专利名称：一种药物组合物、其制备方法及其在制备治疗sars及其并发症药物方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物、其制备方法及其用途，具体地说，涉及一种由从除人以外的哺乳动物肌肉组织中提取的活性多肽和从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂及从除人以外的哺乳动物心肌组织中提取的次黄嘌呤制备的药物组合物、其制备方法及其在制备治疗SARS以及治疗心肌和脑部疾病引起的功能障碍方面的药物用途。
背景技术：
神经节苷脂是一种含唾液酸的鞘糖脂类，其一个或多个末端糖基是N-乙酰基神经酸即唾液酸。脑灰质的膜脂中含神经节苷脂高达6％以上，在神经的传导中起着重要作用。
神经节苷脂的临床药用价值有用于各种原因引起的中枢神经系统结构损害的功能恢复；用于脑血管意外创伤及创伤后的中枢神经系统后遗症的治疗；用于缺血性和出血性脑病变的治疗。
目前上市的神经节苷脂类药物有阿根廷生产的施捷因，为单唾液酸四己糖神经节苷脂钠盐注射液，其由基因工程方法生产，为单一组分，不含活性多肽，不太利于吸收和利用。
意大利Fidia公司从牛脑组织中提取的单唾液酸四己糖基神经节苷脂(GM1)注射液(商品名Sygen)已于20世纪90年代正式在我国销售。
中国专利申请93112578公开了一种脑保健营养品、其制造方法和用途，该保健品为含有神经节苷脂的营养液，其制造方法主要使用水、氯仿、酒精提取，其用途在于增强人脑的学习、记忆功能，促进人脑的正常发育和脑损伤后的恢复。
中国专利申请95111569公开了一种含神经节苷脂为主的糖脂类物质的生产方法，包括粉碎、溶剂提取、过滤和浓缩，其特征是将干净的动物脑经粉碎，加入40-100％含量的酒精和石油醚提取，或者在干净的动物脑中加入40～100％含量的酒精后粉碎，加入石油醚提取，上述提取物过滤，清液浓缩，所述的动物脑、酒精和石油醚的重量比是1∶1～20∶0.5～8。
中国专利申请00133077公开了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺。
生物体内，小分子多肽、氨基酸广泛参与各种生化过程，包括各种物质的合成、物质的转运、信息物资的生成与传递，同时为所有的生命活动提供能量，尤其是对脑组织更为重要。次黄嘌呤是参与人体生命活动的重要物质，次黄嘌呤与小分子多肽、氨基酸配合，有促进机体代谢作用，对心血管系统疾病有改善血液循环障碍、降低血管阻力、增加心肌利用氧等作用，能促进造血系统活动增强，白血球数量增多，同时有增加血管弹性、防止血管硬化作用。
从国内外文献报道的提取神经节苷脂的方法看，多采用不同比例有机溶剂抽提总脂，然后用分配萃取方法提取神经节苷脂混合物，再用离子交换层析、分子排阻及硅胶层析法分离神经节苷脂。
有报道，将组织匀浆用氯仿-甲醇溶液抽提、离心，上清液加水萃取、蒸干得粗脂。将粗脂溶于甲醇，过阴离子交换柱，收集神经节苷脂。
另有报道，将组织加入氯仿-甲醇溶液抽提，抽提液浓缩、旋转蒸干得总脂。将总脂加入异丙醚-正丁醇溶剂溶解后用氯化纳溶液萃取、离心，水相为酸性鞘糖脂提取物。冻干粗脂过Sepbadex G-50柱层析，收集混合神经节苷脂组分冻干。
目前，脑组织提取物类如脑复素注射液、活脑素注射液、脑组织注射液、热藏大脑注射液、脑多肽注射液等，均为由各类脑组织蛋白水解制成，含神经组织活性多肽，但神经节苷脂检测不出，因为上述品种一般每毫升含脑组织0.5克左右，含量太低。
兔肉提取物类及兔心提取物类，如心血通注射液，系由兔肌肉、兔心肌水解制成，每毫升含兔肌肉不足1克，且只含肌肉组织活性多肽，而且活性较低。
专利申请01126465公开了一种治疗神经系统疾病的药物和保健品，含有神经节苷脂和银杏叶提取物，提供了神经节苷脂作为组合物组分，与其它组分协同发挥作用的药物组合物。
目前已公开的脑提取液中的神经节苷脂的含量均较低，而且虽然也有神经节苷脂作为组合物组分，与其它组分协同发挥作用的药物组合物的公开报道，但仍未有其与动物其他机体组织协同发挥作用的相关报道。
通常医学上的非典型肺炎(Atypical pneumonias)是指一组具有类似肺炎临床表现、胸部X线特征和对抗生素治疗有反应的肺炎。但自2002年11月在我国广东地区发现、并在世界上20几个国家陆续发生，导致全球数百人死亡的非典型肺炎具有极强的传染性，国内将其称为传染性非典型肺炎，2003年2月，WHO将其命名为重症急性呼吸综合症(Severe actue respiratory syndrome SARS)。世界卫生组织2003年4月16日在日内瓦正式确认，冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体。SARS病人的免疫功能明显下降，在短时间内病情急转直下，有些病人从发病到死亡只有短短数天，并有不少老年病人死于SARS引起的心脑血管并发症。可见，迅速开发有效预防和治疗“SARS”的药物对于控制疾病的流行、治疗患者以及人类战胜疾病都是非常重要并非常有意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由从除人以外的哺乳动物肌肉组织中提取的活性多肽和从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂及从除人以外的哺乳动物心肌组织中提取的次黄嘌呤制备的药物组合物。
本发明的另一目的在于提供该药物组合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供药物组合物在制备治疗SARS以及SARS并发症药物方面的用途。
本发明的再一目的是提供药物组合物在制备治疗心肌或脑部疾病引起的功能障碍方面药物的用途。
本发明还涉及药物组合物在制备治疗老年性痴呆、脑血管意外创伤及创伤后的中枢神经系统后遗症、冠心病、心绞痛、心肌疾病、脑血管病、以及缺血性和出血性脑病变治疗药物上的用途。
本发明所述的一种药物组合物，其中含有动物肌肉组织提取物和脑组织提取物及动物心肌组织提取物，脑组织提取物中含有单唾液酸四己糖基神经节苷脂(GM1)、双唾液酸四己糖基神经节苷脂、三唾液酸四己糖基神经节苷脂与活性多肽，肌肉组织提取物中含有活性多肽，该活性多肽分子量由0.3um滤膜在过滤时控制，动物心肌组织提取物中含有次黄嘌呤。
本发明所述的药物组合物，其特征在于含有从除人以外的哺乳动物肌肉组织中提取的活性多肽和从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂及从除人以外的哺乳动物心肌组织中提取的次黄嘌呤，其中唾液酸的浓度为0.01～0.5mg/ml，活性多肽重量为神经节苷脂中唾液酸的6.1～100倍，次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸的1～100倍。
优选的为药物组合物中唾液酸的浓度为0.02～0.2mg/ml，活性多肽重量为神经节苷脂中唾液酸的50～80倍，更优选为60～70倍，最优选的为64倍；药物组合物中次黄嘌呤的重量为神经节苷脂中唾液酸的1～20倍，更优选的为2～10倍，最优选的为5倍。
哺乳动物中枢神经系统中的神经节苷脂含量丰富，例如可从猪、狗、牛、羊、鹿、马、兔等新鲜脑组织中提取含有神经节苷脂的物质，上述哺乳动物的肌肉组织可以提取活性多肽，上述哺乳动物的心肌组织可以提取次黄嘌呤。
上述哺乳动物肌肉组织优选为兔肌肉组织。
上述哺乳动物脑组织优选为牛脑组织。
上述哺乳动物心肌组织优选为兔心肌组织。
兔肉组织和兔心肌组织用来治疗心肌疾病有比较显著的疗效，而且从生产过程的可操作性和有效利用率方面考虑，可优选用兔肉来提取活性多肽，兔心肌来提取次黄嘌呤；本发明优选牛脑来提取神经节苷脂，不仅要使神经节苷脂达到一定的量，还要从牛脑组织中提取一部分活性多肽，这部分活性多肽在治疗心、脑疾病方面起着不可忽视的作用。
因此，从生产成本、生产工艺、产品质量稳定性、临床疗效等因素考虑，优选牛脑组织和兔肉组织及兔心肌组织作为生产原料。
上述动物肌肉组织可以是动物的任意部位肌肉。
一种制备所述的药物组合物的方法，其特征在于包括如下步骤(1)肌肉提取液的制备A)将动物任意部位肌肉组织加水匀浆后冷藏，然后过滤除渣，保留滤液；B)滤液在中性条件下保温酶解；C)水解液离心除沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，得滤液，即为肌肉提取液；(2)脑提取液的制备A)将动物脑组织加溶剂匀浆后过滤，滤渣用溶剂抽提提取，提取液与滤液合并后蒸干，得干燥物；B)将干燥物溶于溶剂中，向其中加入盐的水溶液提取分液；C)分液的上、下层液相分别用至少两种溶剂的混合水溶液洗涤，合并洗涤后的上层液相部分，减压浓缩，然后用预冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；D)将干燥物溶于至少两种溶剂的混合水溶液，层析柱分离，洗脱液浓缩后用预冷丙酮沉淀、分离，得到的沉淀经后处理，得到神经节苷脂溶液；(3)心肌提取液的制备A)将动物心肌组织加水匀浆后保温，匀浆液调节呈酸性，加热离心后，过滤，保留滤液；B)将滤液调节呈碱性，加热离心后，过滤，保留滤液；C)将滤液调节呈中性，加热离心除沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，得滤液，为心肌提取液；(4)将上述提取液混合，使混合液中多肽的重量为神经节苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸重量的1～100倍，经后处理，得成品制剂。
其中，肌肉提取液的制备过程中，加1.6～2.5倍重量水匀浆，匀浆后在低于10℃下冷藏，用尼龙布过滤。
酶解采用霉菌蛋白酶，控制pH为中性条件下加热保温水解。
水解液离心沉淀后，上清液过0.3um滤膜，得多肽含量为0.5～15mg/ml的肌肉提取液。
在脑提取液的制备过程中，匀浆所用溶剂为丙酮，滤渣用氯仿-甲醇(1～20∶1～20，V/V)的混合液充分抽提，合并的滤液用旋转蒸发器蒸干，得干燥物。
溶解干燥物的溶剂为体积比为2～30∶1～20的卤代烃和醇的混合溶剂，盐的水溶液优选KCl水溶液。
分液的上、下层液相分别用卤代烃和醇的混合水溶液洗涤，减压浓缩至初始体积的1/8～1/2，然后用低于0℃预冷丙酮沉淀。
将干燥物溶于卤代烃和醇的混合水溶液，用卤代烃和醇的混合水溶液梯度洗脱柱层析分离。
在心肌提取液的制备中，加1～2.5倍重量水匀浆，匀浆后在37℃左右保温，匀浆液调节呈酸性，PH值4左右，加热离心除沉淀，过滤除杂；再将滤液调节呈碱性，PH值8左右，加热离心除沉淀，过滤除杂；再将滤液调节呈中性，加热热离心除沉淀，上清液用0.3um微孔滤膜过滤，得次黄嘌呤含量为0.1～5mg/ml的心肌提取液。
更具体地说，本发明的制备方法包括(1)肌肉提取液的制备A)步骤中将动物任意部位肌肉组织加1.6～2.5倍重量水匀浆，匀浆液加水稀释后，在4～8℃冷藏12～16小时，使用80目的尼龙布过滤，保留滤液；B)滤液中加入霉菌蛋白酶保温水解，霉菌蛋白酶浓度为0.03～0.5％，水解条件为pH＝7.2～7.6，保温39～45℃，保温时间为2～4小时；C)水解液离心，离心条件为3000转/分，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液；即为肌肉提取液，其中多肽含量为0.5～15mg/ml；(2)脑提取液的制备A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/8～1/2，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)将干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5mL/分钟，用氯仿-甲醇-水(60～90∶15～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(40～80∶20～50∶5～15，V/V/V)混合液8～15L洗脱，收集后洗脱液6～12L，减压浓缩后用3～5倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得脑提取液，浓度为每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)心肌提取液的制备A)将动物心肌组织加1～2.5倍重量水匀浆，匀浆液在35～45℃保温3～6小时，匀浆液调节PH值3.8～4.2，加热70～90℃，保温15～30分钟，然后在2～8℃下离心，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；
B)将滤液调节PH值7.6～8.0，加热70～90℃，保温15～30分钟，在2～8℃下离心，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；C)将滤液调节PH值6.8～7.2，加热70～90℃，保温15～30分钟，在2～8℃下离心，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液，为心肌提取液，其中次黄嘌呤含量为0.1～5mg/ml；(4)将上述提取液混合，使混合液中多肽的重量为神经节苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸重量的1～100倍，经后处理，得成品制剂。
更为优选的，本发明的制备方法包括如下步骤(1)肌肉提取液的制备A)将动物任意部位肌肉组织加1.6～2.5倍重量水匀浆，匀浆液加水稀释后，在4～8℃冷藏12～16小时，使用80目的尼龙布过滤，保留滤液；B)在滤液中加入霉菌蛋白酶保温水解，霉菌蛋白酶浓度为0.1％，水解条件为PH＝7.2～7.6，保温45℃，保温时间为2.5小时；C)水解液离心，离心条件为3000转/分，离心时间为20分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液；滤液减压浓缩得浓缩液，即为肌肉提取液，其中多肽含量为0.5～15mg/ml；(2)脑提取液的制备A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/4，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)将干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5mL/分钟，用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液20L洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脱，收集后洗脱液10L，减压浓缩后用4倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得脑提取液，浓度为每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)心肌提取液的制备A)将动物心肌组织加1～2.5倍重量水匀浆，匀浆液在37～42℃保温4～6小时，匀浆液调节PH值3.9～4.1，加热80～90℃，保温20～25分钟，在4～8℃下离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为20～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；B)将滤液调节PH值7.7～7.9，加热80～90℃，保温20～25分钟，在4～8℃下离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为20～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；C)将滤液调节PH值6.8～7.2，加热80～90℃，保温20～25分钟，在4～8℃下离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为20～30分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液，为心肌提取液，其中次黄嘌呤含量为0.1～5mg/ml；(4)将上述提取液混合，使混合液中多肽的重量为神经节苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸重量的1～100倍，经后处理，得成品制剂。
上述步骤(1)的B)中，使用的霉菌蛋白酶为常规市售产品，为了使本发明生产工艺、产品质量稳定，应尽可能由固定生产商提供；水解时，pH值的控制可用饱和Ca(OH)2溶液来调整。
上述步骤(1)的C)中，上清液过0.3um滤膜为肌肉提取液中的活性多肽分子量的控制步骤。使用的0.3um滤膜为市售产品，其生产商应为国家认可的生产单位，使用的滤膜型号与尺寸可根据具体的生产量、选用的过滤器尺寸来确定。
上述步骤(2)的B)中，氯仿-甲醇混合液加入量以完全溶解干燥物为准。
上述步骤(2)中丙酮的加入量以不再有沉淀析出为准。
上述步骤(2)的D)中，所用的层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选60～80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即得。其中优选的氯仿-甲醇混合比为9∶1(V/V)。
本发明的减压蒸发的压力控制在0.04～0.08MPa左右。
上述步骤(3)中的A)中，匀浆液保温温度优选控制在37～42℃，为使温度稳定可采取夹层水浴保温的方法，保温结束后应调节pH4.0左右后再加热。
上述步骤(3)中的B)中，优选pH值调节控制在7.8左右后再加热，加热结束后迅速降温，以使沉淀和杂质充分析出。
上述步骤中调节pH值采用本领域常用技术和试剂，比如，调整pH值至酸性，一般加5～20％的盐酸，调整至碱性，一般加5～20％的NaOH。
上述步骤(4)中成品制剂的剂型为药剂学上可接受的剂型，比如片剂、胶囊、口服液、小容量注射剂、大输液或冻干粉针等，优选为小容量注射剂、大输液或冻干粉针，最优选为小容量注射剂。因此，所述步骤(3)所述的后处理可以是按照制备药剂学上可接受的剂型的常规方法进行。
本发明的制备方法采用硅胶柱一步纯化得混合神经节苷脂，先减压浓缩后用预冷丙酮沉淀，真空干燥后溶于蒸馏水，作为脑提取物备用，使制得的提取物有效成分收率较高，组分更合理，同时也节省了操作时间，降低了原辅料消耗。神经节苷脂具有感知、传递细胞内外信息的功能，参与细胞的识别、粘着、生长、分化以及细胞信息传递等过程。作为某些神经递质、激素、病毒和干扰素的受体，具有参与神经组织的分化、再生、修复，与神经冲动的传导、细胞间的识别作用。能加速损伤的神经组织的再生修复，促进神经支配功能恢复，减低兴奋性氨基酸的释放，从而减轻细胞毒性和血管水肿，是脑血管意外治疗的良药，用于治疗老年性痴呆及其它神经性疾病取得良好疗效。
本发明的制备方法中采用自然酶解反应的方法，快速简便地从心肌组织中提取天然存在的次黄嘌呤，该方法具有收率高，操作时间短，成本低的特点。次黄嘌呤是参与人体生命活动的重要物质，次黄嘌呤与小分子多肽、氨基酸配合，有促进机体代谢作用，对心血管系统疾病有改善血液循环障碍、降低血管阻力、增加心肌利用氧等作用，能促进造血系统活动增强，白血球数量增多，同时有增加血管弹性、防止血管硬化作用。
目前在亚洲地区流行的严重的SARS传染病的冠状病毒基因组为RNA，通过呼吸道、黏膜或接触，病毒经受体介导吸附于敏感细胞膜或细胞膜的糖蛋白受体，通过膜融合或融膜合成细胞内吞入。临床症状的病理生理变化主要是靶细胞发生极性杀细胞感染，并进一步发展为多器官衰竭，尤其是中老年人极易引起多种并发症，夺去生命。本发明的研究人员研究发现本发明的药物组合物能够有效地预防或治疗SARS及其SARS引起的心肌和脑部疾病。
本发明所述的药物组合物中含有天然活性多肽、天然次黄嘌呤和多种神经节苷脂，其含量高于已有的多肽提取液、次黄嘌呤提取液和神经节苷脂提取液，同时本发明药物组合物中含有天然活性多肽、天然次黄嘌呤和多种神经节苷脂利于吸收和利用，能促进心、脑组织的新陈代谢，参与脑组织神经元的生长、分化和再生过程，改善心脑血液循环和心脑代谢功能，可应用于制备治疗心肌和脑部疾病引起的功能障碍药物方面，可用于治疗心肌梗死、痴呆、脑外伤、脑水肿等症；本发明药物组合物作为制备治疗老年性痴呆、脑血管意外创伤及创伤后的中枢神经系统后遗症、冠心病、心绞痛、心肌疾病、脑血管病、以及缺血性和出血性脑病变等药物中的应用。
本发明研究人员进行大量实验发现，当该药物组合物中活性多肽重量为神经节苷脂中唾液酸的64倍时，当该药物组合物中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸的5倍时，三者的协同作用最好，更利于人体的吸收和利用。本发明优选药物组合物注射液的常规用量为规格2ml∶6.4mg(多肽)∶100μg(唾液酸)∶0.5mg(次黄嘌呤)；5ml∶16.0mg(多肽)∶250μg(唾液酸)∶1.25mg(次黄嘌呤)；10ml∶32.0mg(多肽)∶500μg(唾液酸)∶2.5mg(次黄嘌呤)；肌肉注射2～4ml/次，2次/日或遵医嘱；静脉滴注10-20ml/次，加入300ml 0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液，缓慢滴注(每分钟2ml)，1次/日，两周为一疗程。
本发明所述的药物组合物含有营养肌体组织特别是心脑组织的活性物质，采用神经节苷脂与多肽及次黄嘌呤的协同作用，达到了最佳的临床效果。
本发明药物组合物注射液含有营养肌体组织特别是心脑组织的活性物质，包括活性多肽、神经节苷脂、次黄嘌呤等物质，能促进心、脑组织的新陈代谢，参与脑组织神经元的生长、分化和再生过程，改善心脑血液循环和心脑代谢功能，可用于治疗心肌和脑部疾病引起的功能障碍；用于治疗心肌梗死、痴呆、脑外伤、脑水肿等症；本发明药物组合物在制备治疗老年性痴呆、脑血管意外创伤及创伤后的中枢神经系统后遗症、冠心病、心绞痛、心肌疾病、脑血管病、以及缺血性和出血性脑病变治疗药物上的用途。
图1为薄层色谱鉴别2本发明药物组合物的液相色谱图3对照组的液相色谱具体实施方式
下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1步骤(1)取新鲜兔肌肉10kg，加20L水匀浆，4℃下冷藏12小时，80目尼龙布过滤，滤液加入0.1％霉菌蛋白酶，调节pH值为7.4，45℃保温2.5小时。水解液在3000rpm下离心20分钟。离心上清液经0.3um滤膜过滤，滤液减压浓缩至800ml，作为兔肌肉提取液备用，其中多肽含量为8mg/ml。
步骤(2)取10kg新鲜牛脑用40L丙酮匀浆，匀浆液用滤纸过滤，得滤渣2500g，滤渣用10L氯仿-甲醇(1∶1)混合液抽提三次，分别过滤后合并滤液，使用旋转蒸发器，在37℃减压蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(2∶1，V/V)溶解，加入250ml的0.1mol/LKCl溶液。室温搅拌1小时，转移到分液漏斗中静置8小时。分液后，上相用等体积的氯仿-甲醇-水(86∶14∶1，V/V/V)洗1次；下相用等体积的氯仿-甲醇-水(3∶48∶47，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃减压浓缩至约5L，-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥。
层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(9∶1，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即可。
将前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)50ml加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)20L溶液洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(60∶35∶8)12L洗脱，收集后洗脱液10L，减压浓缩后用40L的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时，倾去上层清液，离心10分钟(1000rpm)，沉淀用适量丙酮洗2次，沉淀真空干燥过夜。
将1.2g干燥物溶于800ml注射用水，作为牛脑提取物备用，浓度为每1ml含唾液酸125μg。
步骤(3)取新鲜兔心肌5kg，加7.5L水匀浆，匀浆液在37℃保温4小时，匀浆液加10％的盐酸调节PH值4.0，加热80℃，保温20分钟，在6℃下离心，离心条件为4000转/分，离心时间为20分钟，保留上清液，上清液过0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；用20％的NaOH将滤液调至pH7.8，加热80℃，保温20分钟，降温后在4℃下离心，离心条件为4000转/分，离心时间为20分钟，保留上清液，上清液过0.65μm滤膜，保留通过部分，得滤液；将滤液调节pH7.2，加热70℃，保温20分钟，在6℃下离心，离心条件为4000转/分，离心时间为20分钟，保留上清液，上清液过0.3μm滤膜，保留通过部分，得滤液，将滤液减压浓缩到200ml，作为兔心肌提取液备用，其中次黄嘌呤含量为2.5mg/ml；步骤(4)将兔肌肉提取液800ml和牛脑提取液800ml及兔心肌提取液200ml混合，加注射用水到2L，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有6.4mg多肽、100μg唾液酸、0.5mg次黄嘌呤。
实施例2步骤(1)取新鲜鹿肌肉10kg，加16L水匀浆，6℃下冷藏14小时，80目尼龙布过滤，滤液加入0.05％霉菌蛋白酶，调节pH值为7.2，39℃保温4小时。水解液在3000rpm下离心20分钟。离心上清液经0.3um滤膜过滤，滤液减压浓缩至800ml，其中多肽含量为2.725mg/ml，作为鹿肌肉提取液备用。
步骤(2)取10kg新鲜牛脑用35L丙酮匀浆，匀浆液用滤纸过滤，得滤渣2500g，滤渣用7.5L氯仿-甲醇(5∶1)混合液抽提三次，分别过滤后合并滤液，使用旋转蒸发器，在37℃减压蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(10∶1，V/V)溶解，加入1000ml的0.1mol/LKCl溶液。室温搅拌1小时，转移到分液漏斗中静置10小时。分液后，上相用等体积的氯仿-甲醇-水(50∶10∶0.5，V/V/V)洗1次；下相用等体积的氯仿-甲醇-水(1∶30∶35，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃减压浓缩至约2.5L，-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥。
层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选70目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(20∶3，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即可。
将前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(30∶50∶40，V/V/V)120ml加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(90∶15∶6，V/V/V)30L溶液洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(80∶20∶5)8L洗脱，收集后洗脱液12L，减压浓缩后用35L的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时，倾去上层清液，离心10分钟(1000rpm)，沉淀用适量丙酮洗2次，沉淀真空干燥过夜。
将1.16g干燥物溶于800ml注射用水，作为牛脑提取物备用，浓度为每1ml含唾液酸80μg唾液酸。
步骤(3)取新鲜鹿心肌5kg，加10L水匀浆，匀浆液在40℃保温5小时，匀浆液调节PH值3.8，加热70℃，保温30分钟，在8℃下离心，离心条件为3500转/分，离心时间为15分钟，保留上清液，上清液过0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；将滤液调节pH7.6，加热70℃，保温30分钟，在6℃下离心，离心条件为3000转/分，离心时间为15分钟，保留上清液，上清液过0.65um滤膜，保留通过部分，得滤液；将滤液调节pH7.0，加热70℃，保温30分钟，在5℃下离心，离心条件为4000转/分，离心时间为15分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液，将滤液减压浓缩到200ml，作为鹿心肌提取液备用，其中次黄嘌呤含量为3.0mg/ml；步骤(4)将鹿肌肉提取液800ml和牛脑提取液800ml及鹿心肌提取液200ml混合，加水注射用水至2L，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有2.18mg多肽、64μg唾液酸、0.6mg次黄嘌呤。
实施例3步骤(1)取新鲜兔肌肉10kg，加25L水匀浆，8℃下冷藏16小时，80目尼龙布过滤，滤液加入0.5％霉菌蛋白酶，调节pH值为7.6，42℃保温2小时。水解液在3000rpm下离心20分钟。离心上清液经0.3um滤膜过滤，滤液减压浓缩至800ml，其中多肽含量为5mg/ml，作为兔肌肉提取液备用。
步骤(2)取10kg新鲜马脑用30L丙酮匀浆，匀浆液用滤纸过滤，得滤渣2500g，滤渣用12.5L氯仿-甲醇(20∶1)混合液抽提三次，分别过滤后合并滤液，使用旋转蒸发器，在37℃减压蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(30∶1，V/V)溶解，加入500ml的0.1mol/LKCl溶液。室温搅拌1小时，转移到分液漏斗中静置16小时。分液后，上相用等体积的氯仿-甲醇-水(120∶35∶5，V/V/V)洗1次；下相用等体积的氯仿-甲醇-水(10∶68∶77，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃减压浓缩至约10L，-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥。
层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(15∶2，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即可。
将前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(80∶10∶20，V/V/V)24ml加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(75∶15∶10，V/V/V)20L溶液洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(40∶50∶15)15L洗脱，收集后洗脱液8L，减压浓缩后用40L的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时，倾去上层清液，离心10分钟(1000rpm)，沉淀用适量丙酮洗2次，沉淀真空干燥过夜。
将1.25g干燥物溶于注射用水，作为马脑提取物备用，浓度为每1ml含唾液酸500μg唾液酸。
步骤(3)取新鲜牛心肌5kg，加12.5L水匀浆，匀浆液在45℃保温6小时，匀浆液加5％的盐酸调节PH值4.2，加热90℃，保温20分钟，在2℃下离心，离心条件为3000转/分，离心时间为30分钟，保留上清液，上清液过0.65μm滤膜，保留通过部分，得滤液；用10％的NaOH将滤液调节pH7.9，加热85℃，保温20分钟，在3℃下离心，离心条件为4000转/分，离心时间为25分钟，保留上清液，上清液过0.65μm滤膜，保留通过部分，得滤液；将滤液调节pH6.8，加热90℃，保温20分钟，在6℃下离心，离心条件为4000转/分，离心时间为30分钟，保留上清液，上清液过0.3μm滤膜，保留通过部分，得滤液，将滤液减压浓缩到200ml，作为牛心肌提取液备用，其中次黄嘌呤含量为4.5mg/ml；步骤(4)将兔肌肉提取液800ml和马脑提取液200ml及牛心肌提取液200ml混合，加水注射用水至2L，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有4.0mg多肽、100μg唾液酸、0.9mg次黄嘌呤。
实施例4步骤(1)取新鲜鹿肌肉10kg，加25L水匀浆，参照实施例1步骤(1)制备鹿肌肉提取液备用，其中多肽含量为1.6mg/ml。
步骤(2)取10kg新鲜马脑用45L丙酮匀浆，参照实施例1步骤(2)，制备马脑提取液备用，浓度为每1ml含唾液酸50μg唾液酸。
步骤(3)取新鲜猪心肌5kg，加10L水匀浆，匀浆液在45℃保温3小时，匀浆液调节PH值3.9，加热85℃，保温20分钟，在8℃下离心，离心条件为3000转/分，离心时间为15分钟，保留上清液，上清液过0.65μm滤膜，保留通过部分，得滤液；将滤液调节pH8.0，加热85℃，保温20分钟，在6℃下离心，离心条件为4000转/分，离心时间为25分钟，保留上清液，上清液过0.65μm滤膜，保留通过部分，得滤液；将滤液调节pH7.2，加热85℃，保温20分钟，在5℃下离心，离心条件为3500转/分，离心时间为20分钟，保留上清液，上清液过0.3μm滤膜，保留通过部分，得滤液，将滤液减压浓缩到200ml，作为兔心肌提取液备用，其中次黄嘌呤含量为2.0mg/ml；步骤(4)将鹿肌肉提取液150ml和马脑提取液500ml及猪心肌提取液200ml混合，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有0.56mg多肽、58.8μg唾液酸、0.94mg次黄嘌呤。
实施例5步骤(1)参照实施例1步骤(1)，制备肌肉提取液多肽含量为8mg/ml。
步骤(2)取10kg新鲜狗脑用40L丙酮匀浆，参照实施例1步骤(2)，制备狗脑提取液备用，浓度为每1ml含唾液酸137.5μg。
步骤(3)参照实施例1步骤(3)，制备兔心肌提取液200ml，次黄嘌呤含量为2.5mg/ml。步骤(4)肌肉提取液800ml和狗脑提取液800ml及兔心肌提取液200ml混合，加注射用水至2L，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有6.4mg多肽、110μg唾液酸、0.5mg次黄嘌呤。
实施例6步骤(1)同实施例1步骤(1)。
步骤(2)取10kg新鲜猪脑用35L丙酮匀浆，参照实施例1步骤(2)，制备猪脑提取液备用，浓度为每1ml含唾液酸400唾液酸。步骤(3)同实施例1步骤(3)。
步骤(4)将兔肌肉提取液1500ml和猪脑提取液400ml及兔心肌提取液200ml混合，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有11.4mg多肽、152μg唾液酸、0.48mg次黄嘌呤。
实施例7步骤(1)同实施例1步骤(1)。
步骤(2)取10kg新鲜羊脑用33L丙酮匀浆，参照实施例1步骤(2)，制备羊脑提取液备用，浓度为每1ml含唾液酸400μg唾液酸。
步骤(3)同实施例1步骤(3)。
步骤(4)将兔肌肉提取液2000ml和羊脑提取液250ml及兔心肌提取液200ml混合，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有13.1mg多肽、81μg唾液酸、0.41mg次黄嘌呤。
实施例8步骤(1)取新鲜狗肌肉10kg，加22L水匀浆，参照实施例1步骤(1)制备肌肉提取液备用，肌肉提取液多肽含量为2.5mg/ml。
步骤(2)同实施例1步骤(2)，浓度为每1ml含唾液酸250μg唾液酸。
步骤(3)同实施例1步骤(3)。
步骤(4)将狗肌肉提取液2000ml和牛脑提取液250ml及兔心肌提取液200ml混合，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支含有4.1mg多肽、51μg唾液酸、0.41mg次黄嘌呤。
实施例9步骤(1)参照实施例1步骤(1)，制备肌肉提取液多肽含量为15mg/ml。
步骤(2)参照实施例3步骤(2)，制备鹿脑提取液备用，浓度为每1ml含唾液酸375μg。步骤(3)同实施例1步骤(3)。
步骤(4)将兔肌肉提取液400ml和狗脑提取液800ml及兔心肌提取液200ml混合，加注射用水至2L，无菌超滤后灌装成2ml/支，高压灭菌，包装入库，每支脑苷肌肽含有6mg多肽、300μg唾液酸、0.5mg次黄嘌呤。
实施例10～18参照实施例1～9中步骤(1)和(2)及(3)，步骤(4)将肌肉提取液和脑提取液及心肌提取液进行混合后，按本领域技术人员公知的方法，制成颗粒，干燥后压制成片，即得药物组合物的片剂。
实施例19～27参照实施例1～9中步骤(1)和(2)及(3)，步骤(4)将肌肉提取液和脑提取液及心肌提取液进行混合后，加入适宜的赋型剂(如右旋糖酐40、甘露醇等)，进行除菌灌装后，按本领域技术人员公知的方法，经冷冻干燥制成冻干粉针产品。
实施例28～36参照实施例1～9中步骤(1)和(2)及(3)，步骤(4)将肌肉提取液和脑提取液及心肌提取液进行混合后，加入适量注射用水投入到稀配罐中；在浓配罐中按最终配制总体积的0.9％加入氯化钠，加入0.4‰活性碳煮沸脱炭过滤，冷却后，将药液过滤至稀配罐中，在稀配罐中补加注射用水至配液量，调PH为7.2～7.5，过滤。灌封于输液瓶中，100℃流通蒸汽灭菌45分钟，即得输液产品。
实验例1本实验例为外观、pH值、蛋白质项目的检测。
本发明药物组合物注射液为无色或微黄澄明液体。
按照中国药典2000年版二部附录VI H测定，本发明药物组合物注射液pH值为6.5-8.0，符合注射液标准。
取本发明药物组合物注射液1ml，加20％磺基水杨酸溶液1ml，没有浑浊产生，说明本发明注射液蛋白质检查符合规定。
实验例2本实验例为多肽的定性测定。
取本发明药物组合物注射液1ml，加茚三酮试液3滴，加热，呈紫色，为肽键(-CO-NH-)的特征反应，说明本发明药物组合物注射液含有多肽。
实验例3本实验例为神经节苷脂的定性测定。
按照中国药典2000年版二部附录VB试验，采用薄层色谱法，以单一神经节苷脂GM1为对照品，加磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。分别取本发明药物组合物注射液及对照品溶液各50ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-0.2％氯化钙溶液(60∶45∶10，V/V/V)为展开剂，展开后，晾干，喷以间苯二酚溶液，喷后即加玻片封盖(两玻片间需用夹夹紧)，120℃加热至斑点清晰，谱图显示本发明药物组合物注射液色谱图主斑点的颜色及位置与对照品色谱图的斑点一致(见图1)。此实验结果表明，本发明药物组合物注射液中含有神经节苷脂，主要为神经节苷脂GM1。
实验例4本实验例为毒性实验参数□细菌内毒素测定依照中国药典2000年版二部附录XI E进行检查，本发明药物组合物注射液每1ml中含细菌内毒素的量小于5EU。
□异常毒性测定依照中国药典2000年版二部附录XI C静脉注射法检查，符合规定。
□毒性实验测定LD50为298±79mg/Kg，最大耐受量超过成人用量的250倍。
□长期毒性测定连续给药三个月观察血、尿指标，病理检查均未见异常。
□过敏性试验取体重250-350g健康豚鼠6只，间日腹腔注射本发明药物组合物注射液0.5ml，连续3次，在第三次注射后的第十四天，自静脉注射本品1.0ml，注射后15分钟内观察动物，均不出现连续干咳、连续前爪抓鼻、明显耸毛、四肢发软、躺卧、呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡现象。连续观察3天，动物健存。
结论本发明药物组合物注射液符合注射液要求，无任何毒性作用，应用人体安全。
实验例5本实验例为高分子量物质测定
按照中国药典2000年版二部附录VD中高效液相色谱法进行测定。
色谱条件与系统适用性试验用凝胶色谱柱(TSK GEL 2000SWx17.8mm*300mm，5um)；流动相为三氟醋酸-乙腈-水(0.05∶10∶90)；检测波长为214nm。理论板数按胰岛素峰计算应不得低于3000。
对照品溶液的制备取胰岛素(分子量5800)适量，用流动相制成每1ml中含1mg的溶液，作为对照品溶液。
测定法取对照品溶液和本发明药物组合物注射液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图2、3，小于胰岛素峰保留时间的峰面积，按面积归一化法计算，不得超过5.0％。
该药物组合物注射液通过静脉滴注途径给药，根据专家意见，增加高分子量物质检查。根据三批样品的测定结果，高分子量物质限定为“小于胰岛素峰保留时间的峰面积，按面积归一化法计算，不超过5.0％”。
实验例6本实验例定量测定本发明药物组合物注射液的多肽含量。
按照类似品种的质量标准，采用Folin-酚法测定，规定肽含量应为标示量的85-115％。参见表1。
表1多肽含量测定结果
Folin-酚测定法试剂碱性铜溶液--取氢氧化铜10g，碳酸钠50g，加水400ml溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，甲液与乙液合并，并加水至500ml。
操作法(1)对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
(2)供试品溶液的制备取本发明注射液，加水制成每1ml中约含多肽0.15mg的溶液。
(3)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜溶液1.0ml，摇匀，各加入福林酚溶液(福林试液中的贮备液1→16)4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0管作为空白。以测得的吸收度与对应的浓度计算回归方程。
(4)测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜溶液”起，依法测定，从回归方程求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，即为多肽含量。
实验例7本实验例定量测定本发明药物组合物注射液的唾液酸含量。
采用间苯二酚测定法测定，规定唾液酸含量应为标示量的85～115％。参见表2。
表2唾液酸含量测定结果
间苯二酚测定法试剂1、间苯二酚贮存液取间苯二酚2g，加水100ml溶解，作为贮存液(可4℃保存数月)。
2、硫酸铜溶液(0.1mol/L)取硫酸铜2.5g，加水100ml溶解，即得。
3、间苯二酚溶液取间苯二酚贮存液10ml，加硫酸铜溶液0.25ml，加盐酸80ml，加水至100ml。
操作法(1)参比溶液的制备取唾液酸参比试剂适量，加0.9％氯化钠溶液制成每1ml中含100μg的溶液。
(2)供试品溶液的制备取本发明脑苷肌肽注射液，加0.9％氯化钠溶液制成每1ml中约含唾液酸50μg的溶液。
(3)标准曲线的制备精密量取参比溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0ml，分别置具塞试管中，各加水至2.0ml，再分别加入间苯二酚溶液2.0ml，摇匀，置水浴中反应15分钟，取出置冷水中10分钟。分别加醋酸正丁酯-正丁醇(85∶15)5ml，剧烈振摇后放置15分钟。取上层液于585nm波长处测定吸收度；同时以0管作为空白。以测得的吸收度与对应的浓度计算回归方程，其相关系数应大于0.995。
(4)测定法精密量取供试品溶液2.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入间苯二酚溶液”起，依法测定，从回归方程求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，即为唾液酸含量。
实验例8本实验例定量测定本发明药物组合物注射液的次黄嘌呤含量。
采用高效液相色谱法测定，规定次黄嘌呤含量应为标示量的85～115％。参见表3。
表3次黄嘌呤含量测定结果
高效液相色谱法色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；磷酸二氢钾(0.001mol/L，pH6.9)-甲醇(100∶0.2)为流动相；检测波长为260nm，理板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000，次黄嘌呤峰与黄嘌呤峰的分离度应符合规定。
对照品溶液的制备取次黄嘌呤对照品适量，加水制成每1ml中含次黄嘌呤10μg的溶液作为对照品溶液。另取次黄嘌呤和黄嘌呤适量加水制成每ml中含次黄嘌呤25μg及黄嘌呤2.5μg的溶液，作为系统适用性试验用溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，加水制成每1取本品适量，加水制成每1ml中含次黄嘌呤10μg的溶液作为对照品溶液。
测定法取系统适用性试验用溶液20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，计算分离度应符合规定。另取对照品溶液、供试品溶液各20μl分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
实验例9本实验例定性测定本发明药物组合物注射液的次黄嘌呤。
本法按次黄嘌呤含量测定项下方法测定，记录色谱图，次黄嘌呤峰的保留时间应与对照品峰的保留时间相同。根据三批样品检测，次黄嘌呤峰的保留时间与对照品峰的保留时间相同。
比较例1本比较例说明本发明药物组合物注射液治疗脑血管病的临床效果。
1、资料与方法对照组用药为脑复素注射液5ml∶5mg，用量用法静脉注射，每次20ml，每日1次，15天为一疗程，每疗程间隔15天；肌肉注射，每次5ml，一日2次。
采用盲目随机对照分为治疗组和对照组各41例。
治疗组男27例，女14例，年龄35-80岁，平均58岁。
对照组男26例，女15例，年龄40-83岁，平均61岁。
表4治疗组与对照组临床表现对比
经统计学处理，两组平均积分相差不明显，t＝0.2594，p＝0.8，故可为研究用。
在综合治疗的基础上，加用注射液，用药开始时间在发病后1-10天。用量每次20ml，一日1次，7天为一疗程有10例；15天为一疗程31例。
2、结果表5从神经功能缺损积分减少(功能改善)评定疗效
从上表可见治疗组在治疗后神经体征明显改善(p＜0.05)，而对照组改善不明显(p＞0.05)，证明治疗组效果优于对照组。
本组治疗结果见表6表6脑卒中的近期疗效观察对比
治疗中未见近期副反应及并发症。
3、讨论研究结果表明，从治疗结束时神经功能缺损积分减少数结果看，经统计学处理，治疗组效果优于对照组(p＞0.05)，在从临床疗效比较，治疗组有效率为88％，对照组有效率为20％，经x2检验治疗组疗效明显高于对照组(p＜0.01)，以上结果证明本发明药物组合物注射液对脑血管病有明显疗效，并使死亡率明显降低。
比较例2本比较例说明本发明药物组合物注射液治疗心脏疾病的临床效果
1、表7治疗冠心病、心绞痛疗效观察对比
2、表8心功能改善的治疗对比
从临床使用情况来看，对冠心病、心绞痛总有效率可达95.3％，能明显改善心脏组织缺血状态，改善和促进心功能的恢复。
比较例3本比较例说明在治疗老年性急性脑卒中，本发明药物组合物注射液疗效优于脑复素注射液、活脑素注射液。
1、对象所有人选病例均按中华医学会第2次脑血管学术会议制定的标准，经详细询问病史，神经系统检查及头颅CT和(或)MR检查确诊。所有病人均为首次发病，按改良爱丁堡斯堪的纳维亚(改良SSS评分)，疾病程度为中、重度，均未给予溶栓治疗，因经济问题未完成治疗疗程的不参与评价。治疗组28例，男20例，女8例，平均年龄76岁(64-88岁)，其中脑梗塞18例，脑出血8例，蛛网膜下腔出血2例；随机选择以往用脑复素注射液、活脑素注射液治疗的患者30例为对照组，男20例，女10例，平均年龄75岁(60-90岁)，其中脑梗塞19例，脑出血10例，蛛网膜下腔出血1例。两组基线资料有可比性。
2、治疗方法治疗组本发明药物组合物注射液一次10-20ml加入300ml氯化钠注射液中或5％葡萄糖注射液中，每日1次，缓慢滴注，维持4-6周。
对照组脑复素注射液、活脑素注射液，每次20ml，每日1次，15天为一疗程，一般用2个疗程以上。
对两组患者伴有糖尿病及高血压者给予相应对症治疗。治疗组治疗前后均检查肝肾功能、血常规及心电图。
3、疗效评定根据改良SSS评分法，对入院时和出院时患者的神经功能损伤进行评价。
基本痊愈SSS评分减少90％以上；
显著进步SSS评分减少46-89％；进步SSS评分减少18-45％；无 变 化SSS评分变化在18％以下；恶化SSS评分增加大于18％。
4、结果治疗组治疗前后，肝肾功能、血常规及心电图无明显变化。
两组疗效见表9
注与对照组比较*x2＝6.59，p＜0.01，**x2＝4.92，p＜0.025。
以上说明在治疗老年性急性脑卒中，本发明药物组合物注射液疗效优于脑复素注射液、活脑素注射液。
比较例4本比较例说明本发明药物组合物注射液用于治疗心肌疾病的疗效优于心血通注射液。
对照组心血通注射液。
有关参数见表10
说明本发明药物组合物注射液用于治疗心肌疾病的疗效优于心血通注射液。
比较例5本比较例说明在治疗老年性急性脑卒中，本发明药物组合物注射液疗效优于脑苷肌肽注射液。
1、对象所有人选病例均按中华医学会第2次脑血管学术会议制定的标准，经详细询问病史，神经系统检查及头颅CT和(或)MR检查确诊。所有病人均为首次发病，按改良爱丁堡斯堪的纳维亚(改良SSS评分)，疾病程度为中、重度，均未给予溶栓治疗，因经济问题未完成治疗疗程的不参与评价。治疗组28例，男20例，女8例，平均年龄76岁(64-88岁)，其中脑梗塞18例，脑出血8例，蛛网膜下腔出血2例；随机选择以往用脑苷肌肽注射液治疗的患者30例为对照组，男20例，女10例，平均年龄75岁(60-90岁)，其中脑梗塞19例，脑出血10例，蛛网膜下腔出血1例。两组基线资料有可比性。
2、治疗方法治疗组本发明药物组合物注射液一次10-20ml加入300ml氯化钠注射液中或5％葡萄糖注射液中，每日1次，缓慢滴注，维持4-6周。
对照组脑苷肌肽注射液，一次10-20ml加入300ml氯化钠注射液中或5％葡萄糖注射液中，每日1次，缓慢滴注，维持4-6周。
对两组患者伴有糖尿病及高血压者给予相应对症治疗。治疗组治疗前后均检查肝肾功能、血常规及心电图。
3、疗效评定根据改良SSS评分法，对入院时和出院时患者的神经功能损伤进行评价。
基本痊愈SSS评分减少90％以上；显著进步SSS评分减少46-89％；进步SSS评分减少18-45％；无 变 化SSS评分变化在18％以下；恶化SSS评分增加大于18％。
4、结果治疗组治疗前后，肝肾功能、血常规及心电图无明显变化。
两组疗效见表11
注与对照组比较*x2＝6.59，p＜0.01，**x2＝4.92，p＜0.025。
以上说明在治疗老年性急性脑卒中，本发明药物组合物注射液疗效优于脑苷肌肽注射液。
尽管对本发明已作了详细的说明并引证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于含有从除人以外的哺乳动物肌肉组织中提取的活性多肽和从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂及从除人以外的哺乳动物心肌组织中提取的次黄嘌呤，其中唾液酸的浓度为0.01～0.5mg/ml，活性多肽重量为神经节苷脂中唾液酸的6.1～100倍，次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸的1～100倍。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于药物组合物中唾液酸的浓度为0.02～0.2mg/ml，活性多肽重量为神经节苷脂中唾液酸的50～80倍，更优选为60～70倍，最优选的为64倍；药物组合物中次黄嘌呤的重量为神经节苷脂中唾液酸的1～20倍，更优选的为2～10倍，最优选的为5倍。
3.一种制备权利要求1所述的药物组合物的方法，其特征在于包括如下步骤(1)肌肉提取液的制备A)将动物任意部位肌肉组织加水匀浆后冷藏，然后过滤除渣，保留滤液；B)滤液在中性条件下保温酶解；C)水解液离心除沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，得滤液，即为肌肉提取液；(2)脑提取液的制备A)将动物脑组织加溶剂匀浆后过滤，滤渣用溶剂抽提提取，提取液与滤液合并后蒸干，得干燥物；B)将干燥物溶于溶剂中，向其中加入盐的水溶液提取分液；C)分液的上、下层液相分别用至少两种溶剂的混合水溶液洗涤，合并洗涤后的上层液相部分，减压浓缩，然后用预冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；D)将干燥物溶于至少两种溶剂的混合水溶液，层析柱分离，洗脱液浓缩后用预冷丙酮沉淀、分离，得到的沉淀经后处理，得到神经节苷脂溶液；(3)心肌提取液的制备A)将动物心肌组织加水匀浆后保温，匀浆液调节呈酸性，加热离心后，过滤，保留滤液；B)将滤液调节呈碱性，加热离心后，过滤，保留滤液；C)将滤液调节呈中性，加热离心除沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，得滤液，为心肌提取液；(4)将上述提取液混合，使混合液中多肽的重量为神经节苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸重量的1～100倍，经后处理，得成品制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)肌肉提取液的制备A)步骤中将动物任意部位肌肉组织加1.6～2.5倍重量水匀浆，匀浆液加水稀释后，在4～8℃冷藏12～16小时，使用80目的尼龙布过滤，保留滤液；B)滤液中加入霉菌蛋白酶保温水解，霉菌蛋白酶浓度为0.03～0.5％，水解条件为pH＝7.2～7.6，保温39～45℃，保温时间为2～4小时；C)水解液离心，离心条件为3000转/分，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液；即为肌肉提取液，其中多肽含量为0.5～15mg/ml；(2)脑提取液的制备A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿—甲醇—水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿—甲醇—水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/8～1/2，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)将干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5mL/分钟，用氯仿—甲醇—水(60～90∶15～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脱，然后改用氯仿—甲醇—水(40～80∶20～50∶5～15，V/V/V)混合液8～15L洗脱，收集后洗脱液6～12L，减压浓缩后用3～5倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得脑提取液，浓度为每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)心肌提取液的制备A)将动物心肌组织加1～2.5倍重量水匀浆，匀浆液在35～45℃保温3～6小时，匀浆液调节PH值3.8～4.2，加热70～90℃，保温15～30分钟，然后在2～8℃下离心，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；B)将滤液调节PH值7.6～8.0，加热70～90℃，保温15～30分钟，在2～8℃下离心，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；C)将滤液调节PH值6.8～7.2，加热70～90℃，保温15～30分钟，在2～8℃下离心，离心时间为15～30分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液，为心肌提取液，其中次黄嘌呤含量为0.1～5mg/ml；(4)将上述提取液混合，使混合液中多肽的重量为神经节苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸重量的1～100倍，经后处理，得成品制剂。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)肌肉提取液的制备A)将动物任意部位肌肉组织加1.6～2.5倍重量水匀浆，匀浆液加水稀释后，在4～8℃冷藏12～16小时，使用80目的尼龙布过滤，保留滤液；B)在滤液中加入霉菌蛋白酶保温水解，霉菌蛋白酶浓度为0.1％，水解条件为PH＝7.2～7.6，保温45℃，保温时间为2.5小时；C)水解液离心，离心条件为3000转/分，离心时间为20分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液；滤液减压浓缩得浓缩液，即为肌肉提取液，其中多肽含量为0.5～15mg/ml；(2)脑提取液的制备A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿—甲醇—水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿—甲醇—水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/4，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)将干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5mL/分钟，用氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)混合液20L洗脱，然后改用氯仿—甲醇—水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脱，收集后洗脱液10L，减压浓缩后用4倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得脑提取液，浓度为每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)心肌提取液的制备A)将动物心肌组织加1～2.5倍重量水匀浆，匀浆液在37～42℃保温4～6小时，匀浆液调节PH值3.9～4.1，加热80～90℃，保温20～25分钟，在4～8℃下离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为20～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；B)将滤液调节PH值7.7～7.9，加热80～90℃，保温20～25分钟，在4～8℃下离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为20～30分钟，保留上清液，上清液过0.45～0.8um滤膜，保留通过部分，得滤液；C)将滤液调节PH值6.8～7.2，加热80～90℃，保温20～25分钟，在4～8℃下离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为20～30分钟，保留上清液，上清液过0.3um滤膜，保留通过部分，得滤液，为心肌提取液，其中次黄嘌呤含量为0.1～5mg/ml；(4)将上述提取液混合，使混合液中多肽的重量为神经节苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸重量的1～100倍，经后处理，得成品制剂。
6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)的D)中所用的层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选60～80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于其中氯仿-甲醇混合比为9∶1(V/V)。
8.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中成品制剂的剂型为药剂学上可接受的剂型，比如片剂、胶囊、口服液、小容量注射剂、大输液或冻干粉针，优选为小容量注射剂、大输液或冻干粉针，最优选为小容量注射剂。
9.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于所述的动物任意部位肌肉组织为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔的任意部位肌肉组织；所述的动物脑组织为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔的脑组织；所述的动物心肌组织为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔的心肌组织；优选所述的动物任意部位肌肉组织为兔的任意部位肌肉组织；所述的动物脑组织为牛的脑组织；所述的动物心肌组织为兔的心肌组织。
10.权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗SARS以及SARS引起的心脑部并发症药物方面的用途；在制备治疗心肌和脑部疾病引起的功能障碍药物方面的用途；作为治疗心肌梗死、痴呆、脑外伤、脑水肿药物中的应用；以及作为制备治疗老年性痴呆、脑血管意外创伤及创伤后的中枢神经系统后遗症、冠心病、心绞痛、心肌疾病、脑血管病、以及缺血性和出血性脑病变等药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种药物组合物，含有从除人以外的哺乳动物肌肉组织中提取的活性多肽和从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂及含有从除人以外的哺乳动物心肌组织中提取的次黄嘌呤，药物组合物中活性多肽重量为神经节苷脂中唾液酸的6.1～100倍，药物组合物中次黄嘌呤重量为神经节苷脂中唾液酸的1～100倍，还公开了药物组合物的制备方法及其在制备治疗SARS以及SARS引起的心脑部并发症药物方面的用途，本发明的药物组合物能促进心、脑组织的新陈代谢，参与脑组织神经元的生长、分化和再生过程，改善脑血液循环和脑代谢功能，可用于治疗心肌和脑部疾病引起的功能障碍。
文档编号A61P31/14GK1589896SQ0315616
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者张志 申请人:吉林全威药业有限公司