，Saloheimo，A.等，1993，对Trichoderma reesei纤维素酶和其它水解酶的第二次TRICEL专题研讨会论文集，Espoo，芬兰，Suominen和T.Reinikainen.生物技术和工业发酵研究的基础139-146)和至少一个β-葡糖苷酶组成。编码这些组分基因就分别是cbh1、cbh2、eqrl1、eql2、eql3和eql5。
包含CBH、EG和BG组分的全纤维素酶系统协同作用以把结晶状的纤维素转化为葡萄糖。两个外纤维二糖水解酶和四个目前已知的内葡聚糖酶相互作用以把纤维素水解成细胞低聚糖。低聚糖(主要是纤维二糖)随后通过主要的β-葡糖苷酶水解成葡萄糖(可能有来自次要的β-葡糖苷酶组分的另外的水解)。
得自木霉属的一个种的微生物和其它真菌来源的全纤维素酶组合物用于石头洗涤染色斜纹粗棉布的一个问题是在石头洗涤过程期间不能完全除去由于再沉积(redesposition)引起的着色剂或一些染料回到布上的回染(backstaining)。在斜纹粗棉布织物的情况下，这造成蓝线的再着色和白线的蓝着色，导致蓝线、白线和磨损点之间反差更小(即蓝底蓝色而非优选的蓝底白色)。参见，美国染料报道，1990年9月，24-28。某些用户讨厌再沉积。
尽管木霉属纤维素酶导致回染，但因为它们在斜纹粗棉布材料上更高的活性仍是优选的。此外，有更高纯度的纤维素酶在本发明中是有利的。高特异性活性或高水平的纯度导致在明显更短的处理时间内更高度的磨损，因而对斜纹粗棉布处理机是优选的。
减少染料再沉积的量的尝试包括把额外的化学药品或酶(如表面活化剂、蛋白酶或其它试剂)添加进纤维素酶洗剂中以帮助疏散松驰的染料。此外，处理机使用活性更小的全纤维素酶和额外的洗液。然而，这导致附加的化学物质开支和更长的处理时间。另一个方法包括在过程中使用温和的漂白剂去污剂。该方法影响衣服的最终色光(shade)并增加处理时间。最后，酶和石头一起使用可使处理机解决单独使用石头造成的所有问题。因此，找到一种用纤维素酶防止石头洗涤期间着色剂再沉积是合乎需要的。
纤维二糖水解酶(CBHI和CBHII)和Trichoderma longibrachiatum的主要的内葡聚糖酶(EGI和EGII)的蛋白质分析表明双功能组织以通过富含脯氨酸和氢氧基氨基酸的接头或灵活的铰链段氨基酸分离的催化核心结构域和更小的纤维素结合结构域的形式存在。从Trichodermalongibrachiatum分离了两个纤维二糖水解酶的基因，CBHI和CBHII(Shoemaker，S等1983，生物技术，1，691-696，Teeri，T等，1983，生物技术，1，696-699和Teeri，T.等，1987，基因，51，43-52)和两个主要的内葡聚糖酶，EGI和EGII(Penttila，M.等，1986，基因，253-263，Van Arsdell，J.N/等，1987，生物技术，5，60-64和Saloheimo，M.等，1988，基因，63，11-21)并确认了蛋白质结构域结构。
类似的纤维素酶双功能组织在细菌纤维素酶中也有发现。对粪肥纤维单胞菌的内葡聚糖酶A(C.fimi Cen A)的纤维素结合结构域(CBD)和催化核心广泛地进行了研究(OngE.等，1989，生物技术趋势，7239-243，Pilz等，生物化学杂志，271277-280，Warren等，1987，蛋白质，1335-341)。克隆了编码CBD和具有接头的CBD的基因片段并在大肠杆菌中表达，显示出对纤维素纤维具有新的活性(Gilkes，N.R.等，1991，微生物学回顾，55305-315和Din，N等，1991，生物技术，91096-1099)。例如，从在大肠杆菌中遗传表达的粪肥纤维单胞菌Cen A分离的CBD破坏纤维素纤维的结构并释放出小颗粒，但没有可检测的水解活性。CBD在蛋白质纯化和酶的固化中还具有广阔的应用。另一方面，分离自蛋白酶裂解的纤维素酶的粪肥纤维单胞菌Cen A的催化结构域不破坏纤维素的原纤维结构，而使纤维的表面光滑。
蛋白水解分离并纯化了Trichoderma longibrachiatum CBHI核心结构域，但通过这种生物化学方法仅有毫克数量分离(Offord D.等，1991，应用生物化学和生物技术，28/29377-386)。然而，对生物化学蛋白水解之后分离自Trichoderma longibrachiatum的CBHI、CBHII、EGI和EGII的核心和结合结构域进行了类似的研究，只回收足够结构和功能分析的蛋白质(Tomme，P等，1988，欧洲生物化学杂志，170575-581和Ajo，S，1991，FEBS，29145-49)。因此，现有技术不能认识到在纺织品加工中当使用纤维素酶核心结构域或纤维素结合结构域区时改进是可能的。
发明概述本发明的目的是提供一种处理含纤维素的织物的方法，该方法导致与现有技术方法处理相当的织物磨损(abrasion)水平而同时降低染料再沉积(redeposition)。
本发明的另一个目的是提供具有与现有技术的去垢组合物相当的织物磨损水平而同时降低染料再沉积性质的去垢组合物。
本发明的另一个目的是提供具有与现有技术的石头(stonewashing)洗涤组合物相当的织物磨损水平而同时降低染料再沉积性质的石头洗涤组合物。
本发明提供了一种用纤维素酶处理含纤维素的织物的方法，该方法包括以下步骤(a)把所说的含纤维素的织物和包含有效量的截短的纤维素酶、其衍生物或无纤维素结合结构域的天然产生的纤维素酶的处理组合物相接触；(b)在有效地处理所说的织物的温度下，温育与所说的截短的纤维素酶或其衍生物或无纤维素结合织物域的天然产生的纤维素酶接触的所说的含纤维素的织物一段时间。本发明也提供了包含截短的纤维素酶的处理含纤维素的织物的组合物。在一个优选的实施方案中，处理方法包括洗衣或石头洗涤。截短的酶也优选地包含截短的纤维素酶核心(core)。截短的纤维素酶核心最优选地包括EGI核心、EGII核心、CBHI核心或CBHII核心。此外，纤维素酶优选地是以大约0.1至1,000ppm的浓度存在，最优选地是从大约0.5至大约250ppm。
按照本发明的一个优选的实施方案提供了包含截短的纤维素酶的去垢剂或石头洗涤组合物。由于按照本发明的截短的纤维素酶组合物的另人惊奇的降低的再沉积活性，含纤维素的织物在用包含截短的酶的合适的组合物清洁或石头洗涤时提高到一个另人惊奇的程度。
本发明的一个优点是包含单独或与其它截短的纤维素酶核心或非截短的纤维素酶组合的截短的纤维素酶核心酶的纤维素酶组合物，该组合物可赋予含纤维素的织物合乎需要的质量。
附图简要描述

图1(a)-1(b)描述了来源于Trichoderma longibrachiatum的CBHI的基因组DNA和氨基酸序列。信号序列始于碱基对210，结束于碱基对260(SEQID No.25)。催化核心结构域始于第一外显子的碱基对261到碱基对671，第二外显子的碱基对739到碱基对1434，第三外显子的碱基对1498到碱基对713(SEQ ID No.9)。接头序列始于碱基对714，结束于碱基对1785(SEQID No.17)。纤维素结合结构域始于碱基对1786，结束于碱基对1888(SEQID No.1)。SEQ ID No.26、10、18和2分别代表CBHI信号序列、催化核心结构域、接头区和结合结构域的氨基酸序列。
图2(a)-2(b)描述了来源于Trichoderma longibrachiatum的CBHII的基因组DNA和氨基酸序列。信号序列始于碱基对614，结束于碱基对685(SEQID No.27)。纤维素结合结构域始于第一外显子的碱基对686到碱基对707，第二外显子的碱基对755到碱基对851(SEQ ID No.3)。接头序列始于碱基对852，结束于碱基对980(SEQ ID No.19)。催化核心始于第二外显子的碱基对981到碱基对1411，第三外显子的碱基对1199到碱基对1445，第四外显子的碱基对1536到碱基对2221(SEQ ID No.11)。SEQ ID No.28、4、20和12分别代表CBHII信号序列、结合结构域、接头区和催化核心结构域的氨基酸序列。
图3描述EGI的基因组DNA和氨基酸序列。信号序列始于碱基对113，结束于碱基对178(SEQ ID No.29)。催化核心结构域始于第一外显子的碱基对179到碱基对882，第二外显子的碱基对963到碱基对1379(SEQ IDNo.13)。接头区始于碱基对1460，结束于碱基对1380(SEQ ID No.21)。纤维素结合结构域始于碱基对1461，结束于碱基对1616(SEQ ID No.5)。SEQ ID No.30、14、22和6分别代表EGI信号序列、催化核心结构域、接头区和结合结构域的氨基酸序列。
图4描述了EGII的基因组DNA和氨基酸序列。信号序列始于碱基对262，结束于碱基对324(SEQ ID No.31)。纤维素结合结构域始于碱基对325，结束于碱基对432(SEQ ID No.7)。接头区始于碱基对433，结束于碱基对534(SEQ ID No.23)。催化核心结构域始于第一外显子的碱基对535到碱基对590，第二外显子的碱基对765到碱基对1689(SEQ ID No.15)。SEQ ID No.32、8、24和16分别代表EGII信号序列、结合结构域、接头区和催化核心结构域的氨基酸序列。
图5描述了EGIII的基因组DNA和氨基酸序列。信号序列始于碱基对151，结束于碱基对198(SEQ ID No.35)。催化核心结构域始于第一外显子的碱基对199到碱基对557，第二外显子的碱基对613到碱基对883，第三外显子的碱基对900到碱基对973(SEQ ID No.33)。SEQ ID No.36和34分别代表EGIII的信号序列和催化核心结构域。
图6图解说明了EGI核心结构域表达载体的构建(SEQ ID No.37)。
图7描述了表达载体pTEX(SEQ ID No.39-41)的构建。
图8是CBHI核心结构域表达载体(SEQ ID No.38)构建的图解。
图9是CBHII核心结构域表达载体构建的图解。
图10图解说明了获得的磨损/再沉积结果，该图比较了EGI与EGI核心，EGII和EGI核心。
图11图解说明了当加入CBHI核心时，EGIII处理的斜纹粗棉布的磨损/再沉积效果的改善。
发明详述I.定义“含棉织物”指制自纯棉或棉混和物的缝纫的或未缝纫的织物，这些织物包括棉编织织物、棉编织物、棉斜纹粗棉布、棉纱线等。使用棉混合物时，在织物中棉的量至少应该是大约40％的棉(重量比)；优选地是大于大约60％的棉(重量比)；最优选地是大于大约75％的棉(重量比)。使用混合物时，用于织物中的辅助材料可包括一种或多种包含合成纤维的非棉纤维，其中合成纤维如聚酰胺纤维(例如尼龙6和尼龙66)、丙烯酸纤维(例如聚丙烯腈纤维)、聚酯纤维(例如聚乙烯对苯二酸酯)、聚乙烯醇纤维(例如维尼纶)、聚氯乙烯纤维、聚亚乙烯基氯化物纤维、聚氨基甲酸酯纤维、聚脲纤维和aramid纤维。
“含纤维素的织物”指任何含纤维素的棉或非棉织物或含纤维素混合物的棉或非棉织物，包括天然的和人造纤维素的(如黄麻，亚麻、ramie、人造丝、TENCEL)。包括在人造的含纤维素的织物的标题下的是本领域熟知的再生织物，如人造丝。其它人造的含纤维素的织物包括化学修饰的纤维素纤维(如通过醋酸盐衍生的纤维素)和溶剂结网(spun)的纤维素纤维(如lyocell)。当然，包括在含纤维素的织物的定义之内的是任何由这样的材料制造的衣服或纱线。同样地，“含纤维素的织物”包括由这样的材料制造的纺织品纤维。
“处理组合物”指包含可用于处理含纤维素的织物的截短的纤维素酶组分的组合物。这样的处理包括但不限于含纤维素的织物的石头洗涤、改进纹理、手感和/或外观，或在含纤维素的织物制造期间使用的其它技术。另外，在本发明内的处理指从纤维素的织物或纤维中除去“死棉”(即比成熟棉显著不定形的未成熟棉)。死棉已知可造成不均衡的染色。另外，“处理组合物”指包含用于洗涤脏的制造的含纤维素的织物的截短的纤维素酶组分。例如，截短的纤维素酶可用于洗衣去垢组合物。按照本发明的有用的去垢组合物包括特异性的制剂，如预洗涤剂、预浸渍剂和家用颜色恢复(restoration)组合物。处理组合物可以是稀释的浓缩物形式、稀释液形式或可直接运用于含纤维素的织物的形式。
申请人现在认为纤维素酶对含纤维素的织物的作用模式在是否用作制造期间或脏的制造的含纤维素的织物洗衣期间的石头洗涤组合物没有显著不同。这样，在掺入纤维素酶的去垢剂和制造业过程中可获得通过某些纤维素酶或纤维素酶混合物赋予的改进性质如磨损、染料的再沉积、强度减小、改进的手感。当然，由于和各自的组合物有关的应用不同，用于纤维素酶的各种纺织品应用的特异性组合物的制剂(例如，石头洗涤或洗衣去垢剂或预浸渍剂)可以是不同的，本文指出了这一点。然而，通过加入纤维素酶组合物引起的改进通常和各种纺织品应用的每一种是一致的。
“石头洗涤组合物”指用于石头洗涤含纤维素的织物的制剂。石头洗涤组合物在提供给消费者之前(即在制造过程中)改进含纤维素的织物，它与旨在清洁脏衣服的去垢组合物形成对比。
“石头洗涤”指在搅拌和回落的条件下(即在一台旋转式转筒洗涤机中)用纤维素酶溶液处理染色的含纤维素的织物，它赋予斜纹粗棉布“石头洗涤的”外观。用于赋予斜纹粗棉布石头洗涤的外观的方法在美国专利4,832,864中描述。本文一并参考了其全部。通常，石头洗涤技术运用于染色的斜纹粗棉布。
“去垢组合物”指打算在用于脏的含纤维素的织物洗涤的洗涤介质中使用的混合物。在本发明中，这样的组合物除了纤维素酶和表面活化剂之外可以包括许多添加剂(包括但不限于，另外的水解酶、增强去垢剂去垢作用的物质、漂白剂、发蓝剂)，它可以包括荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、纤维素酶活化剂、抗氧剂、加溶剂。这样的组合物通常用于清洗脏衣服，而不在制造过程中使用，这与石头洗涤组合物相对照。
“再沉积纤维素酶”指这样的纤维素酶，它在使用纤维素酶溶液对含纤维素的织物(具体来说是斜纹粗棉布)酶促石头洗涤或其它处理中，导致染料在底物上再沉积。这种效果常称为回染。这样的织物的回染导致不完全的石头洗涤，因为代替所需的蓝底白色，再沉积导致蓝底蓝色。再沉积纤维素酶包括那些来源于微生物(如真菌微生物木霉属的一个种等)的纤维素酶。具体来说，已知EGI、EGII、CBHI和CBHII在它们的非截短的状态下表现出明显的再沉积行为。
“表面活性剂或表面活化剂”指熟知的用于垢剂组合物的阴离子的、非离子的和两性表面活性剂。
“洗涤介质”是通过把所需量的去垢组合物添加到水中制备的含水洗涤溶液。洗涤介质一般包清洁有效量的去垢剂。
“纤维素分解酶”或“纤维素酶”指真菌外葡聚糖酶或外纤维二糖水解酶、内葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用把纤维素及其衍生物转化为葡萄糖。编码Trichoderma longibrachiatum的CBHI、CBHII、EGI、EGII和EGV的基因分析显示包含催化核心区或结构域(CCD)、铰链或接头区(本文可互换使用)和纤维素结合区或结构域(CBD)。
天然产生来源的纤维素酶组合物和包括一种或多种纤维二糖水解酶类型和内葡聚糖酶类型组分(发现其中每一种组分通过其来源按比例产生)的纤维素酶有时称为“完全纤维素酶系统”或“完全纤维素酶组合物”以区别于从其中分离的纤维素酶的类别和组分，而且区别于由细菌和某些真菌产生的不完全纤维素酶组合物、从微生物获得的纤维素酶组合物(其中微生物被遗传改良以过量生产、生产供不应求或不生产纤维素酶的一种或多种纤维二糖水解酶和/或内葡聚糖酶类型的组分)或截短的纤维素酶组合物(如本文所定义的)。
本发明具体地涉及包含本文所定义的结合核心和结合结构域区的纤维素酶的适用性。例如，已知得自细菌高温单孢菌属的一个种、纤维单胞菌属的一个种、芽孢杆菌属的一个种、假单胞菌属的一个种、链霉菌属的一个种的纤维素酶具有结合结构域区和核心区。
在本发明中优选使用的是真菌纤维素酶。最优选地是源于木霉属一个种(Trichoderma sp.)(包括Trichoderma longibrachiatum、绿色木霉、康宁木霉)、青霉属的一个种、腐质霉属的一个种(包括Humicola insolens)、曲霉属的一个种和Fumarium的一个种的真菌纤维素酶。本文中所用的术语“木霉属”或“木霉属的一个种”指先前被分类为木霉属或目前分类为木霉属的任何真菌菌株。最优选地是源于Trichoderma longibrachiatum或绿色木霉的纤维素酶。
“真菌纤维素酶”指源于真菌来源或微生物(遗传改良以掺入并表达从真菌来源获得的纤维素酶基因的全部或一部分)的酶组合物。能产生用于制备本文所述的纤维素酶组合物的纤维素酶的真菌在英国专利2094826A中公开，本文一并参考了其说明书。
虽然已知某些真菌纤维素酶在中性和微碱性条件下具有明显的活性(即，例如，来源于Humicola insolens的纤维素酶)，在酸性或中性pH值范围内，大多数真菌纤维素酶通常具有它们的最优活性。
已知真菌纤维素酶由几个具有不同底物特异性、酶促作用模式等的酶类别组成。另外，在每种类别之内的酶组分可表现出不同的分子量、不同的糖基化程度、不同的等电点、不同的底物特异性等等。例如，真菌纤维素酶可包含这样的纤维素酶类别，该酶类别包括内葡聚糖酶型组分(下文的“EG-型”)、外纤维二糖水解酶型组分(下文的“CBH-型”)、β-葡糖苷酶型组分(下文的“BG-型”)等等。另一方面，在文献中报道细菌纤维素酶包含极少或没有CBH-型组分，而在某些情况下报道衍生细菌纤维素酶的CBH-型组分具有外纤维二糖水解酶活性。
培养真菌和产生纤维素酶的发酵过程在本领域中本来是已知的。例如，纤维素酶系统可通过固相或深层培养(包括分批、补料分批和连续流动方法)产生。发酵肉汤中纤维素酶系统的收集和纯化也可通过本领域本来已知的方法进行。
“内葡聚糖酶-型组分”或“EG-型”指真菌纤维素酶组分或组分的组合，这些组分表现出类似于Trichoderma longibrachiatum(以前分类为Trichoderma reesei)的内葡聚糖酶组分的纺织品活性性质。在这一点上，已知当Trichoderma longibrachiatum的内葡聚糖酶组分(例如，EGI、EGII、EGIII和EGV单独或其组合)掺入进纺织品处理培养基并且用这种培养基处理织物时，这些组分赋予改进的手感、改进的外观、软化、颜色增强和/或斜纹粗棉布织物的石头洗涤的外观(与处理前的织物相比)。
因此，内葡聚糖酶型组分是这样的纤维素酶组分，这些纤维素酶组分当掺入进纺织品处理培养基并且用这种培养基处理织物时，赋予含纤维素的织物特异性的提高，如改进的手感、改进的外观、软化、颜色增强和/或斜纹粗棉布织物的石头洗涤的外观(与处理前的织物相比)。和类似的纤维素酶组合物但另外包含CBH I型组分处理引起的强度减小相比，某些EG型组分(包括EGI、EGII和EGIII组分)可赋予斜纹粗棉布织物降低的强度减小。
本文定义的内葡聚糖酶型组合物可不包括使用活性试验传统上分类为内葡聚糖酶的组分，活性试验如组分的如下能力(a)水解可溶性纤维素衍生物(如羧甲基纤维素(CMC))，由此降低包含CMC溶液的粘度，(b)易于水解水合物形式的纤维素(如磷酸溶胀纤维素(phosphoric acid swollencellulose)，例如，Walseth纤维素)和不易水解结晶高度结晶形式的纤维素(例如，微晶纤维素、Solkafloc等)。另一方面，人们相信并非通过这样的活性试验定义的所有内葡聚糖酶组分赋予含纤维素的织物一种或多种提高(包括降低的强度减少)。因此，为了本文的目的，定义内葡聚糖酶型组分作为具有如Trichoderma longibrachiatum的内葡聚糖酶组分具有的类似的纺织品改良性质的真菌纤维素酶的组分是适合的。
不同的组分通常具有不同的性质，如等电点、分子量、糖基化程度、底物特异性和酶促作用模式。组分的不同等电点使得其可通过技术(如离子交换色谱)分离。事实上，不同来源的组分的分离在本领域中是已知的。参见，例如，Bjork等，美国专利5,120,463；Schulein等，国际申请WO89/09259；Wood等，纤维素退化的生物化学和遗传学，31-52(1988)；Wood等，碳水化合物研究，190卷，279-297(1989)；Schulein，酶学方法，160卷，234-242(1988)等。本文一并参考了每个参考的全部说明书。
术语“EGI”指典型地来源于木霉属一个种的EGI(或表现出与来源于木霉属一个种的EGI的相同特征)的内葡聚糖酶型组分。这样，EGI指来源于木霉属一个种的内葡聚糖酶，其特征为大约4.0至6.0的最优pH值，大约4.5至4.7的等电点(pI)和大约47至49千道尔顿的分子量。EGI优选地来源于Trichoderma longibrachiatum或绿色木霉。来源于Trichodermalongibrachiatum的EGI具有大约5.0的最优pH值，大约4.7的等电点(pI)和大约47至49千道尔顿的分子量。来源于绿色木霉的EGI纤维素酶具有大约5.0的最优pH值，大约5.3的等电点(pI)和大约50千道尔顿的分子量。
本文定义的术语“EGII”指典型地来源于木霉属一个种的EGII(或表现出与来源于木霉属一个种的EGII相同特征)的内葡聚糖酶型组分。值得注意的是先前某些作者命名的“EGIII”在目前的命名法中使用术语EGII。在任何情况下，本文定义的EGII蛋白质和EGIII蛋白质在其分子量、pI和最优pH上是实质上不同的。术语“EGII纤维素酶”指来源于木霉属几个种的内葡聚糖酶组分，其特征为大约4.0至6.0的最优pH值，大约5.5的等电点(pI)和大约48千道尔顿的分子量。EGI优选地来源于Trichoderma longibrachiatum或绿色木霉。
本文定义的术语“EGIII纤维素酶”指典型地来源于木霉属一个种的EGIII(或表现出与来源于木霉属一个种的EGIII的相同特征)的内葡聚糖酶型组分。这样，EGIII指来源于木霉属几个种的内葡聚糖酶，其特征为大约5.0至7.0的最优pH值，大约7.2至8.0的等电点(pI)和大约23至28千道尔顿的分子量。EGIII纤维素酶优选地来源于Trichodermalongibrachiatum或绿色木霉。来源于Trichoderma longibrachiatum的EGIII纤维素酶具有大约5.5至6.0的最优pH值，大约7.4的等电点(pI)和大约25至28千道尔顿的分子量。来源于绿色木霉的EGIII纤维素酶具有大约5.5的最优pH值，大约7.7的等电点(pI)和大约23.5千道尔顿的分子量。
本文定义的术语“EGV纤维素酶”指典型地来源于木霉属一个种的EGV(或表现出与来源于木霉属一个种的EGV的相同特征)的内葡聚糖酶型组分。这样，EGV指来源于木霉属一个种的内葡聚糖酶，其特征由Saloheimo等描述，分子微生物学，13(2)219-228(1994)描述；第二届TRICELTrichoderma reesei纤维素酶和其它水解酶专题研讨会论文集，Esppo芬兰，1993，ed.P.Suominen和J.T.Reinikainen。生物化学和工业发酵研究的基础，139-146(1993)。
“外纤维二糖水解酶型组分”或“CBH型”指表现出类似于Trichodermalongibrachiatum的CBHI和/或CBHII纤维素酶组分的纺织品活性性质的真菌纤维素酶组分。在这一点上，当在无EG型纤维素酶组分(如前面所定义的)存在的情况下使用时，Trichoderma longibrachiatum的CBHI和CBHII组分单独被认为不赋予在手感中、外观、斜纹粗棉布织物的削弱颜色增强(soften color enhancement)和/或石头洗涤的外观方面的提高。另外，当与一些EG组分结合使用时(以大约2.5∶1的CBHI∶EG组分的比率)，Trichoderma longibrachiatum的CBHI组分不赋予斜纹粗棉布织物增强的强度减小。
因此，CBHI型组分和CBHII型组分指表现出分别类似于Trichodermalongibrachiatum的CBHI和CBHII组分的纺织品活性性质的真菌纤维素酶组分。如上所述，对于CBHI型组分，这包括在EG型组分存在下用CBHI处理的斜纹粗棉布织物的增强的强度减小性质。
本文定义的外纤维二糖水解酶型组分可不包括如用于把CBHI和CBHII从Trichoderma longibrachiatum中区分的活性试验传统上分为外纤维二糖水解酶的组分。例如，外纤维二糖水解酶型组分(a)被纤维二糖竞争性地抑制(Ki大约1mM)；(b)不能把取代的纤维素(如羧甲基纤维素)水解到明显的程度，(c)水解磷酸溶胀纤维素并水解至更低程度的高度结晶纤维素。另一方面，人们相信一些通过活性试验确定为CBH型组分的纤维素酶组分当单独在纤维素酶组合物中使用时，赋予改进的手感、外观、柔软、颜色增强和/或含纤维素的织物的石头洗涤的外观。因此，相信本文使用的定义这样的外纤维二糖水解酶作为EG型组分是更精确，因为这些组分在纺织品用途中具有和Trichoderma longibrachiatum的内葡聚糖酶组分所具有的类似的功能性质。
通常，包含全纤维素酶组合物(“全纤维素酶”)的各组成部分的纤维素酶组合物可基于其已知特征和性质通过纯化技术获得。具体来说，全纤维素酶可通过在文献中出版的认知的分离技术纯化成实质上纯的组分，这些分离技术包括在合适的pH值下的离子交换色谱、亲和色谱、大小排斥等。例如，在离子交换色谱(通常使用阴离子交换色谱)中，通过以pH梯度或盐梯度或pH和盐梯度结合洗脱分离纤维素酶组分是可能的。在纯化之后，可重组合乎需要的组分的所需量。
本文所使用的术语“截短的(truncated)纤维素酶”指这样的蛋白质，该蛋白质包含纤维二糖水解酶或内葡聚糖酶的截短的纤维素酶催化核心或截短的纤维素结合结构域，例如，EGI型、EGII型、EGV型、CBHI型、CBHII型或其衍生物。如上所述，许多纤维素酶被认为是双功能的，它们包含指导对纤维素底物催化或水解活性以及非催化纤维素结合活性。这样，截短的纤维素酶是完整形式的纤维素酶，其包含核心和结合结构域，但被处理以失去一个或另一个结构域。
纤维素酶的催化核心和纤维素结合结构域被认为以协同方式共同作用以影响效率和在含纤维素的织物中纤维素纤维的有害水解。而且，纤维素酶催化活性和纤维素结合活性被认为对明显的结构的结构域是特异性的。例如，如上所述，已知许多纤维素酶(包括得自，例如，Trichodermalongibrachiatum和Humicola insolens的纤维素酶)掺入催化核心结构域亚单位，该亚单位通过纤维素结合结构域亚单位的接头区接合。
“纤维素酶衍生物”包括本文定义的截短的纤维素酶核心或截短的纤维素结合结构域，其中可以在截短的纤维素酶的C-末端和N-末端之一或两者有一种或多种氨基酸添加或缺失，或在整个纤维素酶中有一个或多个位点的一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。衍生物包括保守其如下所述的作为截短的纤维素酶核心或截短的纤维素结合结构域特征的突变体。术语“截短的纤维素酶衍生物”意于包括附加接头区的一个或多个氨基酸的外葡聚糖酶或内葡聚糖酶的核心或结合结构域。
截短的纤维素酶衍生物还指结构和生物活性和截短的纤维素酶核心或截短的纤维素结合结构域蛋白质实质上相似的蛋白质，但是其通过基因工程包含修饰的氨基酸序列。这样，假定两种蛋白质具有实质上类似的活性，它们就被认为是“衍生物”，即使一种蛋白质的主要结构不和另一种蛋白质中发现的氨基酸序列相同。
本发明认为截短的纤维素酶衍生物可来源于编码催化截短的核心或截短的纤维素结合结构域的DNA片段，该片段还内在地或在DNA片段的5或3末端包含一种或多种核苷酸的添加、内在地或在DNA片段的5或3末端包含一种或多种核苷酸的缺失、内在地或在DNA片段的5或3末端包含一种或多种核苷酸的取代，其中保留了所说的表达的截短的纤维素结合或催化核心结构域(截短的纤维素酶衍生物)的功能活性。编码纤维素酶催化核心或纤维素结合结构域的DNA片段还可包括连接到核心或结合结构域DNA序列的5或3末端的接头或铰链DNA序列或其部分，其中保留了所说的编码的截短的纤维素结合结构域或纤维素酶核心结构域(截短的纤维素酶衍生物)的功能活性。
本文的术语“截短的纤维素酶核心”或“截短的纤维素酶区”指这样的肽，该肽包含外纤维二糖水解酶或内葡聚糖酶的催化核心结构域，例如，EGI型、EGII型、EGV型、CBHI型或CBHII型或其可酶促裂解纤维素聚合物(包括但不限于髓或磷酸溶胀纤维素)的衍生物。然而，截短的纤维素酶核心不具有可归因于纤维素结合结构域的纤维素结合活性。截短的纤维素酶核心和以完整的形式具有很小的纤维素结合活性的非截短的纤维素酶是有区别的。截短的纤维素酶核心可包括其它不包括可归因于纤维素结合结构域的纤维素结合活性的实体(entity)。例如，具体来说，本发明涉及接头或铰链的存在。相似地，具体来说，本发明也涉及另一个酶促实体共价地连接到截短的纤维素酶核心上。
包含截短的催化核心或其衍生物的蛋白质的性能(或活性)可通过本领域已知的方法测定(参见Wood，T.M.等，酶学方法，160卷，编辑Wood，W.A.和Kellogg，S.T.，学术出版社，87-116，1988)。例如，这样的活性可通过磷酸溶胀纤维素和/或可溶性低聚糖的水解，其后再通过释放出的还原糖的定量测定。在这种情况下，可溶性糖产物(通过CBH或EG纤维素酶核心结构域或其衍生物的作用释放)可通过HPLC分析或通过使用测量还原糖的比色测定检测。当每个在类似的条件下以及剂量基于相似量的催化结构域蛋白质时，预期这些催化结构域或其衍生物保留全酶表现出的活性的至少10％。
术语“截短的纤维素结合结构域”在本文中指这样的肽或有关的肽的基团，这种肽或有关的肽的基团包含外纤维二糖水解酶或内葡聚糖酶的纤维素结合活性，例如，EGI型、EGII型、EGV型、CBHI型或CBHII型，或其非共价地结合到多糖(如纤维素)上的衍生物。人们相信纤维素结合结构域把酶连接到纤维素上并独立于纤维素酶的催化核心起作用。截短的纤维素结合结构域不具有可归因于催化核心的明显水解活性。截短的纤维素结合结构域和完整形式的、不具有纤维素酶催化核心的非截短的纤维素酶是有区别的。截短纤维素结合结构域可包括其它不包括可归因于纤维素酶催化核心的纤维素裂解活性的实体。例如，具体来说，本发明涉及接头或铰链的存在。相似地，具体来说，本发明也涉及另一个酶促实体共价地连接到截短的纤维素结合结构域上。
本发明中所述的截短的纤维素结合结构域或其衍生物的性能(或活性)可使用纤维素底物(如微晶纤维素、髓或棉)通过纤维素结合测定来测定。当每个在类似的条件下以及剂量基于相似量的结合结构域蛋白质时，预期这些新的截短的纤维素结合结构域或其衍生物与非截短的酶表现出的结合亲和力相比至少保留10％的结合亲和力。未结合的结合结构域的量可通过直接进行蛋白质分析、色谱方法或有可能的话通过免疫学方法定量测定。
其它本领域熟知的通过特殊处理底物的物理或化学性质测量纤维素酶催化和/或结合活性的方法在本发明中也是合适的。例如，对于测量处理底物的物理性质的方法，可分析底物形状、纹理、表面或结构性质的修饰、“湿润”能力的修饰，例如，底物的吸水能力或溶胀修饰。可确定活性的其它参数包括测量所处理的固体底物化学性质的变化。例如，染料或化学药品的扩散性质可在用本发明所述的截短的纤维素酶结合蛋白质或其衍生物处理固体底物之后测定。例如，用于评价活性的适当底物包括微晶纤维素、rayon、髓纤维、棉或ramie纤维、纸、牛皮纸或地面树木髓(也参见Wood，T.M.等，“酶学方法”，160卷，编辑Wood，W.A.和Kellogg，S.T.，学术出版社，87-116，(1988))。
除了截短的纤维素酶核心之外，本文定义的无结合结构域的天然产生的纤维素酶具有截短的催化核心的优点。例如，来源于胡萝卜软腐欧文氏菌的细菌纤维素酶被认为不具有结合结构域(参见，例如，Saarilahti等，基因，90卷，9-14(1990))。相似地，来源于热纤梭菌的纤维素酶也被认为不具有结合结构域(参见，例如，Gilkes，等，微生物回顾，303-315(1991))。这样，使用不具有结合结构域的天然产生的纤维素酶就提供和已知的纤维素酶的磨损相当的水平的降低的回染。
“β-葡糖苷酶(BG)组分”指表现出BG活性的全纤维素酶组合物的组分；这就是说，这样的组分从纤维二糖和其它可溶性细胞低聚糖(“纤维二糖”)的非还原末端作用并给出作为唯一产物的葡萄糖。BG组分不吸附纤维素聚合物或与其进行反应。进而，这样的BG组分被葡萄糖竞争性抑制(Ki大约为1mM)。严格意义上讲，BG组分不是严格的纤维素酶，因为它们不能降解纤维素，这样的BG组分包括在定义的纤维素酶系统之内，因为这些酶通过进一步通过CBH型组分和EG型组分结合产生的降解抑制性的纤维素降解产物(具体来说是纤维二糖)促进纤维二糖的全面降解。
提高或降低纤维素酶组合物中BG组分的量的方法在WO92/10581中公开，本文一并参考了该申请的全部。
“接头或铰链(hinge)区”指把纤维素酶的明显的催化核心和纤维素结合结构域结构连接在一起的短肽区。这些在Trichoderma longibracjiatum纤维素酶中的结构域，例如，通过富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸的肽连接。
“信号序列”指结合到促进成熟形式蛋白质分泌出细胞的蛋白质的N-末端部分的氨基酸序列。信号序列的这种定义是功能性的定义。胞外蛋白的成熟形式无信号序列，它在分泌加工期间被裂解。
“宿主细胞”指作为按照本发明的重组体DNA载体的宿主的细胞。在按照本发明的一个优选的实施方案中，“宿主细胞”从木霉属一个种的细胞产生的细胞和原生质体。
“DNA构建体或载体”(在本文中可互换使用)指包括编码任一上述的新的截短的纤维素酶或衍生物的一种或多种DNA片段或DNA变体片段的核苷酸序列。
“功能性地连接到”指调节区，如启动子、终止子、分泌信号或增强子区连接到结构基因上并控制那个基因表达的。
“缓冲液”指技术认可的在用纤维素酶处理含纤维素的织物期间稳定纤维素酶溶液以抗不合需要的pH转变的酸/碱试剂。在这一点上，技术认可纤维素酶活性是pH依赖性的。例如，特异性的纤维素酶组合物表现出在具有最优分解纤维素活性的定义的pH值范围之内(发现在这个限定范围的一小部分之内)分解纤维素的活性。分解纤维素活性的特异性pH值范围随每种纤维素酶组合物而变化。如上所述，大多数纤维素酶在酸性到中性的pH值轮廓之内表现出分解纤维素活性，而有一些纤维素酶组合物则在碱性pH值环境下表现出分解纤维素活性。
在纤维素酶处理含纤维素的织物期间，初始的纤维素酶溶液的pH值在纤维素酶活性所需的范围之外是可能的。在纤维素酶处理含纤维素的织物期间pH值改变(例如，通过改变溶液pH值的反应产物的产生改变)也是可能的。在任何事件中，非缓冲的纤维素酶溶液的pH值可能超出分解纤维素活性所需的范围。在这种情况下，在纤维素酶溶液中发生不合需要的分解纤维素活性的降低或中止。
由于上述原因，纤维素酶溶液的pH值应保持在分解纤维素所需的活性范围之内。完成它的一种方式是通过简单地监控系统的pH值并通过酸或碱的添加把pH调整到所需的值。然而，在一个优选的实施方案中，系统的pH值通过在纤维素酶溶液中使用缓冲液优选地保持在所需的pH值范围之内。通常，使用足量的缓冲液以便把溶液的pH值保持在范围之内，其中所使用的纤维素酶表现出活性。在不同的纤维素酶组合物具有表现出纤维素酶活性的不同pH值范围的限度内，使用的特异性缓冲液相对于使用的特异性纤维素酶组合物选择。选择用于使用的纤维素酶组合物的缓冲液可通过技术人员考虑用于纤维素酶的pH值范围和最优值以及纤维素酶溶液的pH值而易于确定。使用的缓冲液优选地是与纤维素酶组合物相容的并把纤维素酶溶液的pH值保持在最优活性所需的pH值范围之内的缓冲液。合适的缓冲液包括柠檬酸钠、乙酸铵、醋酸钠、磷酸二钠盐以及任何其它技术认可的缓冲液。
II.截短的纤维素酶的制备本发明涉及截短的纤维素酶和截短的纤维素酶衍生物的用途。这些酶优选地是通过重组技术制备。另外，用于本发明的截短的纤维素酶蛋白质可通过领域认可的其它手段(如全纤维素酶蛋白质化学裂解或蛋白水解)获得。
制备按照本发明的截短的纤维素酶的一个优选的方式包括获得缺乏一种或多种纤维素酶活性的改良的木霉属一个种的宿主细胞。改良的木霉属一个种的细胞用包含至少一种编码外纤维二糖水解酶或内葡聚糖酶结合或核心区的部分或全部的DNA片段的DNA构建体转化，例如，功能性地连接到启动子上的EGI、EGII、EGV、CBHI或CBHII。然后在表达所需的蛋白质的条件下培养转化的宿主细胞。其后，所需的蛋白质产物纯化至实质上均一。
被转化的微生物优选地包括来源于木霉属一个种的菌株。菌株最优选地包括Trichoderma longibrachiatum纤维素酶过量产生的菌株。例如，已知RL-P37(由Sheir-Neissal等在应用微生物生物技术，20(1984)，46-53中描述)分泌提高的量的纤维素酶。RL-P37的功能性等价物包括Trichoderma longibrachiatum菌株RUT-C30(以保藏号ATCC 56765保藏)和ATCC 58351、58352和58353。
更优选地，在DNA构建体或包含编码截短的纤维素酶蛋白质的DNA片段的质粒导入之前，木霉属宿主细胞菌株有一种或多种纤维素酶基因缺失。这样的菌株可通过在美国专利5,246,853和WO 92/06209中公开的方法制备。因此本文一并参考了其说明书。通过在无一种或多种纤维素酶基因的宿主微生物中表达截短的纤维素酶，可简化鉴别以及尔后的纯化过程。任何被克隆的得自木霉属的基因可缺失，例如，cbh1，cbh2，egl1和egl3基因。
基因缺失可通过本领域已知的方法把要缺失或破坏的所需基因的形式插入质粒完成。适当的缺失质粒通常在其中具有单一限制性内切酶位点存在以使同源的木霉属一个种DNA的片段作为单一的线性片段除去。然后，在适当的限制性内切酶位点切割缺失质粒至内部的编码区，编码序列或其部分的基因用可选择性标记取代。缺失或破坏的基因的位点的侧翼DNA序列(优选地在大约0.5至2.0kb之间)保留在可选择性标记基因的一边。
必须选择可选择性标记以使可以检测转化的真菌。任何在选择的微生物中表达的可选择性标记基因是合适的。例如，对于木霉属一个种，选择可选择性标记以使可选择性标记在转化体中的存在不明显地影响其性质。这样的一种可选择性标记可以是编码可检测产物的基因。例如，可以使用木霉属一个种基因的功能性拷贝，它如果在宿主菌株中缺失，就导致在宿主菌株中显示出营养缺陷的表型。
在一个优选的实施方案中，转化木霉属一个种的pyr4-衍生物菌株以使一种或多种纤维素酶基因被pyr4基因取代，这样就提供了一个可选择性标记。pyr4-衍生物菌株可通过使使木霉属一个种的菌株经受氟乳清酸(fluoroorotic acid)(FOA)获得。pyr4基因编码5-脱氧次黄苷酸脱羧酶，这是一种尿苷生物合成所需的酶。具有完整的pyr4基因的菌株可在无尿苷的培养基中生长，但是对氟乳清酸敏感。通过选择FOA抗性以选择缺乏功能性的乳清酸核苷脱氧次黄苷酸脱羧酶而且生长需要尿苷的pyr4-衍生物菌株是可能的。使用FOA选择技术也可能获得缺乏功能性的乳清酸pyrophosphoribosyl转移酶而需要尿苷的菌株。用编码这些酶的基因的一个功能性拷贝转化细胞是可能的(Serges和Barreau，1991，当前遗传学，19，359-365)。使用上述的FOA抗性技术易于进行衍生物菌株的选择，这样，pyr4基因优选地用作可选择性标记。
要转化pyr4-木霉属一个种以缺失表达一种或多种纤维素酶基因的能力，包含破坏的或缺失的纤维素酶基因的单一DNA片段从缺失质粒中分离，用来转化适当的pyr-木霉属宿主。然后选择转化体并基于其表达pyr4基因产物的能力鉴别这样的compliment宿主菌株的尿苷营养缺陷型。然后对形成的转化体进行Southern印迹分析以鉴别并确认在整合上的双杂交事件，这种事件取代了用pyr4可选择性标记缺失的基因编码区的部分或全部。
尽管上述的特异性质粒载体与pyr-转化体的制备有关，本发明不限于这些载体。使用上述技术在木霉属一个种中的各种基因可缺失和取代。此外，如上所述可使用任何可得到的可选择性标记。事实上，任何被克隆并这样鉴别的木霉属一个种的基因可使用上述策略从基因组中缺失。
如上所述，使用的宿主菌株是缺乏或具有一个非功能基因或选择的对应于可选择性标记的基因的木霉属一个种的衍生物。例如，如果选择了pyr4的可选择性标记，然后特异性的pyr衍生物菌株可在转化方法中用作受体。相似地，可使用包含相当于构巢曲霉基因arqB、trpC、niaD的木霉属一个种基因的可选择性标记。因此相应的受体菌株必须分别是衍生物菌株如arqF-、trpC-、niaD-。
然后制备插入到适当的微生物中的截短的纤维素酶蛋白质。按照本发明，编码截短的纤维素酶的DNA序列包含编码相应于纤维素酶的催化核心区的蛋白质的DNA。因此，DNA可以来源于任何已知产生纤维素酶的微生物来源，其中的基因被鉴别并分离。在一个优选的实施方案中，DNA编码来源于木霉属一个种(更优选地是来源于Trichoderma longibrachiatum)的截短的纤维素酶蛋白质。这样，DNA可编码EGI、EGII、CBHI或CBHII核心蛋白质。优选地，DNA基因片段或变体DNA片段分别编码木霉属一个种的纤维素酶或其衍生物(还保留了截短的核心或结合结构域的功能活性)的核心或结合区。而且，包含核心或结合结构域区的DNA片段或其变体还可以附加接头或铰链区DNA序列或其部分，其中所说的截短的纤维素酶仍然分别保留着纤维素酶核心或结合结构域活性。
编码截短的纤维素酶或衍生物的DNA片段或DNA变体片段可以功能性地连接到真菌启动子序列上，例如，cbh1或eqrl 1基因的启动子。本发明涉及编码截短的纤维素酶的一个以上的DNA拷贝可重组进菌株。
可通过携带编码截短的纤维素酶的DNA的表达载体的构建制备编码截短的纤维素酶蛋白质的DNA。携带编码截短的纤维素酶的插入的DNA片段的表达载体可以是任何能在给定的宿主有机体中自动复制的载体，典型地是质粒。在优选的实施方案中涉及两类用于获得基因或其截短的序列表达的的表达载体。第一类包含DNA序列，其中启动子、基因编码区和终止子序列均源于要表达的基因。基因截短的序列通过删除不合需要的DNA序列(编码不需要的结构域)以使结构域在它自己的转录与翻译调节序列的控制下表达。在载体上还包含一个可选择性标记使得可以选择新的基因序列的多拷贝整合进宿主。
例如，pEGIΔ3 pyr包含在EGI启动子、终止子和信号序列控制下的EGI纤维素酶核心结构域。包含纤维素结合结构域的EGI编码区的3端缺失。质粒也包含用于选择目的的pyr4基因。
第二类表达载体被预装配并包含高水平转录所需的序列和可选择性标记。本发明涉及基因或其部分的编码区可插入进这个常用的表达载体中以使它处于表达盒启动子与终止子序列的转录控制之下。
例如，PTEX是这样的一种常用的表达载体。基因或其部分可插入到强CBHI启动子的下游。本文公开的例子包括在使用这个系统表达纤维素酶催化核心和结合结构域中。
在载体中，编码本发明的截短的纤维素酶或其它新蛋白质的DNA序列应可操作地连接到转录和翻译序列上，即，在结构基因的读框中的合适的启动子序列和信号序列。启动子可以是任何在宿主细胞表现出转录活性的DNA序列，可来源于编码和宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。信号肽提供了截短的纤维素酶或其衍生物的胞外表达。DNA信号序列优选地是和表达的截短的基因天然相关的信号序列，然而本发明涉及任何得自外纤维二糖水解酶或内葡聚糖酶的信号序列。
用于把编码本发明的截短的纤维素酶、其衍生物或其它新的纤维素酶的DNA序列和启动子连接以及插入包含在宿主细胞中复制的必要信息的的合适的载体的方法在本领域中是熟知的。
上述的DNA载体或构建体可以按照已知技术(如转化、转染、微注射、微孔、biolistic轰击等)导入宿主细胞。
在优选的转化技术中，必须考虑到木霉属一个种中的细胞壁的渗透性十分低。因此，所需的DNA序列、基因或基因片段的摄取最多是最小的。有许多方法于转化过程之前在衍生物菌株(即，无对应于所用的可选择性标记的功能基因)提高木霉属一个种的细胞壁渗透性。
本发明优选的制备用于转化的木霉属一个种的方法包括从真菌菌丝体制备原生质体。菌丝体可从发芽的营养孢子获得。菌丝体使用消化细胞壁的酶处理，产生原生质体。然后通过在悬浮介质中渗透稳定剂的存在保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。这些稳定剂的浓度通常在0.8至1.2M之间变化。优选的是使用在悬浮液介质中1.2M的山梨醇溶液。
DNA摄取进宿主木霉属一个种的菌株依赖于钙离子浓度。通常在摄取溶液中使用大约10mM CaCl2至50mM CaCl2。除在摄取溶液中需要钙离子之外，通常包括的其它项目是缓冲系统，如TE缓冲液(10mM Tris，Ph7.4；1mMEDTA)或10mM MOPS，Ph6.0缓冲液(吗啉丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。人们相信聚乙二醇起作用融合细胞膜，这样使得介质的的内容物进入木霉属一个种的细胞质，质粒DNA转移进核内。这种融合常使质粒DNA的多个拷贝纵排地(tandemly)整合进宿主染色体。
在转化中使用的通常是包含以108至109的密度经受渗透处理(优选的是2×108/ml)的木霉属一个种的原生质体或细胞的悬浮液。这些原生质体或细胞和所需的线性化的可选择性标记(在所说的标记的一边具有实质上同源的侧翼区)一起添加到摄取溶液中以形成转化混合物。通常向摄取溶液中添加高浓度的PEG。可以向原生质体悬浮液添加0.1至1体积25％的PEG4000。然而，优选的是向原生质体悬浮液添加大约0.25体积。也可以向摄取溶液加入添加剂(如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等)以有助于转化。
一般地，混合物在大约0℃下温育大约10至30分钟的时期。然后再向混合物添加另外的PEG以进一步提高所需的基因或DNA序列的摄取。通常添加5至15倍于转化混合物的体积的25％PEG4000；然而，更大和更小体积也可能是合适的。25％的PEG4000优选的是大约10倍于转化混合物的体积。在添加PEG之后，转化混合物在室温下温育，然后添加山梨醇和CaCl2溶液。然后再向生长培养基的熔化的等分试样加入原生质体悬浮液。这种生长培养基仅允许转化体的生长。任何适合于培养所需的转化体的生长培养基可在本发明中使用。然而，如果选择Pyr±转化体，优选地是使用不包含尿苷的生长培养基。尔后菌落在生长培养基上转移和纯化以除去尿苷。
在这个阶段，稳定的转化体通过它们的更快的生长速率和在无尿苷的固体培养基上平滑而非粗糙的圆形菌落的形成和不稳定的转化体区分开。另外，在某些情况下通过在固体非选择性培养基(即包含尿苷)培养转化体，从该培养基收获孢子并测定这些孢子其后发芽的百分比和在无尿苷的选择性培养基上培养以进一步进行稳定性试验。
在上述方法特定的实施方案中，以活性形式(作为新截短的纤维素酶或其衍生物的适当的翻译后加工的结果)从宿主细胞回收截短的纤维素酶或其衍生物。
纤维素酶截短的从培养基通过常规技术(包括通过离心从培养基中分离细胞、过滤、在上清液或滤液中的蛋白质用盐(例如，硫酸铵)沉淀)回收。另外，可使用色谱方法如离子交换色谱、亲和色谱。另外，可通过结合到多糖底物或抗体基质分离和纯化分泌蛋白质产物。抗纤维素酶核心或结合结构域肽或合成肽产生的抗体(多克隆或单克隆)可从核心结构域或结合结构域的部分制备并用于产生多克隆抗体。
转化进宿主细胞的DNA可包括另外的实施方案。例如，本发明涉及组合来源于同源或异源的微生物来源的核心区的纤维素酶。
III.使用截短的纤维素酶处理含纤维素的织物的方法如上所述，本发明涉及用截短的纤维素酶处理含纤维素的织物的方法。与现有技术的纤维素酶处理相比，当保持相当水平的磨损时，本发明的截短的纤维素酶组合物的使用提供了引起比较低水平的染色再沉积的新的和令人惊奇的结果。因为磨损的水平作为特殊的纤维素酶处理技术(例如，石头洗涤或洗衣)的质量和效能的指标，本发明的使用提供了令人惊奇的高质量纺织品处理组合物。在洗衣中，磨损有时作为颜色清晰、去毛(defuzzing)或生物抛光(biopolishing)。
具体来说，本发明涉及截短的纤维素酶核心单独以及与附加的纤维素酶组分结合以达到与非截短的纤维素酶相比极好的磨损和减少的再沉积的用途。另外，无结合结构域的天然产生的纤维素酶被认为在本发明的范围之内。本发明也涉及提供另外的增强以处理含纤维素的织物(包括在织物的手感和/或外观中的改进)的方法。
A.用截短的纤维素酶石头洗涤的方法按照本发明，上述的截短的纤维素酶组合物可用作石头洗涤组合物。优选地，即时的(the instant)石头洗涤组合物包含含有有效量的截短的纤维素酶以及其它可有可无的成分(包括，例如，缓冲液、表面活化剂和擦洗剂)的水溶液。
有效量的截短的纤维素酶组合物是足以达到预期用途的截短的纤维素酶的浓度。这样，在按照本发明的石头洗涤组合物中的“有效量的”截短的纤维素酶是提供所需处理(如石头洗涤)的浓度。所使用的截短的纤维素酶的量也依赖于所使用的设备、所使用的处理参数(截短的纤维素酶处理溶液的温度、纤维素酶溶液的接触时间等)、纤维素酶活性(例如，一种特殊的溶液需要更低浓度的纤维素酶，其中更高活性的纤维素酶组合物用于和更低活性的纤维素酶组合物比较)。通过技术人员基于上述因素以及所需的结果易于测定截短的纤维素酶的确切浓度。截短的纤维素酶组合物优选地以1-1000ppm的总蛋白质浓度存在，更优选地是10-900ppm的总蛋白质，最优选地是20-100ppm的总蛋白质。
在石头洗涤组合物中可有可无地使用缓冲液以使缓冲液的浓度足以把溶液的pH值保持在这样的范围之内，其中所使用的截短的纤维素酶表现出活性，所说的活性反过来又取决于使用的截短的纤维素酶的性质。所使用的缓冲液的确切浓度取决于技术人员易于考虑的几种因素。例如，在一个优选的实施方案中，选择缓冲液以及缓冲液浓度以便把最终的截短的纤维素酶溶液的pH保持在最优纤维素酶活性所需的pH范围之内。优选地，在石头洗涤组合物中的缓冲液浓度是大约0.001N或更大。合适的缓冲液包括，例如，柠檬酸盐和醋酸盐。
除了截短的纤维素酶和缓冲液之外，石头洗涤组合物可以可有可无地包含表面活化剂。优选地，表面活化剂以在稀释的洗涤介质中以大于100ppm的浓度的浓度存在，优选地是大约200-15,000ppm。合适的表面活化剂包括任何与纤维素酶和织物相容的表面活化剂，包括，例如，阴离子的、非离子的和两性表面活性剂。本文使用的合适的阴离子表面活化剂包括线性或分枝的烷基苯磺酸盐；具有线性或分枝的烷基基团或烯基基团的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；烷烃磺酸盐等。阴离子表面活化剂的合适的反(couter)离子包括碱金属离子如钠和钾；碱土金属离子如钙和镁；铵离子；以及具有1至3个碳数目为2或3的烷醇基团的烷醇胺。两性表面活化剂包括磺酸季铵盐和甜菜碱型两性表面活化剂。这样的两性表面活化剂在同一分子中具有阳性和阴性荷电基团。非离子表面活化剂通常包括聚氧化亚烷基醚和高级脂肪酸烷醇胺或其亚烷基氧化物加合物以及脂肪酸的甘油单酯。表面活化剂的混合物也可以以本领域中已知的方式使用。
在一个优选的实施方案中，可制备浓缩的石头洗涤组合物以用于本文所述的方法。这样的浓缩物包含浓缩的量的上述截短的纤维素酶组合物、缓冲液和表面活化剂，优选地是在水溶液中。这样形成制剂时，石头洗涤易于用水稀释以快速而准确地制备按照本发明的并具有所需浓度的添加剂的石头洗涤组合物。优选地，这样的浓缩物包含大约0.1％至大约50％(重量比)的上述真菌纤维素酶组合物(蛋白质)；大约0.1％至大约80％(重量比)的缓冲液；大约0％至大约50％(重量比)的表面活化剂；用水进行平衡。当制成含水浓缩物时，可以稀释这些浓缩物以达到上述的在截短的纤维素酶溶液中组分所需的浓度。很明显，这样的石头洗涤浓缩物使得容易把截短的纤维素酶溶液制成制剂并使得浓缩物切实可行地运输到使用它的地点。石头洗涤浓缩物可以是任何技术认可的剂型，例如，液体、乳胶、凝胶或糊状物。这样的剂型是技术人员熟知的。
使用固体石头洗涤浓缩物时，纤维素酶组合物可以是粒剂、粉剂、团块或固体片。使用粒剂时，粒剂优选地包含纤维素酶保护剂。参见，例如，美国07/642,669，1991年1月17日以Attorney Docket No.010055-073的申请，标题为“包含酶与酶保护剂的粒剂以及包含这样的粒剂的去垢组合物”，本文一并参考了该申请的全部。同样地，可以制成粒剂以包含降低进入洗涤介质的粒剂的分解速率的物质。这样的物质和粒剂在美国专利5,254,283中公开，本文一并参考了其全部。
其它物质也可和上述的本发明的石头洗涤组合物一起或置于其中使用，这些物质包括石头、浮石、填料、溶剂、酶活化剂和其它抗再沉积剂。
通过混合处理组合物与石头洗涤组合物使含纤维素的织物与包含有效量的截短的纤维素酶或衍生物的石头洗涤组合物接触，这样把截短的纤维素酶和织物相接近。例如，如果处理组合物是水溶液，织物可以直接浸渍在溶液中。相似地，当石头洗涤组合物是浓缩物时，浓缩物以含纤维素的织物稀释进水浴中。当石头洗涤组合物是固体剂型时(例如预洗涤凝胶或固体条状物)，石头洗涤组合物可通过直接把组合物应用于织物或洗涤液体中以使其和织物接触。
含纤维素的织物和石头洗涤溶液在有效地使酶促反应赋予含纤维素的织物石头洗涤的外观的条件下温育。例如，在石头洗涤期间，可以调整pH、液体比、温度和反应时间以在石头洗涤组合物作用的条件下最优化。“有效条件”必需指使截短的纤维素酶与含纤维素的织物有效地进行反应的pH值、液体比和温度。截短的纤维素酶核心的反应条件和本发明的石头洗涤组合物有效的条件与相应的非截短的纤维素酶使用的熟知的技术是实质上类似的。因此，用包含按照本发明的CBHI型核心的石头洗涤组合物有效地处理含纤维素的织物的条件和现有技术中使用野生型CBHI型纤维素酶组合物的条件实质上类似。相似地，当使用截短的和非截短的纤维素酶混合物时，条件应该最优化，类似于相似的组合使用时的条件。因此，最优化使用按照本发明的石头洗涤组合物的条件在本领域的技术之内。
在石头洗涤期间的本文使用的液体比(即，石头洗涤组合物溶液(即洗涤液体)的重量和织物重量之比)通常是足以在斜纹粗棉布织物上达到所需的石头洗涤效果的量，该比率也依赖于所使用的方法。优选地，液体比从大约4∶1至大约50∶1；更优选地是从大约5∶1至大约20∶1，最优选地是从大约10∶1至大约15∶1。
石头洗涤组合物存在下的石头洗涤期间的反应温度由两个竞争性因素控制。首先，更高的温度通常对应于提高的反应动力学，即更快速的反应，这使得与在更低的温度下所需的反应时间相比可以减少反应时间。因此，反应温度通常至少大约10℃和更大。其次，纤维素酶是在给定的反应温度(反应温度依赖于所使用的纤维素酶的性质)以外失去活性的蛋白质。这样，如果使反应温度太高，由于纤维素酶的变性可失去分解纤维素活性。结果是，本文所用的最大反应温度通常是大约65℃。由于上述因素，反应温度通常是从大约30℃至大约65℃；优选地是从大约35℃至大约60℃；最优选地是从大约35℃至55℃。
反应时间依赖于石头洗涤发生的特定条件。例如，pH、温度和截短的纤维素酶的浓度都影响最优反应时间。通常，反应时间是从大约5分钟至大约5小时，优选地是从大约10分钟至大约3小时，最优选地是从大约20分钟至大约1小时。
在上述的使用按照本发明的截短的纤维素酶组合物处理含纤维素的织物的石头洗涤方法与以相同的方式用非截短的纤维素酶组合物处理的含纤维素的织物相比表现出降低的染料再沉积。
B.用包含截短的的纤维素酶的A去垢组合物处理含纤维素的织物的方法按照本发明，上述的截短的纤维素酶组合物可用作去垢组合物。按照本发明的去垢组合物可用作预洗涤组合物、预浸渍组合物或在有规律的洗涤周期期间用于去垢剂清洁。优选地，本发明的去垢组合物包含有效量的截短的纤维素酶和表面活化剂，并可有可无地包括下述的其它成分。
用于本发明的去垢组合物的截短的纤维素酶的有效量是足以赋予含纤维素的织物改进的磨损的量。优选地，使用的截短的纤维素酶是大约0.001％至大约25％的浓度，更优选地是大约0.02％至大约10％(和去垢剂的重量百分比)。
用于去垢组合物的截短的纤维素酶的特定浓度优选地选择，以使其稀释进洗涤介质时，截短的纤维素酶的浓度在大约0.1至大约1000ppm总蛋白质的范围内，优选地是从大约0.2ppm至大约500ppm总蛋白质，最优选地是大约0.5ppm至大约250ppm的总蛋白质。这样，用于去垢组合物的截短的纤维素酶的特定的量取决于通过加入水中稀释去垢剂以形成洗涤溶液的程度。
低浓度的截短的纤维素酶(即截短的酶的浓度低于20ppm)在重复洗涤之后，相同的表面纤维磨损下的降低的回染或再沉积与现有技术组合物相比变得明显。更高的浓度下(即截短的纤维素酶的浓度大于40ppm)，在单次洗涤之后，相同的表面纤维除去下降低的回染变得明显。
本发明的去垢组合物可以是任何技术认可的形式，例如，液态稀释液、粒剂、乳剂、凝胶或糊状物。这样的剂型是技术人员熟知的。使用固体去垢组合物时，截短的纤维素酶优选地制成粒剂。优选地，可以制成粒剂以再包含纤维素酶保护剂。参见，例如，美国07/642,669，1991年1月17日以Attorney Docket No.010055-073的申请，标题为“包含酶与酶保护剂的粒剂以及包含这样的粒剂的去垢组合物”，本文一并参考了该申请的全部。同样地，可以制成粒剂以包含降低进入洗涤介质的粒剂的分解速率的物质。这样的物质和粒剂在美国专利5,254,283中公开，本文一并参考了其全部。
本发明的去垢组合物使用表面活性剂(即表面活化剂)，包括熟知的用于去垢组合物的阴离子的、非离子的和两性表面活性剂。
用于本发明的去垢组合物合适的阴离子表面活化剂包括线性或分枝的烷基苯磺酸盐；具有线性或分枝的烷基基团或烯基基团的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；烷烃磺酸盐等。阴离子表面活化剂的合适的反离子包括碱金属离子如钠和钾；碱土金属离子如钙和镁；铵离子；以及具有1至3个碳数目为2或3的烷醇基团的烷醇胺。
两性表面活化剂包括磺酸季铵盐和甜菜碱型两性表面活化剂。这样的两性表面活化剂在同一分子中具有阳性和阴性荷电基团。
非离子表面活化剂通常包括聚氧化亚烷基醚和高级脂肪酸烷醇胺或其亚烷基氧化物加合物以及脂肪酸的甘油单酯等。
用于本发明的合适的表面活化剂在英国专利申请2094826 A中公开，本文一并参考了其说明书。
也可以使用这样的表面活化剂的混合物。
表面活化剂或表面活化剂的混合物在本发明的去垢组合物中通常以下列的量使用占总去垢组合物的大约1％至大约95％(重量比)，优选地是占总去垢组合物的大约5％至大约45％(重量比)。通过在洗涤介质中稀释，表面活化剂的浓度通常是大约500ppm或更大；优选地是大约1000ppm至15,000ppm。
除了纤维素酶组合物和表面活化剂之外，本发明的去垢组合物还可有可无地包含一种或多种下列组分除纤维素酶之外的水解酶这样的水解酶包括作用于酯键的羧酸酯水解酶、硫代酸酯水解酶、磷酸单酯水解酶、磷酸二酯水解酶；作用于葡基化合物的糖苷水解酶；水解N-葡基化合物的酶；作用于酯键的硫醚水解酶；作用于肽键的α氨基酰基肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、酰基氨基酸水解酶、二肽水解酶以及肽基肽水解酶。其中优选的是羧酸酯水解酶、糖苷水解酶、和肽基肽水解酶。适合的水解酶包括(1)属于肽基肽水解酶的蛋白酶，如胃蛋白酶、胃蛋白酶B、凝乳酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B、弹性硬蛋白酶、肠激酶、组织蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、无花果蛋白酶、凝血酶、血纤蛋白溶酶、高血压蛋白原酶、枯草杆菌蛋白酶、曲霉肽酶A、胶原酶、梭菌肽酶B、激肽释放酶、胃亚蛋白酶、组织蛋白酶D、菠萝蛋白酶、角蛋白酶、胰凝乳蛋白酶C、胃蛋白酶C、曲霉肽酶B、尿激酶、羧肽酶A和B以及氨肽酶；(2)糖苷水解酶(作为基本成分的纤维素酶这个基团中除去)、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶、溶菌酶、果胶酶、壳多糖酶以及葡聚糖酶。其中优选的是α-淀粉酶和β-淀粉酶。它们在酸到中性系统中起作用，但从细菌中获得的一种酶在碱性系统表现出高的活性；(3)羧酸酯水解酶，包括羧酸酯酶、脂酶、果胶酯酶以及叶绿素酶。其中尤其有效的是脂酶。
商业产物的商标和生产者如下“Alkalase”、“Esperase”、“Savinase”、“AMG”、“BAN”、“Fungamill”、“Sweetzyme”、“Thermamyl”(Novo工业，哥本哈根，丹麦)；“Maksatase”、“高碱性蛋白酶”、“淀粉酶THC”、“脂酶”(Gist Brocades，N.V.，delft，荷兰)；“蛋白酶B-400”、“蛋白酶B-4000”，“蛋白酶AP”、“蛋白酶AP 2100”(Schweizerische Fermemt A.G.，巴塞尔，瑞士)；“CRD蛋白酶”(Monsanto公司，St.Louis，密苏里)；“Piocase”(Piopin公司，Monticello，伊利诺斯)；“链霉蛋白酶P”、“Pronase AS”、“Pronase AF”(Kaken化学有限公司，日本)；“Lapidase P-2000”(Lapidas，Secran，法国)；蛋白酶产物(Tyler标准分子筛，100％通过16目和100％通过150目)(Clington Corn Products，Standard Brade公司子公司，纽约；“Takamine”、“Bromelain 1∶10”、“HP Protease200”、“酶L-W”(得自真菌而非细菌)(Miles化学公司，Elkhart，Ind.)；“Rhozyme P-11 Conc.”、“Pectinol”、“脂酶B”、“Rhozyme PF”、“RhozymeJ-25”(Rohm和Haas，Genencor，南旧金山，CA)；“Ambrozyme200”(Jack Wolf&有限公司，Nopco化学公司的子公司，Newark，N.J.)；“ATP 40”、“ATP 120”、“ATP 160”(Lapidas，Secran，法国)；“Oripase”(Nagase&有限公司，日本)。
非纤维素酶的水解酶按照使用目的按所需的量掺入去垢组合物。它应优选地以0.001％至5％(重量比)、更优选地是0.02％至3％(重量比)的量(按纯化的水解酶计算)。这种酶应以粗制酶制造成的粒剂形式在去垢组合物中单独或与其它组分结合使用。粗制酶的粒剂使用的量使纯化的酶在粒剂中为0.001％至50％(重量比)。粒剂以0.002％至20％、优选地以0.1％至10％(重量比)的量使用。对于纤维素酶，可以制成这些粒剂以包含酶保护剂和分解抑制剂物质。
阳离子表面活化剂和长链脂肪酸盐这样的阳离子表面活化剂和长链脂肪酸盐包括饱和或不饱和脂肪酸盐、烷基或烯基醚羧酸盐、α-磺基脂肪酸盐或酯、氨基酸型表面活化剂、磷酸酯表面活化剂、季铵盐(包括那些具有3至4个烷基取代基和多达1个苯基取代的烷基取代基)。合适的阳离子表面活化剂和长链脂肪酸盐在英国专利申请2094826 A中公开，本文一并参考了其说明书。组合物可包含大约1％至大约20％(重量比)的阳离子表面活化剂和长链脂肪酸盐。
增强去垢剂去垢作用的物质A.二价螯合剂组合物可包含从大约0％至大约50％的(重量比)的一种或多种增强去垢剂去垢作用的物质的组分，这些组分选自下列化合物的碱金属盐和烷醇胺盐磷酸盐、膦酸盐、膦酰基羧酸盐、氨基酸的盐、氨基聚乙酸盐高分子电解质、非游离聚合物、二羧酸的盐以及硅铝酸盐。合适的二价螯合剂在英国专利申请2094826 A中公开，本文一并参考了其说明书。
B.碱或无机电解质组合物可包含大约0.1％至大约5％(重量比)、优选地是大约5％至大约30％(重量比)(基于下列化合物的一种或多种碱金属盐的组合物作为碱或无机电解质)硅酸盐、碳酸盐和硫酸盐以及无机碱，如三乙醇胺、二乙醇胺、一乙醇胺、三异丙醇胺。
抗再沉积剂组合物可包含大约0.1％至5％(重量比)的一种或多种下列化合物作为抗再沉积剂聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素。
其中羧甲基纤维素和/或聚乙二醇与本发明的纤维素酶组合物的组合提供一种尤其有用的去垢组合物。
漂白剂本发明的纤维素酶与漂白剂(如过碳酸钠、过硼酸钠、硫酸钠/过氧化氢加合物、氯化钠/过氧化氢加合物或/和光敏漂白染料如磺化的酞菁的锌或铝盐)结合使用进一步改进去垢剂效果。
上蓝剂和荧光染料如果需要，各种上蓝剂和荧光染料可以掺入组合物中。合适的上蓝剂和荧光染料在英国专利申请2094826 A中公开，本文一并参考了其说明书。
结块抑制剂可以把下列结块抑制剂掺入粉状的去垢剂中p-甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、醋酸盐、磺基琥珀酸盐、磨成细粉的二氧化硅、滑石、粘土、硅酸钙(如Johns Manville公司的Micro-Cell)、碳酸钙和氧化镁。
抑制纤维素酶活性的掩蔽剂因素在某些情况下，在铜、锌、铬、汞、铅、锰或银离子或其化合物存在时，本发明的纤维素酶组合物失效。各种金属螯合剂和金属沉淀剂可有效地抗这些抑制剂。它们包括，例如，在上述制品中列出的二价金属离子螯合剂，参考可有可无的添加剂以及硅酸镁和硫酸镁。
纤维二糖、葡萄糖和葡糖酸内酯有时用作抑制剂。优选的是尽可能避免这些糖和纤维素酶共存。在共存不可避免的情况下，必需避免糖与纤维素酶直接接触，例如，对其进行包衣。
长链脂肪酸盐和阳离子表面活化剂在某些情况下用作抑制剂。然而，如果通过一些方式(如制锭或包衣)可防止其直接接触，这些物质与纤维素酶的共存是允许的。
如果需要，上述的掩蔽剂和方法可在本发明中使用。
纤维素酶活化剂催化剂随纤维素酶的不同而不同。在蛋白质、钴及其盐、镁及其盐、钙及其盐、钾及其盐、钠及其盐或单糖如甘露糖和木糖存在时，纤维素酶被活化，其去垢能力显著改进。
抗氧剂抗氧剂包括，例如，叔-丁基-氢氧基甲苯、4，4-亚丁基双(6-叔-丁基-3-甲酚)、2，2-亚丁基双(6-叔-丁基-3-甲酚)、单苯乙烯甲酚、双苯乙烯甲酚、单苯乙烯酚、双苯乙烯酚和1，1-(4-氢氧基-苯基)环己烷。
加溶剂加溶剂包括，例如，低级醇如乙醇、苯磺酸盐、低级烷基苯磺酸盐如P-甲苯磺酸盐、乙二醇如丙二醇、乙酰苯磺酸盐、乙酰胺、吡啶二羧酸酰胺、苯酸钠盐和尿素。
本发明的去垢组合物可在从酸性至碱性pH的较宽的pH范围内使用。在一个优选的实施方案中，本发明的去垢组合物可在碱性去垢剂洗涤介质中使用，更优选地是在具有大于7而不超过大约11的pH值的碱性去垢剂洗涤介质中使用。
如果需要，除了上述成分外，香料、缓冲液、防腐剂、染料等可和本发明的去垢组合物一起使用。这样的组分迄今通常以本领域中使用的量使用。
当用于本发明的去垢剂碱是粉剂形式时，它可以是通过已知制备方法(包括喷雾干燥法和喷雾干燥制粒方法)制备的粉剂。尤其是通过喷雾干燥法和/或喷雾干燥制粒方法获得的去垢剂碱是优选的。通过喷雾干燥法获得的去垢剂碱不限制制备条件。通过喷雾干燥方法获得的去垢剂碱是空心粒剂，这种空心粒剂是通过把抗热成分(如表面活性剂和增强去垢剂去垢作用的物质)的含水的结晶浆液喷雾至热空间之中获得。粒剂的大小为50至2000微米。在喷雾干燥之后，可以加入香料、酶、漂白剂、无机碱性的增强去垢剂去垢作用的物质。可通过如喷雾干燥制粒方法获得高密度、粒状的去垢剂碱，也可以在碱制备后添加各种成分。
当去垢剂碱是液体时，它可以是同质溶液或非同质的分散体。要通过纤维素酶除去去垢剂中的羧甲基纤维素的分解，合乎需要的是羧甲基纤维素在掺入组合物之前制成粒状或包衣。
在工业和家庭中可以和含纤维素的织物(例如脏织物)温育的本发明的去垢组合物使用在这些环境中通常使用的温度、反应时间以及液体比。培养条件，即用按照本发明的去垢组合物有效地处理含纤维素的织物的条件可由本领域技术人员容易地确定。因此，用本发明的去垢剂有效处理的适当条件和使用包括野生型纤维素酶的去垢组合物的条件一致。
如上所述，按照本发明的去垢剂还可在中间的pH值下(其中存在充足的活性以在磨损和降低的强度减小方面提供所需的改进)于适当的溶液中制成预洗涤剂。当去垢组合物是预浸渍(例如，预洗涤或预处理)组合物时(作为液体、喷雾、凝胶或糊状组合物)，基于预浸渍或预处理组合物的整个重量，通常使用大约0.0001％至大约1％(重量比)的截短的纤维素酶。在这样的组合物中，可有可无地使用表面活化剂，在使用时，表面活化剂通常基于预浸渍的整个重量以大约0.005％至大约20％(重量比)的浓度存在。组合物的其余部分包括用于用于预浸渍剂的常规组分，即常规浓度的稀释液、缓冲液、其它酶(蛋白酶)等。
本发明也涉及可在家庭中使用的包含上述的截短的纤维素酶的组合物用作适于给落色织物恢复颜色(参见，例如，美国专利4,738,682，通过参考其全部本文一并参考)以及用作去污剂的独一无二的组合物。
为了进一步说明本发明及其优点，给出了下列的特异性实施例，可以理解提供它们是为了说明本发明，在任何方面都不应解释为限制本发明的范围。
实施例实施例1EG1核心结构域使用其自身的启动子、终止子和信号序列的克隆和表达第1部分克隆通过质粒PUC218∷EG1.(参见图6)获得用于构建EG1核心结构域表达质粒(PEG1Δ3 pyr)的完整的eql1基因。把eql1的3终止区(作为300bp的BsmI-EcoRI片段与设计用终止密码子取代3内含子和纤维素结合结构域并继续用eql1终止子序列的合成接头一起)连接进PUC218(Korman，D等，Curr Genet，17203-212，1990)。以HindIII和BsmI消化产生的质粒PEG1T，通过电洗脱之后的琼脂糖凝胶电泳，从消化物中分离载体片段。从PUC218∷EG1作为2.3kb HindIII-SstI片段分离eql1基因启动子序列和eql1核心结构域，并和相同的合成接头片段与HindIII-BsmI消化的PEG1T连接以形成PEG1Δ3。
这些操作的结果是用53和55bp的合成的寡核苷酸取代3内含子和eql1的纤维素结合结构域。这就在丝氨酸415后放置了一个TAG终止密码子，其后用eql1终止子继续至BsmI位点。
接着，Trichoderma longibrachiatum可选择性标记pyr4从先前的克隆p219M(Smith等，1991)作为分离的1.6kb EcoRI-HindIII片段获得。它以三方连接方式和PUC18质粒(用EcoRI消化并使用小牛碱性磷酸酶脱磷酸化)、HindIII-EcoRI片段(包含得自PEG1Δ3的eql1核心结构域)连接以掺入最终表达质粒PEG1Δ3 pyr。
第2部分转化和表达从PEG1Δ3 pyr制得大规模的DNA制剂，通过制备凝胶电泳分离包含eql1核心结构域和pyr4基因的EcoRI片段。把分离的片段转化进quad缺失菌株1A52 pyrl3的尿苷营养缺陷型内(在美国专利申请07/770,049，08/048,728和08/048,881中描述，本文一并参考了其全部)，鉴别稳定的转化体。
为选择表达eql1核心结构域的转化体，转化体在有利于纤维素酶基因诱导的条件(Vogels+1％乳糖)下于振荡的培养瓶中生长。4-5天的生长之后，从上清液中浓缩蛋白质，或者1)在使用EGI多克隆抗体通过Western分析检测eql1核心结构域之前在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，或者2)使用RBB羧甲基纤维素作为内葡聚糖酶特异性底物直接分析浓缩的上清液，结果和作为对照的亲本菌株1A52比较。鉴别有可能产生截短的EGI核心结构域蛋白质的转化体候选者。在Vogels+1％乳糖上生长之后，从这些菌株中分离基因组DNA和总mRNA，然后使用仅包含eql1核心结构域的分离DNA片段进行Southern和Northern印迹实验。这些试验证明可以分离具有整合进1A52基因组的eql1核心结构域表达盒的拷贝的转化体，这些相同的转化体产生eql1核心结构域mRNA。
然后使用本领域熟知的用乳糖补充的适于在木霉属产生纤维素酶的培养基中于14L的发酵罐中培养一个转化体(Warzymoda，M.等，1984，法国专利2555603)。浓缩产生的肉汤，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离其中包含的蛋白质，通过Western分析鉴别eql1核心结构域蛋白质(参见下面的实施例3)。其后估计到发酵上清液中蛋白质的浓度为大约5-6g/L，其中大约1.7-4.4g/L是基于CMCase活性的EGI核心结构域。该值是基于进行的几个EGI核心发酵物的平均值。
以类似的方式，可以通过类似于上述的方法产生任何其它纤维素酶结构域或其衍生物。
实施例2EGI和EGfI催化核心的纯化第1部分EGI催化核心EGI核心以下列方式纯化。将浓缩的(UF)肉汤在pH 5.0的23mM醋酸钠中稀释至14mg/ml。向稀释的EGI核心肉汤中加入200g的微晶纤维素凝胶(FMC Bioproducts PH-101型)，然后在室温下混合45分钟。通过离心从肉汤中除去微晶纤维素，产生了富含EGI核心的溶液。然后该溶液使用用PM10膜(diaflo超滤膜，Amicon Cat#13132MEM 5468A)的Amicon搅拌细胞浓缩器缓冲交换进pH 7.5的10mM TES中。然后把EGI核心样品装载进阴离子交换柱中(Q-琼脂糖凝胶高流速，Pharmacia Cat#17-0510-01)，并以在pH 7.5的10mM TES中的0.5M NaCl的盐梯度洗脱。使用上述的Amicon搅拌细胞浓缩器组合并浓缩包含EGI核心的片断。
第2部分EGII催化核心EGII核心以下列方式纯化。使用硅藻土过滤浓缩的(UF)肉汤。向肉汤中加入硫酸铵至1M(NH4)2SO4的最终浓度，然后把这种混合物装载到疏水柱中(苯基琼脂糖凝胶高流速，Pharmacia，Cat#17-0965-01)。柱在以0.5M硫酸铵洗脱EGII核心之前用0.75M的硫酸铵洗涤。使用切向(tangential)流动超滤膜(Filtron Minisette超滤系统，cat FS018K01)和mega 10K膜(Filtron，cat#FS010K75)集中并浓缩包含核心的片断。对每1g浓缩的EGII核心加入100g微晶纤维素凝胶(FMC Bioproducts PH-101型)，混合40分钟。通过离心除去微晶纤维素，产生了富含EGII核心的溶液。
实施例3使用CBHII的启动子、终止子和信号序列克隆并表达CBHII核心结构域第1部分Trichoderma longibrachiatum常用表达质粒PTEX的构建质粒PTEX按照Sambrook等的方法(1989)，同上构建，在图7中说明。该质粒设计作为在丝状真菌Trichoderma longibrachiatum中使用的多目的表达载体。表达盒有几个独特的特征使其可用于这种功能。转录使用用于Trichoderma longibrachiatum的强CBHI基因启动子与终止子序列调节。在CBHI启动子与终止子之间，有用于插入所要表达的基因的单一PmeI和SstI限制位点。把Trichoderma longibrachiatum pyr4可选择性标志基因插入到CBHI终止子，可以使用单一NotI限制位点或单一NotI和NheI限制位点切割全表达盒(CBHI启动子插入位点-CBHI终止子-pyr4基因-CBHI终止子)。
该载体基于细菌载体pSL1180(Pharmacia公司，Piscataway，新泽西)，后者是带有扩展的多克隆位点的PUC型载体。本领域的技术人员可基于图7说明的流程图构建这个载体(也参见美国专利申请07/954,113，于1992年9月30日申请，标题为“使用内葡聚糖酶I和III石头洗涤斜纹粗棉布衣服”，构建PTEX表达质粒)。
构建类似于本发明所述的PTEX-截短的纤维素酶或其衍生物并包含任何取代截短的纤维素酶基因的DNA序列的其它片段的质粒是可能的。
第2部分 克隆用于构建CBHII核心结构域表达质粒的全cbh2基因PTEX CBHII核心从质粒PUC219∷CBHII(Korman，D.等，1990，当前遗传学，17203-212)。定位在cbh2基因的5末端的纤维素结合结构域方便地定位在XbaI和SnaBI限制位点之间。为了使用XbaI位点，破坏了多接头的另一个XbaI位点。用XbaI部分消化PUC219∷CBHII以使多数产物是线性的。使用T4 DNA聚合酶填充XbaI突出端并在有利于质粒自身连接的条件下共同连接。这有破坏平端位点(在50％的质粒中是多接头中的XbaI位点)的作用。鉴别这样的质粒并用XbaI和SnaBI消化以释放纤维素结合结构域。分离载体-CBHII核心结构域并用下列合成寡核苷酸(设计用于在接头结构域的信号肽酶裂解位点和木瓜蛋白酶裂解点连接XbaI位点和SnaBI位点。
XbaI SnaBI5 CTA GAG CGG TCG GGA ACC GCT AC 3 (SEQ ID No.42)3TC CTC GCC AGC CCT TGG CGA TG 5Leu Glu Glu Arg Ser Gly Thr Ala Thr (SEQ IDNo.43)用NheI消化产生的质粒pUCΔCBD CBHII。末端通过和T4 DNA聚合酶和dNTPs温育使其成为平端。在以BqlII和Nhe(平端)消化线性平端质粒DNA之后，分离包含CBHII信号序列和核心结构域的片段。
最终的表达质粒通过以下步骤工程处理用SstII和PmeI消化常用的表达质粒pTEX(在07/954,113中公开，本文一并参考了其全部和下述第三部分)，使用具有序列CGCTAG的合成寡核苷酸连接得自cbh1启动子的pUCΔCBD CBHII下游的CBHII NheI(平端)-BqlII片段以用SstII突出端填充BalII突出端。在图9中概述了形成的pTEC CBHII核心表达载体的构建。
以和上述实施例中所述的pTEX-CBHII核心类似的方式制备了pTEX-CBHII核心表达质粒。其构建在图8中图解说明。
第3部分转化和表达从PTEX CBHII制得大规膜的DNA制剂，通过制备凝胶电泳在cbh1转录因子和pyr4基因的控制下从其中分离包含CBHII核心结构域的NotI片段。把分离的片段转化进quad缺失菌株1A52 pyr13的尿苷营养缺陷型内并鉴别稳定的转化体。
为选择表达cbh2核心结构域的转化体，从在Vogels+1％乳糖上生长的菌株中分离基因组DNA，然后使用仅包含cbh2核心结构域的分离DNA片段进行Southern印迹实验。分离具有整合进1A52基因组的cbh2核心结构域表达盒的拷贝的转化体，在Vogels+1％乳糖上生长1天之后，从这两个菌株分离总mRNA，使用cbh2编码区作为探针使mRNA经受Northern分析。鉴别了表达cbh2核心结构域mRNA的转化体。
然后如先前实施例1所述在相同的条件下于14L的发酵罐中培养两个转化体。浓缩产生的肉汤，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离其中包含的蛋白质，通过Western分析鉴别CBHII核心结构域蛋白质。#15的转化体产生正确的和CBHII多克隆抗体大小与反应性的蛋白质。
其后估计到纯化后发酵上清液中蛋白质的浓度为10g/L，其中30-50％是CBHII核心结构域(参见实施例4)。
通过使用上述的方式，可以获得任何其它的新截短的纤维素酶核心结构域蛋白质或其衍生物。
实施例4CBHI和CBHII催化核心的纯化第1部分CBHI催化核心以下列方式从肉汤中纯化CBHI核心。使用硅藻土过滤CBHI核心超滤的(UF)肉汤并在pH 6.8的10mM TES中稀释至1.5mOhm的传导率。然后把稀释的CBHI核心装载进用pH 6.8的10mM TES平衡的阴离子交换柱中(Q-琼脂糖凝胶快流速，Pharmacia cat#17 17-0510-01)。使用在pH 6.8的10mMTES中的0至1M NaCl的梯度洗脱从肉汤中的多数其它蛋白质分离CBHI核心。然后在带有PM10膜的Amicon搅拌细胞浓缩器(diaflo超滤膜，Amiconcat#13132MEM 5468A)浓缩包含CBHI核心的片断。这一步骤浓缩核心，并另外作用于核心从低分子量蛋白质的分离。产生的片断比85％纯化的CBHI核心大。最纯的片断是检验为CBHI核心的序列。
第2部分CBHII催化核心因为其相似的生物化学性质，可以预计CBHII催化核心可以以类似于CBHII纤维素酶的方式纯化。CBHII核心的理论pI比pH值单位的一半小并比CBHII的pI低。另外，CBHII催化核心的分子量大约是CBHII的80％。因此，下列提出的纯化方案基于用于CBHII的纯化方法。把以硅藻土处理的超滤(UF)的CBHII核心肉汤稀释进pH 6.8的10mM TES至传导率＜0.7mOhm。然后稀释的CBHII核心装载进用pH 6.8的10mM TES平衡的阴离子交换柱中(Q-琼脂糖凝胶快流速，Pharmacia cat#17 17-0510-01)。使用在pH 6.8的10mM TES中的0至1M NaCl的盐梯度从柱中洗脱包含CBHII核心的片段。然后把包含CBHII核心的片段缓冲交换进2mM的琥珀酸钠缓冲液中并装载进阳离子交换柱中(SP-sephadex C-50)。接着以从0至100mMNaCl的盐梯度从柱中洗脱CBHII核心。
实施例5用截短的纤维素酶石头洗涤本实施例证明使用截短的纤维素酶催化核心9具体来说是截短的内葡聚糖酶催化核心)于石头洗涤过程中在和非截短的纤维素酶相当磨损的水平上令人惊奇地导致染料在含纤维素的织物(斜纹粗棉布)上减少的再沉积。而且，截短的CBH-型催化核心和非截短的EG-型纤维素酶的组合和相当磨损水平的非截短的结合相比导致显著改进的回染特征。斜纹粗棉布是染色的棉布。给斜纹粗棉布赋予石头洗涤的外观的方法在美国专利4,832,864和美国07/954,113在描述，本文一并参考了其全部。
用于本实施例的截短的纤维素酶催化核心和纤维素酶组分纯化如下a)按照在美国专利5,328,841中描述的方法纯化EGIII纤维素酶组分，本文一并参考了其说明书的全部。
b)通过实施例2的方法纯化截短的EGI催化纤维素酶核心。
c)通过实施例2的方法纯化截短的EGII催化纤维素酶核心。
d)按照实施例4的方法制备截短的CBHI催化核心。
e)以下列方式纯化EGI纤维素酶组分以用于石头洗涤应用。浓缩的(UF)肉汤在pH 5.0的25mM醋酸钠缓冲液稀释至7mg/ml蛋白质的浓度。向稀释的肉汤中加入450克微晶纤维素凝胶(FMC Bioproducts，PH-101型)，在室温下混合30分钟。通过离心从肉汤中除去微晶纤维素，产生丰富的EGI催化核心。
f)以下列方式纯化EGII纤维素酶组分以用于石头洗涤应用。浓缩的(UF)肉汤通过硅藻土过滤，使用带有Omega 10K膜(Filtron，cat.#FS010K75)的超滤单位(Filtron Minisette超滤系统，cat#FS018K01)缓冲交换进pH 7，0.4mOhm的柠檬酸盐-磷酸盐中。然后把这些物质装载进在上述柠檬酸盐-磷酸缓冲液中平衡的阴离子交换柱中(Q-琼脂糖凝胶快流速，Pharmacia，cat.#17-0510-01)。在柱流通中收集EGII，并使用上述的超滤单位缓冲交换进pH 3.25，0.5mOhms的柠檬酸钠中。然后把这些物质装载进阳离子交换柱中(SP-Spherodex LS，IBF Biotechnics，cat#262041)。然后以pH从3.25至5.4的线性梯度把EGII从柱中洗脱出来。合并包含EGII的片断，然后用于石头洗涤应用。
g)按照在实施例15的美国专利申请07/954,113所述的方法纯化CBHI纤维素酶组分。
单独或组合试验这些截短的纤维素酶催化核心结构域和纤维素酶组分赋予染色的斜纹粗棉布石头洗涤的外观的能力。具体来说，使用工业洗衣机和干燥器于下列条件下制备石头洗涤的斜纹粗棉布织物柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液 @pH 538L总体积120-135°F有相等重量的压载物的六双斜纹粗棉布裤子1小时处理时间15-30ppm EGI，EGII，EGIII；50ppm CBHI和CBHI催化核心；以及30-70ppm EGI催化核心和EGII催化核心。
去垢剂快速(post)洗涤包括在CBHI、CBHI催化核心、EGIII加CBHI以及EGIII加CBHI催化核心的情况下无增白剂的90克AATCC去垢剂。
通过五个专家小组评价织物的石头洗涤的外观(磨损)和染料在织物上的再沉积。使用由具有增长地增加磨损或再沉积水平的斜纹粗棉布样品组成的等级把织物分等。等级标号为1-10；1代表具有最小量的磨损或再沉积(去浆斜纹粗棉布)的牛仔裤，10代表高度磨损或再沉积的斜纹粗棉布。处理的牛仔裤的外观直接和等级的斜纹粗棉布样品相比以给出它们最相匹配的等级样品的数目。评价的结果在图10和11中显示。
如图10所示，截短的EGI催化核心和截短的EGII催化核心与它们未改进的天然状态的相对物在磨损和降低的再沉积上提供了明显优势。
如图11所示，把CBHI纤维素酶组分添加到EGIII中导致石头洗涤的轻微提高，而染料的向织物的回染(再沉积)有很大提高。然而，把截短的CBHI催化核心添加到EGIII溶液在提高的磨损和降低的再沉积中改进了效果。事实上，把截短的CBHI催化核心添加到EGIII纤维素酶中使再沉积降低到单独使用EGIII的水平之下。
如这些结果所示，在处理含纤维素的织物期间使用截短的纤维素酶核心令人惊奇地导致降低的回染，同时保持等同或更优的磨损水平。而且，当截短的纤维素酶单独使用或当它与另一种野生型或截短的纤维素酶混合使用时都可达到这些结果。这些结果是未预料到和令人惊奇的。
序 列 表(1)一般信息(i)申请人GENENCOR INTEMATIONAL公司(ii)发明名称新纤维素酶及其表达系统(iii)序列数43(iv)通讯地址(A)收信人Genencor Intemational(B)街道180 Kimball路(C)城市南旧金山(D)州CA(E)国家美国(F)邮区代码94080(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release#1.0，版本#1.25(vi)当前的申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(viii)律师/代理人信息(A)姓名Christopher L.Stone(B)登记号36,696(C)证书号GC226-2-PCT(ix)电信信息(A)电话(415)742-7555(B)传真(415)742-7217(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)长度96个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..96(xi)序列描述SEQ ID No.1GGC CAG TGC GGC GGT AR GGC TAC AGC GGC CCC ACG GTC TGC GCC AGC 48Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser1 5 10 15GGC ACA ACT TGC CAG GTC CTG AAC CCT TAC TAC TCT CAG TGC CTG TA 96Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu20 25 30(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.2Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser15 10 15Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu20 25 30(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征
(A)长度166个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位连接(1..20.70..166)(xi)序列描述SEQ ID No.3CAA GCT TGC TCA AGC GITC TG GTAATTATGT GAACCCTCTC AAGAGACCCA 50Gln Ala Cys Ser Ser Val Trp1 5AATACTGAGA TATGTCAAG G GGC CAA TGT GGT GGC CAG AAT TGG TCG GGT 100Gly Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Ser Gly10 15CCG ACT TGC TGT GCT TCC GGA AGC ACA TGC GTC TAC TCC AAC GAC TAT 148Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Val Tyr Ser Am Asp Tyr20 25 30TAC TCC CAG TGT CTT CCC 166Tyt Set Gln Cys Leu Pro35(2)SEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)长度39个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.4Gln Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Set15 10 15Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp20 25 30Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro35(2)SEQ ID No.5的信息(i)序列特征(A)长度159个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位连接(1..82，140..159)(xi)序列描述SEQ ID No.5CAC TGG GGG CAG TGC GGT GGC ATT GGG TAC AGC GGG TGC AAG ACG TGC 48His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Set Gly Cys Lys Thr Cys1 5 10 15ACG TCG GGC ACT ACG TGC CAG TAT AGC AAC GAC T GTTCGTATCC 92Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp20 25CCATGCCTGA CGGGAGTGAT TTTGAGATGC TAACCGCTAA AATACAG AC TAC TCG147Tyr Tyr Ser30CAA TGC CTT TA 159Gln Cys Leu(2)SEQ ID No.6的信息(i)序列特征(A)长度33个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.6His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys1 5 10 15Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys20 2530Leu(2)SEQ ID No.7的信息(i)序列特征(A)长度108个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..108(xi)序列描述SEQ ID No.7CAG CAG ACT GTC TGG GGC CAG TGT GGA GGT ATT GGT TGG AGC GGA CCT 48Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro15 10 15ACG AAT TGT GCT CCT GGC TCA GCT TGT TCG ACC CTC AAT CCT TAT TAT 96Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr20 25 30GCG CAA TGT ATT108Ala Gln Cys Ile35(2)SEQ ID No.8的信息(i)序列特征(A)长度36个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEC1 ID No.8Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro15 10 15Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Ash Pro Tyr Tyr20 25 30Ala Gln Cys Ile35(2)SEQ ID No.9的信息(i)序列特征(A)长度1453个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位连接(1..410，478..1174，1238..1453)(xi)序列描述SEQ ID No.9CAG TCG GCC TGC ACT CTC CAA TCG GAG ACT CAC CCG CCT CTG ACA TGG48Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp1 5 10 15CAG AAA TGC TCG TCT GGT GGC ACT TGC ACT CAA CAG ACA GGC TCC GTG96Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val20 25 30GTC ATC GAC GCC AAC TGG CGC TGG ACT CAC GCT ACG AAC AGC AGC ACG144Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr35 4045AAC TGC TAC GAT GGC AAC ACT TGG AGC TCG ACC CTA TGT CCT GAC AAC192Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn505560GAG ACC TGC GCG AAG AAC TGC TGT CTG GAC GGT GCC GCC TAC GCG TCC240Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser6570 75 80ACG TAC GGA GTT ACC ACG AGC GGT AAC AGC CTC TCC ATT GGC TTT GTC288Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe Val8590 95ACC CAG TCT GCG CAG AAG AAC GTT GGC GCT CGC CTT TAC CTT ATG GCG336Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala100 105 110AGC GAC ACG ACC TAC CAG GAA TTC ACC CTG CTT GGC AAC GAG TTC TCT384Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser115 120 125TTC GAT GTT GAT GTT TCG CAG CTG CC GTAAGTGACT TACCATGAAC 430Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro130 135CCCTGACGTA TCTTCTTGTG GGCTCCCAGC TGACTGGCCA ATTTAAG G TGC GGC484Cys GlyTTG AAC GGA GCT CTC TAC TTC GTG TCC ATG GAC GCG GAT GGT GGC GTG532Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val140 145 150 155AGC AAG TAT CCC ACC AAC ACC GCT GGC GCC AAG TAC GGC ACG GGG TAC580Ser Lys Tyr Pro Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr160 165170TGT GAC AGC CAG TGT CCC CGC GAT CTG AAG TTC ATC AAT GGC CAG GCC628Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala175 180 185AAC GTT GAG GGC TGG GAG CCG TCA TCC AAC AAC GCA AAC ACG GGC ATT676Asn Val Glu Gly Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile190 195 200GGA GGA CAC GGA AGC TGC TGC TCT GAG ATG GAT ATC TGG GAG GCC AAC724Gly Gly His Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn205210 215TCC ATC TCC GAG GCT CTT ACC CCC CAC CCT TGC ACG ACT GTC GGC CAG772Ser Ile Ser Glu Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln220225 230 235GAG ATC TGC GAG GGT GAT GGG TGC GGC GGA ACT TAC TCC GAT AAC AGA820Glu Ile Cys Glu Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Ang240 245 250TAT GGC GGC ACT TGC GAT CCC GAT GGC TGC GAC TGG AAC CCA TAC CGC868Tyr Gly Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg255 260 265CTG GGC AAC ACC AGC TTC TAC GGC CCT GGC TCA AGC TTT ACC CTC GAT916Leu Gly Asn Thr Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp270 275 280ACC ACC AAG AAA TTG ACC GTT GTC ACC CAG TTC GAG ACG TCG GGT GCC964Thr Thr Lys Lys Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala285290 295ATC AAC CGA TAC TAT GTC CAG AAT GGC GTC ACT TTC CAG CAG CCC AAC1012Ile Asn Arg Tyr Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn300305 310315GCC GAG CTT GGT AGT TAC TCT GGC AAC GAG CTC AAC GAT GAT TAC TGC1060Ala Glu Leu Gly Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys320 325 330ACA GCT GAG GAG GCA GAA TTC GGC GGA TCC TCT TTC TCA GAC AAG GGC1108Thr Ala Glu Glu Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly335 340 345GGC CTG ACT CAG TTC AAG AAG GCT ACC TCT GGC GGC ATG GTT CTG GTC1156Gly Leu Thr Gln Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val350 355 360ATG AGT CTG TGG GAT GAT GTGAGTTTGA TGGACAAACA TGCGCGTTGA 1204Met Ser Leu Trp Asp Asp365CAAAGAGTCA AGCAGCTGAC TGAGATGTTA CAG TAC TAC GCC AAC ATG CTG TGG1258Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp370 375CTG GAC TCC ACC TAC CCG ACA AAC GAG ACC TCC TCC ACA CCC GGT GCC1306Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala380 385 390GTG CGC GGA AGC TGC TCC ACC AGC TCC GGT GTC CCT GCT CAG GTC GAA1354Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu395 400 405TCT CAG TCT CCC AAC GCC AAG GTC ACC TTC TCC AAC ATC AAG TTC GGA1402Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly410 415 420CCC ATT GGC AGC ACC GGC AAC CCT AGC GGC GGC AAC CCT CCC GGC GGA1450Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly425430 435440AAC 1453Asn(2)SEQ ID No.10的信息(i)序列特征(A)长度441个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.10Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val20 25 30Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr35 4045Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn50 55 60Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser65 70 75 80Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe Val8590 95Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala100 105 110Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser115 120 125Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu130 135 140Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr145 150 155 160Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys165 170175Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp180 185190Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Ser195 200 205Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu Ala210 215 220Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly225 230 235 240Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys245250 255Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser260 265 270Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp ThrThr Lys Lys Leu275 280 285Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr290 295 300Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser305 310 315 320Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala325 330 335Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe340 345 350Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp355360 365Asp Thr Thr Pro Thr Cys Cys Gly Trp Thr Pro Pro Thr Arg Gln Thr370375 380Arg Pro Pro Pro His Pro Val Pro Cys Ala Glu Ala Ala Pro Pro Ala385 390395 400Pro Val Ser Leu Leu Arg Ser Asn Leu Ser Leu Pro Thr Pro Arg Ser405 410 415Pro Ser Pro Thr Ser Ser Ser Asp Pro Leu Ala Ala Pro Ala Thr Leu420 425430Ala Ala Ala Thr Leu Pro Ala Glu435440(2)SEQ ID No.11的信息(i)序列特征(A)长度1244个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征
(A)名称/关键词CDS(B)定位连接(1..161，218..465，556..1244)(xi)序列描述SEQ ID No.11TCG GGA ACC GCT ACG TAT TCA GGC AAC CCT TTT GTT GGG GTC ACT CCT48Ser Gly Thr Ala Thr Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Val Gly Val Thr Pro1 510 15TGG GCC AAT GCA TAT TAC GCC TCT GAA GTT AGC AGC CTC GCT ATT CCT96Trp Ala Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala Ile Pro202530AGC TTG ACT GGA GCC ATG GCC ACT GCT GCA GCA GCT GTC GCA AAG GTT144Ser Leu Thr Gly Ala Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val354045CCC TCT TTT ATG TGG CT GTAGGTCCTC CCGGAACCAA GGCAATCTGT191Pro Ser Phe Met Trp Leu50TACTGAAGGC TCATCATTCA CTGCAG A GAT ACT CTT GAC AAG ACC CCT CTC 242Asp Thr Leu Asp Lys Thr Pro Leu55 60ATG GAG CAA ACC TTG GCC GAC ATC CGC ACC GCC AAC AAG AAT GGC GGT290Met Glu Gln Thr Leu Ala Asp Ile Arg Thr Ala Asn Lys Asn Gly Gly657075AAC TAT GCC GGA CAG TTT GTG GTG ATA GAC TTG CCG GAT CGC GAT TGC338Asn Tyr Ala Gly Gln Phe Val Val Ile Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys80 85 90GCT GCC CTT GCC TCG AAT GGC GAA TAC TCT ATT GCC GAT GGT GGC GTC386Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu Tyr Ser Ile Ala Asp Gly Gly Val95 100 105 110GCC AAA TAT AAG AAC TAT ATC GAC ACC ATT CGT CAA ATT GTC GTG GAA434Ala Lys Tyr Lys Asn Tyr Ile Asp Thr Ile Arg Gln Ile Val Val Glu115120 125TAT TCC GAT ATC CGG ACC CTC CTG GTT ATT G GTATGAGTTT AAACACCTGC485Tyr Ser Asp Ile Arg Thr Leu Leu Val Ile130 135CTCCCCCCCC CCTTCCCTTC CTTTCCCGCC GGCATCTTGT CGTTGTGCTA ACTATTGTTC545CCTCTTCCAG AG CCT GAC TCT CTT GCC AAC CTG GTG ACC AAC CTC GGT 593Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Gly140 145ACT CCA AAG TGT GCC AAT GCT CAG TCA GCC TAC CTT GAG TGC ATC AAC641Thr Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Ile Asn150 155 160165TAC GCC GTC ACA GAG CTG AAC CTT CCA AAT GTT GCG ATG TAT TTG GAC689Tyr Ala Val Thr Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp170 175 180GCT GGC CAT GCA GGA TGG CTT GGC TGG CCG GCA AAC CAA GAC CCG GCC737Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Gln Asp Pro Ala185190 195GCT CAG CTA TTT GCA AAT GTT TAC AAG AAT GCA TCG TCT CCG AGA GCT785Ala Gln Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala200 205 210CTT CGC GGA TTG GCA ACC AAT GTC GCC AAC TAC AAC GGG TGG AAC ATT833Leu Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Asn Ile215 220 225ACC AGC CCC CCA TCG TAC ACG CAA GGC AAC GCT GTC TAC AAC GAG AAG881Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gln Gly Asn Ala Val Tyr Asn Glu Lys230 235 240245CTG TAC ATC CAC GCT ATT GGA CCT CTT CTT GCC AAT CAC GGC TGG TCC929Leu Tyr Ile His Ala Ile Gly Pro Leu Leu Ala Asn His Gly Trp Ser250 255 260AAC GCC TTC TTC ATC ACT GAT CAA GGT CGA TCG GGA AAG CAG CCT ACC977Asn Ala Phe Phe Ile Thr Asp Gln Gly Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr265 270275GGA CAG CAA CAG TGG GGA GAC TGG TGC AAT GTG ATC GGC ACC GGA TTT1025Gly Gln Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe280 285 290GGT ATT CGC CCA TCC GCA AAC ACT GGG GAC TCG TTG CTG GAT TCG TTT1073Gly Ile Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly Asp Ser Leu Leu Asp Ser Phe295300 305GTC TGG GTC AAG CCA GGC GGC GAG TGT GAC GGC ACC AGC GAC AGC AGT1121Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser310315 320 325GCG CCA CGA TTT GAC TCC CAC TGT GCG CTC CCA GAT GCC TTG CAA CCG1169Ala Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro Asp Ala Leu Gln Pro330 335 340GCG CCT CAA GCT GGT GCT TGG TTC CAA GCC TAC TTT GTG CAG CTT CTC1217Ala Pro Gln Ala Gly Ala Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Val Gln Leu Leu345 350 355ACA AAC GCA AAC CCA TCG TTC CTG TA 1244Thr Asn Ala Asn Pro Ser Phe Leu(2)SEQ ID No.12的信息(i)序列特征(A)长度365个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.12Ser Gly Thr Ala Thr Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Val Gly Val Thr Pro1 5 10 15Trp Ala Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala Ile Pro20 25 30Ser Leu Thr Gly Ala Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val354045Pro Ser Phe Met Trp Leu Asp Thr Leu Asp Lys Thr Pro Leu Met Glu50 55 60Gln Thr Leu Ala Asp Ile Arg Thr Ala Asn Lys Asn Gly Gly Asn Tyr65 707580Ala Gly Gln Phe Val Val Ile Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala85 90 95Leu Ala Ser Asn Gly Glu Tyr Ser Ile Ala Asp Gly Gly Val Ala Lys100 105 110Tyr Lys Asn Tyr Ile Asp Thr Ile Arg Gln Ile Val Val Glu Tyr Ser115120125Asp Ile Arg Thr Leu Leu Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu130135140Val Thr Asn Leu Gly Thr Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr145 150155 160Leu Glu Cys Ile Asn Tyr Ala Val Thr Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val165170175Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala180185190Asn Gln Asp Pro Ala Ala Gln Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala195 200 205Ser Ser Pro Arg Ala Leu Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr210215 220Asn Gly Trp Asn Ile Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gln Gly Asn Ala225 230 235 240Val Tyr Asn Glu Lys Leu Tyr Ile His Ala Ile Gly Pro Leu Leu Ala245 250 255Asn His Gly Trp Ser Asn Ala Phe Phe Ile Thr Asp Gln Gly Arg Ser260 265 270Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val275 280 285Ile Gly Thr Gly Phe Gly Ile Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly Asp Ser290 295300Leu Leu Asp Ser Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly305 310 315320Thr Ser Asp Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro325330 335Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Gln Ala Gly Ala Trp Phe Gln Ala Tyr340 345350Phe Val Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro Ser Phe Leu355 360 365(2)SEQ ID No.13的信息(i)序列特征(A)长度1201个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位连接(1..704，755..1201)(xi)序列描述SEQ ID No.13CAG CAA CCG GGT ACC AGC ACC CCC GAG GTC CAT CCC AAG TTG ACA ACC48Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr1 5 1015TAC AAG TGT ACA AAG TCC GGG GGG TGC GTG GCC CAG GAC ACC TCG GTG96Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gln Asp Thr Ser Val20 2530GTC CTT GAC TGG AAC TAC CGC TGG ATG CAC GAC GCA AAC TAC AAC TCG144Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser3540 45TGC ACC GTC AAC GGC GGC GTC AAC ACC ACG CTC TGC CCT GAC GAG GCG192Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala50 5560ACC TGT GGC AAG AAC TGC TTC ATC GAG GGC GTC GAC TAC GCC GCC TCG240Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser65 70 75 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GGC CTC GCC ACC ATG GGC AAG GCC CTG AGC AGC GGC ATG GTG 1012Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val300305 310CTC GTG TTC AGC ATT TGG AAC GAC AAC AGC CAG TAC ATG AAC TGG CTC 1060Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu315 320325 330GAC AGC GGC AAC GCC GGC CCC TGC AGC AGC ACC GAG GGC AAC CCA TCC 1108Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser335 340 345AAC ATC CTG GCC AAC AAC CCC AAC ACG CAC GTC GTC TTC TCC AAC ATC 1156Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile350 355360CGC TGG GGA GAC ATT GGG TCT ACT ACG AAC TCG ACT GCG CCC CCG 1201Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro365370 375(2)SEQ ID No.14的信息(i)序列特征(A)长度377个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.14Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr1 5 1015Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gln Asp Thr Ser Val20 2530Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser35 40 45Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala
50 55 60Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser6570 75 80Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gln Tyr Met Pro8590 95Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu100 105 110Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gln Glu Leu115 120 125Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser130 135 140Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gln Tyr Asn145 150 155 160Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro165 170 175Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gln Gly Phe180 185190Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala195 200 205Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys210 215220Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly225 230235 240Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Ile Thr Gln Phe Asn245 250 255Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Ile Thr Arg Lys260 265 270Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser Ala Gln Pro Gly Gly Asp275 280 285Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr290 295300Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp305 310 315 320Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly325330 335Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Asn340 345350Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly355 360 365Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro370 375(2)SEQ ID No.15的信息(i)序列特征(A)长度1158个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位连接(1..56，231..1158)(xi)序列描述SEQ ID No.15GGG GTC CGA TTT GCC GGC GTT AAC ATC GCG GGT TTT GAC TTT GGC TGT48Gly Val Arg Phe Ala Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys1 5 10 15ACC ACA GA GTGAGTACCC TTGTTTCCTG GTGTTGCTGG CTGGTTGGGC 96Thr Thr AspGGGTATACAG CGAAGCGGAC GCAAGAACAC CGCCGGTCCG CCACCATCAAGATGTGGGTG 156GTAAGCGGCG GTGTTTTGTA CAACTACCTG ACAGCTCACT CAGGAAATGAGAATTAATGG 216AAGTCTTGTT ACAGT GGC ACT TGC GTT ACC TCG AAG GTT TAT CCT CCG 264Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro20 2530TTG AAG AAC TTC ACC GGC TCA AAC AAC TAC CCC GAT GGC ATC GGC CAG 312Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile Gly Gln3540 45ATG CAG CAC TTC GTC AAC GAG GAC GGG ATG ACT ATT TTC CGC TTA CCT 360Met Gln His Phe Val Asn Glu Asp Gly Met Thr Ile Phe Arg Leu Pro50 55 60GTC GGA TGG CAG TAC CTC GTC AAC AAC AAT TTG GGC GGC AAT CTT GAT 408Val Gly Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp65 70 75TCC ACG AGC ATT TCC AAG TAT GAT CAG CTT GTT CAG GGG TGC CTG TCT456Ser Thr Ser lle Ser Lys Tyr Asp Gln Leu Val Gln Gly Cys Leu Ser808590CTG GGC GCA TAC TGC ATC GTC GAC ATC CAC AAT TAT GCT CGA TGG AAC504Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Val Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn95 100105110GGT GGG ATC ATT GGT CAG GGC GGC CCT ACT AAT GCT CAA TTC ACG AGC552Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser115 120 125CTT TGG TCG CAG TTG GCA TCA AAG TAC GCA TCT CAG TCG AGG GTG TGG600Leu Trp Ser Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp130 135140TTC GGC ATC ATG AAT GAG CCC CAC GAC GTG AAC ATC AAC ACC TGG GCT648Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala145 150 155GCC ACG GTC CAA GAG GTT GTA ACC GCA ATC CGC AAC GCT GGT GCT ACG696Ala Thr Val Gln Glu Val Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr160 165170TCG CAA TTC ATC TCT TTG CCT GGA AAT GAT TGG CAA TCT GCT GGG GCT744Ser Gln Phe Ile Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala175180 185 190TTC ATA TCC GAT GGC AGT GCA GCC GCC CTG TCT CAA GTC ACG AAC CCG792Phe Ile Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro195 200205GAT GGG TCA ACA ACG AAT CTG ATT TTT GAC GTG CAC AAA TAC TTG GAC840Asp Gly Ser Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp210215220TCA GAC AAC TCC GGT ACT CAC GCC GAA TGT ACT ACA AAT AAC ATT GAC888Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp225 230235GGC GCC TTT TCT CCG CTT GCC ACT TGG CTC CGA CAG AAC AAT CGC CAG936Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln240 245 250GCT ATC CTG ACA GAA ACC GGT GGT GGC AAC GTT CAG TCC TGC ATA CAA984Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile Gln255260265 270GAC ATG TGC CAG CAA ATC CAA TAT CTC AAC CAG AAC TCA GAT GTC TAT1032Asp Met Cys Gln Gln Ile Gln Tyr Leu Asn Gln Asn Ser Asp Val Tyr275280 285CTT GGC TAT GTT GGT TGG GGT GCC GGA TCA TTT GAT AGC ACG TAT GTC1080Leu Gly Tyr Val Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Val
290295 300CTG ACG GAA ACA CCG ACT AGC AGT GGT AAC TCA TGG ACG GAC ACA TCC 1128Leu Thr Glu Thr Pro Thr Ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser305 310315TTG GTC AGC TCG TGT CTC GCA AGA AAG TA 1158Leu Val Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys320 325(2)SEQ ID No.16的信息(i)序列特征(A)长度327个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.16Gly Val Arg Phe Ala Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys1 5 10 15Thr Thr Asp Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys20 25 30Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile Gly Gln Met Gln3540 45His Phe Val Asn Glu Asp Gly Met Thr Ile Phe Arg Leu Pro Val Gly50 55 60Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp Ser Thr65 70 75 80Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gln Leu Val Gln Gly Cys Leu Ser Leu Gly85 90 95Ala Tyr Cys Ile Val Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly100 105 110Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser Leu Trp115 120125Ser Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp Phe Gly130 135140Ile Met Asn Glu Pro His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Ala Thr145150 155 160Val Gln Glu Val Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln165170175Phe Ile Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile
180 185190Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro Asp Gly195 200 205Ser Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp210 215220Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp Gly Ala225 230 235 240Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln Ala Ile245250 255Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile Gln Asp Met260 265270Cys Gln Gln Ile Gln Tyr Leu Asn Gln Asn Ser Asp Val Tyr Leu Gly275 280 285Tyr Val Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Val Leu Thr290295300Glu Thr Pro Thr Ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu Val305 310 315 320Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys325(2)SEQ ID No.17的信息(i)序列特征(A)长度72个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..72(xi)序列描述SEQ ID No.17CGT GGC ACC ACC ACC ACC CGC CGC CCA GCC ACT ACC ACT GGA AGC TCT48Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser1 510 15CCC GGA CCT ACC CAG TCT CAC TAC72Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr20(2)SEQ ID No.18的信息(i)序列特征(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.18Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser1 5 10 15Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr20(2)SEQ ID No.19的信息(i)序列特征(A)长度129个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..129(xi)序列描述SEQ ID No.19GGC GCT GCA AGC TCA AGC TCG TCC ACG CGC GCC GCG TCG ACG ACT TCT 48Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser1 5 10 15CGA GTA TCC CCC ACA ACA TCC CGG TCG AGC TCC GCG ACG CCT CCA CCT 96Arg Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro
2025 30GGT TCT ACT ACT ACC AGA GTA CCT CCA GTC GGA 129Gly Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly35 40(2)SEQ ID No.20的信息(i)序列特征(A)长度43个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.20Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser15 10 15Arg Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro20 25 30Gly Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly35 40(2)SEQ ID No.21的信息(i)序列特征(A)长度81个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..81(xi)序列描述SEQ ID No.21CCC CCG CCT GCG TCC AGC ACG ACG TTT TCG ACT ACA CCG AGG AGC TCG 48Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser15 10 15ACG ACT TCG AGC AGC CCG AGC TGC ACG CAG ACT 81Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr20 25(2)SEQ ID No.22的信息(i)序列特征(A)长度27个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.22Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser1 5 10 15Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr20 25(2)SEQ ID No.23的信息(i)序列特征(A)长度102个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)姓名/关键词CDS(B)定位1..102(xi)序列描述SEQ ID No.23CCG GGA GCC ACT ACT ATC ACC ACT TCG ACC CGG CCA CCA TCC GGT CCA 48Pro Gly Ala Thr Thr Ile Thr Thr Set Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro15 10 15ACC ACC ACC ACC AGG GCT ACC TCA ACA AGC TCA TCA ACT CCA CCC ACG 96Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr20 25 30AGC TCT 102Ser Ser(2)SEQ ID No.24的信息(i)序列特征(A)长度34个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.24Pro Gly Ala Thr Thr Ile Thr Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro15 10 15Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr20 25 30Ser Ser(2)SEQ ID No.25的信息(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)姓名/关键词CDS(B)定位1..51(xi)序列描述SEQ ID No.25ATG TAT CGG AAG TTG GCC GTC ATC TCG GCC TTC TTG GCC ACA GCT CGT 48Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg1 5 10 15GCT 51Ala(2)SEQ ID No.26的信息(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.26Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg1 5 10 15Ala(2)SEQ ID No.27的信息(i)序列特征(A)长度72个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)姓名/关键词CDS(B)定位1..72(xi)序列描述SEQ ID No.27ATG ATT GTC GGC ATT CTC ACC ACG CTG GCT ACG CTG GCC ACA CTC GCA 48Met Ile Val Gly Ile Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala1 5 10 15GCT AGT GTG CCT CTA GAG GAG CGG 72Ala Ser Val Pro Leu Giu Glu Arg20(2)SEQ ID No.28的信息(i)序列特征(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.28Met Ile Val Gly Ile Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala1 5 1015Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg20(2)SEQ ID No.29的信息(i)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)姓名/关键词CDS(B)定位1..66(xi)序列描述SEQ ID No.29ATG GCG CCC TCA GTT ACA CTG CCG TTG ACC ACG GCC ATC CTG GCC ATT 48Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile15 10 15GCC CGG CTC GTC GCC GCC 66Ala Arg Leu Val Ala Ala20(2)SEQ ID No.30的信息(i)序列特征(A)长度22个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.30Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile1510 15Ala Arg Leu Val Ala Ala20(2)SEQ ID No.31的信息(i)序列特征(A)长度63个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)姓名/关键词CDS(B)定位1..63(xi)序列描述SEQ ID No.31ATG AAC AAG TCC GTG GCT CCA TTG CTG CTT GCA GCG TCC ATA CTA TAT 48Met Asn Lys Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ile Leu Tyr1510 15GGC GGC GCC GTC GCA 63Gly Gly Ala Val Ala20(2)SEQ ID No.32的信息(i)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.32Met Asn Lys Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ile Leu Tyr1 5 10 15Gly Gly Ala Val Ala20(2)SEQ ID No.33的信息(i)序列特征(A)长度777个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID No.33AAACCAGCTG TGACCAGTGG GCAACCTTCA CTGGCAACGG CTACACAGTCAGCAACAACC 60TTTGGGGAGC ATCAGCCGGC TCTGGATTTG GCTGCGTGAC GGCGGTATCGCTCAGCGGCG 120GGGCCTCCTG GCACGCAGAC TGGCAGTGGT CCGGCGGCCA GAACAACGTCAAGTCGTACC 180AGAACTCTCA GATTGCCATT CCCCAGAAGA GGACCGTCAA CAGCATCAGCAGCATGCCCA 240CCACTGCCAG CTGGAGCTAC AGCGGGAGCA ACATCCGCGC TAATGTTGCGTATGACTTGT 300TCACCGCAGC CAACCCGAAT CATGTCACGT ACTCGGGAGA CTACGAACTCATGATCTGGT 360AAGCCATAAG AAGTGACCCT CCTTGATAGT TTCGACTAAC AACATGTCTTGAGGCTTGGC 420AAATACGGCG ATATTGGGCC GATTGGGTCC TCACAGGGAA CAGTCAACGTCGGTGGCCAG 480AGCTGGACGC TCTACTATGG CTACAACGGA GCCATGCAAG TCTATTCCTTTGTGGCCCAG 540ACCAACACTA CCAACTACAG CGGAGATGTC AAGAACTTCT TCAATTATCT CCGAGACAAT600AAAGGATACA ACGCTGCAGG CCAATATGTT CTTAGTAAGT CACCCTCACTGTGACTGGGC 660TGAGTTTGTT GCAACGTTTG CTAACAAAAC CTTCGTATAG GCTACCAATT TGGTACCGAG720CCCTTCACGG GCAGTGGAAC TCTGAACGTC GCATCCTGGA CCGCATCTAT CAACTAA777(2)SEQ ID No.34的信息(i)序列特征(A)长度218个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.34Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr1 5 10 15Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys20 2530Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp354045Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln5055 60Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro65 70 7580Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val859095Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser100 105110Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly115 120125Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp130 135140Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val145 150 155160Ala Gln Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe165 170 175Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val180 185 190Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu195 200 205Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn210215(2)SEQ ID No.35的信息(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID No.35ATGAAGTTCC TTCAAGTCCT CCCTGCCCTC ATACCGGCCG CCCTGGCCC49(2)SEQ ID No.36的信息(i)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.36Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala1 5 10 15(2)SEQ ID No.37的信息(i)序列特征(A)长度57个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)
(xi)序列描述SEQ ID No.37AGCTCGTAGA GCGTTGACTT GCCTGTGGTC TGTCCAGACG GGGGACGATA GAATGCG57(2)SEQ ID No.38的信息(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID No.38GTCACCTTCT CCAACATCAA GTTCGGACCC ATTGGCAGCA CCGGCTAA48(2)SEQ ID No.39的信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID No.39GGGGTTTAAA CCCGCGGGGA TT22(2)SEQ ID No.40的信息(i)序列特征(A)长度15个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID No.40TGAGCCGAGG CCTCC 15(2)SEQ ID No.41的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID No.41AGCTTGAGAT CTGAAGCT 18(2)SEQ ID No.42的信息(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID No.42CTAGAGGAGC GGTCGGGAAC CGCTAC 26(2)SEQ ID No.43的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID No.43Leu Glu Glu Arg Ser Gly Thr Ala Thr1 权利要求
1.一种用纤维素酶处理含纤维素的织物的方法，该方法包括以下步骤(a)把所说的含纤维素的织物和包含有效量的截短的纤维素酶、截短的纤维素酶衍生物或无纤维素结合结构域的天然产生的纤维素酶的处理组合物相接触；(b)在有效地处理所说的织物的条件下，温育与所说的截短的纤维素酶或纤维素酶衍生物接触的所说的含纤维素的织物。
2.按照权利要求1的方法，其中所说的截短的纤维素酶包含截短的纤维素酶核心或其衍生物。
3.按照权利要求2的方法，其中所说的纤维素酶核心包括选自由EGI型核心、EGII型核心、CBHI型核心、CBHII型核心、EGV型核心及其衍生物组成的组的截短的纤维素酶。
4.按照权利要求1的方法，其中所说的处理组合物还包含EGIII。
5.按照权利要求1的方法，其中所说的含纤维素的织物包括含棉织物。
6.按照权利要求5的方法，其中所说的含棉织物包括染色的斜纹粗棉布。
7.按照权利要求1的方法，其中所说的处理组合物包含大约0.1至大约1,000ppm的总蛋白质浓度的截短的纤维素酶或截短的纤维素酶衍生物。
8.按照权利要求1的方法，其中所说的处理组合物包含大约0.2至大约500ppm的总蛋白质浓度的截短的纤维素酶或截短的纤维素酶衍生物。
9.按照权利要求1的方法，其中所说的截短的纤维素酶或其衍生物来自微生物(真菌或细菌)。
10.按照权利要求9的方法，其中所说的真菌是木霉属的一个种(Trichoderma sp.)。
11.按照权利要求10的方法，其中所说的木霉属的一个种是Trichoderma longibrachiatum。
12.按照权利要求1的方法，其中所说的处理方法包括石头洗涤含纤维素的织物，所说的处理组合物包括石头洗涤组合物。
13.按照权利要求12的方法，其中所说的含纤维素的织物是染色的。
14.按照权利要求13的方法，其中所说的染色织物是染色的斜纹粗棉布。
15.按照权利要求12的方法，该方法包括另一个步骤在所说的处理步骤之前或之后同时用浮石处理所说的织物。
16.按照权利要求12的方法，其中所说的石头洗涤组合物包含截短的纤维素酶核心或其衍生物。
17.按照权利要求16的方法，其中所说的截短的纤维素酶核心选自由EGI型核心、EGII型核心、EGV型核心、CBHI型核心、CBHII型核心及其衍生物组成的组。
18.按照权利要求16的方法，其中所说的截短的纤维素酶核心以大约10至大约400ppm的总蛋白质浓度存在。
19.按照权利要求16的方法，其中所说的截短的纤维素酶核心以大约20至大约100ppm总蛋白质浓度存在。
20.按照权利要求1的方法，其中所说的处理方法包括洗涤含纤维素的织物，所说的处理组合物是包含表面活化剂的去垢组合物。
21.按照权利要求20的方法，其中所说的表面活化剂包括非离子的乙氧基化的烷基酚或非离子乙氧基化的醇。
22.按照权利要求20的方洗其中所说的处理组合物包含截短的纤维素酶核心或其衍生物。
23.按照权利要求22的方法，其中所说的截短的纤维素酶核心选自由EGI型核心、EGII型核心、EGV型核心、CBHI型核心、CBHII型核心及其衍生物组成的组。
24.按照权利要求22的方法，其中所说的截短的纤维素酶核心或其衍生物以大约0.1至大约1000ppm的浓度存在。
25.按照权利要求22的方法，其中所说的截短的纤维素酶核心或其衍生物以大约0.2至大约500ppm的浓度存在。
26.一种处理含纤维素的织物的组合物，该组合物包含截短的纤维素酶或其衍生物。
27.按照权利要求26的组合物，其中所说的截短的纤维素酶或其衍生物包括截短的纤维素酶核心。
28.权利要求27的组合物，其中所说的截短的纤维素酶核心选自有CBHI型核心、CBHII型核心、EGI型核心、EGII型核心、EGV型核心及其衍生物组成的组。
29.按照权利要求26的组合物，其中所说的组合物在石头洗涤含纤维素的织物上有用，并包含表面活化剂。
30.按照权利要求29的组合物，其中所说的截短的纤维素酶核心或其衍生物以大约1至大约1000ppm的总蛋白质浓度存在。
31.按照权利要求26的组合物，其中所说的组合物作为去垢剂有用，并包含表面活化剂。
32.按照权利要求31的组合物，其中所说的表面活化剂包括非离子的乙氧基化的烷基酚或非离子乙氧基化的醇。
33.按照权利要求31的组合物，其中所说的截短的纤维素酶核心以大约0.1至大约1000ppm的总蛋白质浓度存在。
34.按照权利要求26的组合物，其中所说的处理组合物被配制成预浸渍剂。
35.一种通过权利要求1的方法产生的织物。
36.一种通过权利要求12的方法产生的织物。
37.一种通过权利要求20的方法产生的织物。
38.权利要求35的织物，其中所说的织物包括染色的斜纹粗棉布。
全文摘要
本发明公开了用纤维素酶处理含纤维素的织物的改进方法,该方法包括把纤维素织物与截短的纤维素酶相接触。本发明还公开了用本发明的纤维素酶核心结构域处理含纤维素的织物的方法,这种方法有降低染料再沉积和增加磨损的特殊优点。
文档编号C12N1/15GK1172511SQ96191739
公开日1998年2月4日 申请日期1996年1月29日 优先权日1995年2月1日
发明者T·福勒, K·A·克拉克森, M·瓦尔德, K·D·科里尔, E·拉里纳斯 申请人:金克克国际有限公司