Vlp－抗原偶联物及其作为疫苗的用途的制作方法

专利名称：Vlp－抗原偶联物及其作为疫苗的用途的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种包含RNA噬菌体的病毒样颗粒(VLP)和至少一种抗原的组合物，其中所述VLP是在宿主中重组产生的，并且其中所述VLP所包含的具有二级结构的宿主RNA的量最多为所述VLP原来所包含的具有二级结构的宿主RNA量的20％；并且其中所述VLP和所述至少一种抗原彼此连接。
本发明也提供制备本发明的组合物的方法。本发明的组合物可以用于制备治疗疾病、障碍和病症的疫苗。而且，本发明的组合物特别可用于有效诱导针对特定环境内的抗原的强抗体应答，同时降低或消除不希望的T细胞应答。
相关技术已经描述了与抗原连接的RNA-噬菌体的病毒样颗粒(VLP)是有用的疫苗组合物。WO 02/056905描述了VLP-抗原偶联物作为疫苗用于治疗传染病，预防或治疗癌症，以及有效地诱导自身特异性免疫应答。而且，在自身特异性免疫应答的诱导的内容中，已经公开了具体的VLP-抗原偶联物，例如，用于治疗变态反应(WO 03/040164)或骨病(WO03/039225)，或者用于治疗和预防与肾素活化的血管紧张肽系统有关的病症(WO 03/031466)。
根据抗原的性质和有关疾病，疫苗引起的某些类型的免疫应答通常比另外一些更加期望。例如，尽管通常希望诱导针对肿瘤细胞或病毒感染的强细胞毒性T细胞(CTL)应答，但是这种应答，特别是对于含有自身抗原的疫苗来说，可能会导致严重的副作用，如自身特异性T细胞的诱导(Orgogozo，J.M.等人，Neurology 61，46-54(2003)；Hock，C.等人，Natural Med.8，1270-75(2002)；Hock C.等人，Neuron 38，547-554，(2003))。
抗原特异性T细胞的活化主要依赖于T细胞与诸如树突细胞、B细胞和巨噬细胞的抗原呈递细胞(APC)之间的交叉应答(cross-talk)，APC在MHC分子环境中呈递T细胞抗原。导致APC活化的一种途径是Th细胞上的CD40L与树突细胞上的CD40的相互作用(Foy，T.M，等人，Annu.Rev.Immunol.14591(1996))。令人感兴趣的是，这种CD40L-介导的树突细胞成熟似乎负责对CTL应答的辅助效应。实际上，最近表明，Th细胞引起的CD40触发使树突细胞能够启动CTL应答(Ridge，J.P，等人，Nature 393474(1998)；Bennett，S.R.M，等人，Nature 393478(1998)；Schoenenberger，S.P，等人，Nature 393480(1998))。
导致APC活化的另外一种途径是通过APC表达的toll-样受体的活化。迄今为止已经鉴定了10种人toll-样受体，它们的配体表现出有限数量的与病原体有关的不变模式(Medzhitov，R.和Janeway，C.A，Jr，Cell 91295-298(1997))。这些模式的例子包括脂多糖(LPS)、富含非甲基化CG的DNA(CpG)或双链RNA，它们分别对于细菌和病毒感染具有特异性。
刺激先天免疫的因子对APC的普遍活化通常可能是引发自身特异性淋巴细胞和自身免疫的原因。这种活化可导致共同刺激分子或细胞因子如IL-12或IFNα的表达提高。这一观点与以下发现一致与甲状腺提取物一起施用LPS能够克服耐受并引发自身免疫性甲状腺炎(Weigle，W.O，Adv.Immunol.30159(1980))。而且，在转基因小鼠模型上，最近发现单独施用自身肽不能引起自身免疫，除非APC被一种单独的途径活化(Garza，K.M.等人，J.Exp.Med.1912021(2000))。以下发现进一步说明了先天免疫与自身免疫病之间的联系LPS、病毒感染或APC的普遍活化延迟或防止了外周耐受的形成(Vella，A.T.等人，Immunity 2261(1995)；Ehl，S.等人，J.Exp.Med.187763(1998)；Maxwell，J.R.等人，J.Immunol.1622024(1999))。这样，先天免疫不仅可增强自身特异性淋巴细胞的活化，而且可抑制其随后的消失。
现有技术中描述的并且作为抗原载体用于接种的RNA噬菌体如Qβ或AP205的病毒样颗粒已经通过在大肠杆菌中重组表达而制备。然而，通过随后从大肠杆菌裂解物中纯化而获得的VLP仍然含有包裹的大肠杆菌成分，主要是大肠杆菌RNA以及一些大肠杆菌蛋白质。许多细菌成分，特别是细菌核酸，特别是细菌DNA和细菌RNA，通过toll-样受体的活化而导致T细胞应答的刺激。如前所述，T细胞应答的活化可导致严重的副作用。而且，在疫苗内除已经证明的药学活性成分以外不希望存在诸如未鉴定的细菌成分的物质，因为这些未鉴定的细菌成分可能会引起潜在的危险或副作用。
因此，在本领域中仍然需要开发新的有效的疫苗用于治疗较大范围的疾病。特别是，在本领域中仍然需要开发新的疫苗，从而最大可能性地降低或消除不利的副作用如不希望的T细胞应答的活化或刺激，同时保持最大的治疗效果。
发明概述我们惊奇地发现本发明的组合物能够诱导针对疫苗中所含抗原的强免疫应答，特别是抗体应答，而同时最小化或避免了不希望的T细胞应答或其他不希望的副作用，如发热。
先天免疫的刺激导致IgG2a和IgG2b型抗体的诱导，IgG2a和IgG2b在组织破坏方面比IgG1(小鼠)更强有力。我们惊奇地发现，本发明的组合物改变了抗体同种型分布，使之远离IgG2a和/或IgG2b或IgG1(人)。
另外，我们惊奇地发现，本发明的组合物是有效的疫苗，它诱导针对多种抗原，特别是自身抗原的强免疫应答，这些抗原可以在治疗诸如但不限于自身免疫病、炎性疾病、肥胖症和药物成瘾的多种疾病中作为靶标使用。
因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，包含(a)一种病毒样颗粒(VLP)，其包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述VLP具有至少一个第一附着位点，其中所述VLP是由宿主重组产生的，并且其中VLP包含的具有二级结构的宿主RNA的量为所述VLP原来所含的具有二级结构的宿主RNA的量的最多20％，优选最多10％；(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原；其中所述至少一种抗原(b)与所述VLP(a)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地，本发明的组合物形成一种有序且重复的抗原阵列。所述至少一种抗原可以选自多肽、碳水化合物、类固醇激素、有机分子或半抗原，优选地，所述至少一种抗原是自身抗原或半抗原。在此提供了典型和优选的根据本发明测定RNA，优选核酸的量的方法。
本发明的组合物和疫苗中宿主RNA，优选宿主核酸的量强烈降低，导致VLP或VLP-抗原偶联物具有强烈降低的量的Toll-样受体配体，或优选地基本不含Toll-样受体配体。Toll-样受体被认为是连接先天免疫应答和获得性免疫应答的枢纽。Toll-样受体的活化导致先天免疫系统的全面活化以及APC的活化，进一步导致抗原特异性免疫应答。因此，令人惊奇的是，包含VLP的本发明的组合物和疫苗，其中所述VLP含有的具有二级结构的宿主RNA的量为VLP原来所含的量的最多20％，优选最多10％，更优选地VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸，更优选地基本不含Toll-样受体，却诱导强抗原特异性免疫应答，特别是抗体应答，却同时典型地绕过Toll-样受体的活化。而且，本发明的组合物和疫苗诱导针对该组合物中的特定抗原的强免疫应答，同时最小化或不能引发CTL应答。另外，本发明的组合物和疫苗减少了IgG2a和/或IgG2b的产生，并且改变了抗体同种型，使之远离更具组织破坏性的IgG2a和/或IgG2b。
在另一个方面，本发明提供一种组合物，包含(a)一种病毒样颗粒(VLP)，其包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述VLP具有至少一个第一附着位点，其中所述VLP是由宿主重组产生的，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，优选地其中所述VLP基本不含宿主核酸；(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原；其中所述至少一种抗原(b)与所述VLP(a)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
我们进一步发现本发明的组合物和疫苗诱导针对与VLP连接的特定抗原的强免疫应答，而没有明显的，或者典型且优选地显著的炎性T细胞的活化，炎性T细胞是Th1细胞的一个亚组，这通过IgG2a效价的降低，特别是通过获得的低IgG2a/IgG1比而得到证明。T细胞不同亚组的活化导致不同抗体亚型的表达。例如，Th1细胞特别产生IFN-γ，IFN-γ促进免疫球蛋白IgG2a的产生，IgG2a调理和补体固定抗体和介导巨噬细胞活化和抗体依赖性细胞毒性。Th2细胞的特征在于IL-4和IL-10产生，并为B细胞成熟和IgG1抗体的产生提供帮助。因此IgG2a/IgG1比是一个良好的并且公认的确定Th1细胞相比Th2细胞的活化程度的参数。另外，如果不希望抗体亚类具有调理和补体固定性质，例如对于为了诱导抗自身抗原抗体而开发的疫苗来说，IgG2a和/或IgG2b的降低明显有益。
在本发明的另一个优选的实施方案中，组合物还包含至少一种与VLP结合的聚阴离子大分子。在本发明的一个更优选的实施方案中，VLP包裹或包装有至少一种聚阴离子大分子。至少一种聚阴离子大分子的存在一般导致更高的针对抗原的抗体效价，特别是IgG1效价，同时保持低IgG2a/IgG1比和低CTL应答。而且，与VLP结合的，优选被VLP包裹或包装的至少一种聚阴离子大分子的存在一般有利和有益于RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段装配为VLP，以及它们的稳定化。在一个优选实施方案中，聚阴离子大分子是聚阴离子多肽，更优选地，聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。
在另一个方面，本发明分别提供制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法。在一个优选的方面，本发明分别提供一种制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，该方法包括以下步骤(a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段；(b)将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA-噬菌体的所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(d)将所述纯化的所述RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；和(e)将具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原与步骤(d)获得的所述VLP进行连接。在一个优选实施方案中，重装配所述纯化的外壳蛋白的步骤在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。
在另一个方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含本发明的组合物，优选地还包含一种缓冲剂。该疫苗可以向患者施用，不含或者含有至少一种佐剂。在另一个方面，本发明提供一种免疫方法，包括向动物或人施用所述疫苗。
在另一个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，包括向动物或人施用本发明的组合物。在一个优选实施方案中，本发明提供一种治疗诸如但不限于炎性疾病、慢性自身免疫病、肥胖症或药物成瘾的疾病的方法。
在另一方面，本发明提供一种包含本发明的组合物和可接受的药物载体的药物组合物。
在另一方面，本发明的疫苗组合物基本不含细菌DNA以及其他细菌成分，分别产生更确定的组合物和疫苗。这不仅产生更安全的疫苗，而且符合生产质量管理规范(GMP)标准。
附图简述图1显示在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上RNase A对QβVLP的RNA水解的分析。加到凝胶上的是下列样品1.MBI Fermentas 1kbDNA梯子；2.现有技术QβVLP；3.在0.2x HBS缓冲液pH 7.2中用RNase A处理的QβVLP。
图2显示现有技术QβVLP和根据本发明重装配的QβVLP的SDS-PAGE凝胶。泳道1分子量标准；泳道2非还原条件下的现有技术QβVLP；泳道3分子量标准；泳道4还原条件下(25mM DTT)电泳的重装配的QβVLP；泳道5非还原条件下电泳的重装配的QβVLP。
图3显示用与现有技术QβVLP偶联的尼古丁衍生物、RNase A处理的QβVLP和在不同聚阴离子大分子存在下重装配的QβVLP免疫小鼠后的抗尼古丁抗体效价。
图4显示用与现有技术QβVLP偶联的尼古丁衍生物、RNase A处理的QβVLP和在不同聚阴离子大分子存在下重装配的QβVLP免疫小鼠后的抗尼古丁IgG1和IgG2a抗体效价。
图5显示大小排阻HPLC中装配混合物的洗脱谱。(A)在没有任意聚阴离子大分子的条件下装配的AP205外壳蛋白；(B)在聚谷氨酸存在下装配的AP205外壳蛋白。在7.83min处存在峰表明了AP205VLP的形成，该保持时间与现有技术AP205VLP相同。洗脱下未装配的AP205外壳蛋白，保持时间为11.77min。
发明详述定义抗体同种型除非另外说明，在本申请中使用的抗体同种型的命名是小鼠命名。本领域技术人员知道相应的人类命名。例如，小鼠的抗体同种型IgG2a对应于人类的抗体同种型IgG1。
抗原此处所用的术语“抗原”指如果被MHC分子呈递，即能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。此处所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或者连接于Th细胞表位，并且包含于佐剂中。一种抗原可能包含一种或多种表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应指抗原优选地一般以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。此处所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。
第一附着位点此处所用的短语“第一附着位点”是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一种元件，第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或化学反应性基团如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。化学反应性基团作为第一附着位点的一个优选的实施方案是氨基酸如赖氨酸的氨基。第一附着位点一般位于VLP的表面上，优选外表面上。多个第一附着位点一般以重复构型存在于病毒样颗粒的表面上，优选外表面上。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键连接。在一个进一步优选的实施方案中，第一附着位点天然存在于VLP中。或者，在另一个优选的实施方案中，第一附着位点被人工添加到VLP上。
第二附着位点如此处使用的短语“第二附着位点”是指天然存在于或者人工添加到本发明的抗原上的一种元件，第一附着位点可以与之连接。本发明的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应性基团例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基、或其组合。化学反应性基团作为第二附着位点的一个优选的实施方案是巯基，优选氨基酸如半胱氨酸的巯基。因此术语“具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原”是指包含本发明的抗原和至少一个第二附着位点的构建体。但是，特别是对于非天然存在于抗原内的第二附着位点来说，这种构建体一般且优选地还含有“连接体”。在另一个优选的实施方案，第二附着位点与本发明的抗原通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键连接。在另一个实施方案中，第二附着位点天然存在于本发明的抗原内。在另外一个优选的实施方案中，通过连接体，优选包含半胱氨酸的连接体，通过蛋白质融合，将第二附着位点人工添加到本发明的抗原上。
结合如此处所用的术语“结合”是指这样的结合它可以是共价的，例如通过化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。该术语也包括物质的包封或部分包封。术语“结合”比诸如“偶联”、“融合”、“包封”、“包装”和“附着”的术语范围更广，并且包括后面这些。例如，典型且优选地，聚阴离子大分子如聚谷氨酸可以被VLP包裹或包装，而典型且优选地不存在实际上的结合。
外壳蛋白本申请中的术语“外壳蛋白”和可交换使用的术语“衣壳蛋白”是指能够掺入病毒衣壳或VLP内的病毒蛋白质。一般且优选地，术语“外壳蛋白”是指RNA噬菌体的基因组或RNA噬菌体变体的基因组编码的外壳蛋白。更优选地，例如，术语“AP205的外壳蛋白”是指SEQ ID NO29或氨基酸序列，其中从SEQ ID NO29上切下第一个甲硫氨酸。更优选地，例如，术语“Qβ的外壳蛋白”是指SEQ ID NO10(″QβCP″)和SEQ ID NO11(A1)，含有或不含位于N末端的甲硫氨酸(SEQ ID NO67)。噬菌体Qβ的衣壳主要由QβCP组成，含有少量A1蛋白。
表位如此处所用的术语“表位”是指在动物、优选哺乳动物、最优选在人中具有抗原性或免疫原活性的多肽的连续或不连续部分。表位在MHC分子环境下被抗体或被T细胞通过其T细胞受体来识别。
基本不含宿主RNA，优选宿主核酸如此处所用的术语“基本不含宿主RNA，优选宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA，优选宿主核酸的量，其典型且优选地每mg VLP含有不到30μg，优选不到20μg，更优选不到10μg，甚至更优选不到8μg，甚至更优选不到6μg，甚至更优选不到4μg，最优选不到2μg。在上述内容中使用的宿主是指在其中重组产生VLP的宿主，该宿主优选地是细菌，进一步优选大肠杆菌。测定RNA，优选核酸的量的常规方法是本领域技术人员公知的。典型且优选的根据本发明测定RNA，优选核酸的量的方法在实施例17中对于现有技术QβVLP和本发明的QβVLP描述。对于含有Qβ以外的VLP的本发明的组合物，测定RNA，优选核酸的量典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。测得的量的数值典型且优选地被理解为包括所述数值±10％偏差，优选±5％偏差的值。
免疫刺激性核酸如此处所用的术语“免疫刺激性核酸”是指能够诱导和/或增强免疫应答的核酸。
免疫刺激物如此处所用的术语“免疫刺激物”是指一种物质，它能够诱导和/或增强免疫应答，因此典型且优选地诱导和/或增强对本发明组合物中含有的抗原特异性的免疫应答。
连接的如此处所用的术语“连接的”(或其名词连接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键连接，更优选只通过非肽键连接。然而，如此处所用的术语“连接”应当不仅包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且可替代地并且优选地，包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子的间接连接，典型且优选地通过使用至少一个，优选一个异双功能交联剂连接。
连接体如此处所用的“连接体”将第二附着位点与本发明的抗原连接，或者已经包含第二附着位点、基本由、或由第二附着位点组成。优选地，如此处所用的“连接体”已经包含第二附着位点，典型且优选地-但不是必需地-为一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。如此处所用的“连接体”也被称为“氨基酸连接体”，特别是当本发明的连接体含有至少一个氨基酸残基时。因此，术语“连接体”和“氨基酸连接体”在此可以交换使用。然而，这并不意味着这种连接体仅由氨基酸残基组成，即使由氨基酸残基组成的连接体是本发明的一个优选的实施方案。连接体的氨基酸残基优选由本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、全L型或全D型或其混合物组成。本发明的连接体的进一步优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，这些分子因此也包括在本发明中。可用于本发明的其他连接体是包含C1-C6烷基、环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。而且，优选包含C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分和其他氨基酸的连接体也可以用作本发明的连接体，并且包括在本发明的范围内。连接体与本发明的抗原的连接优选通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键。对于本发明的抗原非天然存在的第二附着位点，连接体与至少一个第二附着位点如半胱氨酸连接，优选通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键连接。
有序且重复的抗原阵列如此处所用的术语“有序且重复的抗原阵列”通常是指抗原的重复模式，其特征在于典型且优选地，抗原的空间排列相对于病毒样颗粒具有高度的均一性。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是一种几何模式。RNA噬菌体的VLP具有严格重复的类结晶抗原或抗原决定簇排列，优选间隔1-30纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步更优选1.6-7纳米。
包装如此处所用的术语“包装”是指聚阴离子大分子与VLP有关的状态。如此处所用的术语“包装”包括结合，这可以是共价的，例如化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。在一个优选实施方案中，术语“包装”是指VLP包封或部分包封聚阴离子大分子。因此，聚阴离子大分子可以被VLP包封，而不需存在实际上的结合，特别是共价结合。在优选的实施方案中，至少一个聚阴离子大分子被包装在VLP内，最优选地以非共价的方式。
聚阴离子大分子如此处所用的术语“聚阴离子大分子”是指包含重复负电荷基团的高相对分子量的分子，其结构基本包括实际上或概念上来源于低相对分子量的分子的多个重复单位。聚阴离子大分子的分子量应当为至少2000道尔顿，更优选至少3000道尔顿，甚至更优选至少5000道尔顿。如此处所用的术语“聚阴离子大分子”典型且优选地指不能活化toll-样受体的分子。因此术语“聚阴离子大分子”典型且优选地不包括Toll-样受体配体，甚至更优选地不包括免疫刺激物，如Toll-样受体配体、免疫刺激性核酸和脂多糖(LPS)。更优选地，如此处所用的术语“聚阴离子大分子”是指不能诱导细胞因子产生的分子。甚至更优选地，术语“聚阴离子大分子”不包括免疫刺激物。
聚天冬氨酸如此处所用的术语“聚天冬氨酸”应当是指一种多肽，在组成所述多肽的氨基酸总数中包含至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少99％，更优选100％的天冬氨酸分子。天冬氨酸分子是全L型或全D型或其混合物。
聚谷氨酸如此处所用的术语“聚谷氨酸”是指一种多肽，在组成所述多肽的氨基酸总数中包含至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少99％，更优选100％的谷氨酸分子。谷氨酸分子是全L型或全D型或其混合物。
聚(GluAsp)如此处所用的术语“聚(GluAsp)”是指一种多肽，在组成所述多肽的氨基酸总数中总共包含至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，或更优选至少95％，更优选至少99％的谷氨酸和天冬氨酸分子。谷氨酸分子和天冬氨酸分子是全L型或全D型或其混合物。
多肽如此处所用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质。该术语也包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。
如此处所用的术语“重组VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。如此处所用的术语“重组产生的VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。因此，术语“重组VLP”和术语“重组产生的VLP”在此可以交换使用，并且应当具有相同的含意。
具有二级结构的RNA，优选核酸如此处所用的术语“具有二级结构的RNA，优选核酸”是指可以嵌入溴化乙锭，因此可以通过溴化乙锭在紫外光下的荧光而显现的RNA，优选核酸。根据本发明向具有二级结构的宿主RNA，优选宿主核酸内嵌入溴化乙锭的典型且优选的方法在本发明的实施例2和3中以QβVLP为例描述。向Qβ以外的VLP所含的具有二级结构的宿主RNA，优选宿主核酸内嵌入溴化乙锭典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。
宿主RNA，优选宿主核酸如此处所用的术语“宿主RNA，优选宿主核酸”是指最初由宿主合成的RNA，或优选核酸。然而，RNA，优选核酸在减少或去除RNA，优选核酸的量的过程中可能经受化学和/或物理学改变，典型且优选地通过本发明的方法，例如，RNA，优选核酸的大小可能被缩短，或者其二级结构可能改变。但是，甚至这种得到的RNA或核酸仍然被认为是宿主RNA，或宿主核酸。
具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量如此处所用的术语“具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量”是指可以嵌入溴化乙锭，因此可以通过溴化乙锭在紫外光下的荧光显现的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量。根据本发明测定可以嵌入溴化乙锭的宿主RNA，优选核酸的量，即测定VLP所包含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量的典型且优选的方法，是测定嵌入RNA，优选核酸内的溴化乙锭的量，如本发明的实施例2和3中以QβVLP为例所述。测定Qβ以外的VLP所含的具有二级结构的宿主RNA，优选宿主核酸的量典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。
VLP原来所含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量如此处所用的术语“VLP原来所含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量”是指在宿主重组产生之后，但是在减少或去除(典型且优选地)相同VLP的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量之前，VLP所含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量，典型且优选地这种减少或去除是通过本发明的方法实现的。在上下文中使用的“相同VLP”典型且优选地是指来源于同一批表达的VLP。典型且优选地，如此处所用的术语“VLP原来所含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量”是指在宿主重组产生之后，而且在接着纯化得到的VLP之后，但是在减少或去除(典型且优选地)相同VLP的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量之前，VLP所含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量，典型且优选地这种减少或去除是通过本发明的方法实现的。如上所述，在上下文中使用的“相同VLP”典型且优选地是指来源于同一批表达，优选同一批纯化的VLP。重组产生的VLP典型且优选地从宿主细胞裂解物中纯化。从宿主细胞裂解物中纯化VLP的方法在现有技术中已有公开，例如WO 02/056905，WO 04/007538，或优选地，本申请的实施例1对于QβVLP所述。典型且优选地，根据本发明减少具有二级结构的宿主RNA，优选核酸通过如下步骤测定保留足够一部分的重组表达的VLP，优选纯化后的VLP，以备后来，优选地同时，首先测定该VLP原来所含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量，其次测定本发明的VLP，即典型且优选地在应用本发明的方法之后获得的VLP，所含的具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量。如上所述，测定具有二级结构的宿主RNA，优选核酸的量的典型且优选的方法如本发明实施例2和3中以QβVLP为例所述。测定Qβ以外的VLP所含的具有二级结构的宿主RNA，优选宿主核酸的量典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。
自身抗原如此处所用的术语“自身抗原”是指(i)由宿主DNA编码的多肽或蛋白质，或由宿主DNA编码的多肽或RNA衍生的产物；(ii)与(i)具有高同源性的多肽或蛋白质，其中所述同源性为至少90％，更优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，典型且优选地诱导与(i)的多肽或蛋白质特异性结合的抗体的体内产生；以及(iii)如(i)定义的自身抗原的直向同源物(ortholog)。典型且优选地，所述直向同源物诱导与(i)的多肽或蛋白质特异性结合的抗体的体内产生。术语“直向同源物”是指从一个物种中获得的多肽或蛋白质，它是来自不同物种的多肽的功能对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。如此处所用的术语“自身抗原”应当还包括化学修饰，包括但不限于如上所述的自身抗原的糖基化、乙酰化、磷酸化。而且，如此处所用的术语“自身抗原”优选地也涉及由两种或几种自身抗原的组合产生的多肽。
自身抗原的片段如此处所用的术语“自身抗原的片段”是指这样一种多肽，它包含自身抗原的一部分或者由其组成，优选地具有至少4个、优选至少5个、更优选至少6个、至少7个、至少8个、或者更优选至少12个或至少15个氨基酸的长度，典型且优选地诱导与自身抗原定义中的(i)的多肽或蛋白质特异性结合的抗体的体内产生。如此处所用的术语“自身抗原的片段”应当还包括化学修饰，包括但不限于如上定义的“自身抗原的片段”的糖基化、乙酰化、磷酸化。
自身抗原的变体如此处所用的术语“自身抗原的变体”是指与自身抗原定义中的(i)的多肽或蛋白质具有同源性的多肽，其中所述同源性为至少75％，更优选至少80％，更优选至少87％，典型且优选地它诱导与自身抗原定义中的(i)的多肽或蛋白质特异性结合的抗体的体内产生。如此处所用的术语“自身抗原的变体”应当还包括化学修饰，包括但不限于如上定义的“自身抗原的变体”的糖基化、乙酰化、磷酸化。
Toll-样受体(TLR)配体Toll-样受体(TLR)由骨髓单核细胞和内皮和上皮细胞以及来自各种器官系统的细胞表达。Toll-样受体是跨膜蛋白，它们全都具有共同的富含亮氨酸的胞外域和保守的胞质域。TLR的胞质域与IL-1和IL-18受体同源，并且含有这些受体共同的Toll/IL-1受体(TIR)同源域。Toll-样受体具有相同的通过其TIR信号域介导的活化途径，导致核转位和促炎转录因子NF-kB的活化(Abreu M.T.和Arditi M.J.Pediatrics(2004)，421-9)。迄今为止已经从人类基因组中克隆了10种不同的TLR分子(Zarember KA等人，J.Immunol.(2002)，168554-61)，在小鼠中已经克隆了11种TLR(Zhang等人，science，(2004)，3031522-6)。
如此处所用的术语“Toll-样受体配体”或“TLR配体”是指任何能够活化至少一种TLR的配体(参见例如，Beutler，B.2002，Curr.Opin.Hematol.，9，2-10，Schwarz等人，2003，Eur.J.Immunol，33，1465-1470)。本发明的TLR配体没有限制地活化至少一种Toll-样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10或TLR11。例如，肽聚糖(PGN)或脂磷壁酸(LTA)典型且优选地活化TLR2(Aliprantis等人，Science(1999)，285736-9；Underhill，等人，Nature，(1999)，401811-5)；双链RNA，例如poly(I:C)，典型且优选地活化TLR3(Alexopoulou等人，Nature(2001)，413732-8)；脂多糖(LPS)典型且优选地活化TLR4(Poltorak等人，Science(1998)，2822085-8)；鞭毛蛋白典型且优选地活化TLR5(Hayashi等人，Nature(2001)，4101099-103)；单链RNA，如细菌RNA，和某些合成物质如咪唑喹啉，典型且优选地活化TLR7和TLR8(Diebold S.等人，Science 3031529；Heil，FH.等人，Science 3031526)；细菌DNA，特别是含CpG基序的DNA，典型且优选地活化TLR9(Schnare等人，Curr.Biol.(2000)，101139-42；Hemmi H等人，Nature(2000)，408740-5)。这些被引用的文章这里引入作为参考。TLR配体的概述在Abreu的综述文章的表中给出，在此也引用作为参考(Abreu M.T.和Arditi M.J，Pediatrics(2004)，421-9)，关于TLR 11及其配体在Zhang等人，Science，(2004)，3031522-6中描述。通过参考这些引用的文章，再结合本领域技术人员的公知常识，检测一种分子是否是本发明的TLR配体，以及TLR配体是否活化至少一种TLR，是常规实验。
一种常用的、典型且优选的测定本发明的Toll-样受体活化的方法是，用能够表达至少一种Toll-样受体的构建体转染一种不表达Toll-样受体的细胞系。NF-kB活化的报道基因，如萤光素酶，能够转染到所述细胞系中，或者被所述细胞系的基因组所包含。向细胞培养物中添加待测分子后，可以定量测定报道基因的活性并与未加入待测分子的细胞进行比较。对于TLR1和TLR6活性检测，TLR2的共表达是必要的。对于本领域技术人员而言显而易见的，某些不稳定的TLR-配体，如具有二级结构的RNA，需要稳定化后进行检测。一种稳定化方法是将具有二级结构的RNA包装到脂质体或用于转染的物质(例如DOTAP)内。
TLR序列的参考可在数据库Swissprot中找到，登记号为TLR1_human；TLR2_human；TLR3_human；TLR4_human；TLR5_human；TLR6_human；TLR7_human；TLR8_human；TLR9_human。人TLR10可以在GenBank登记号AAQ88667或AAK26744下找到。在Swissprot数据库中，小鼠序列的登记号相应地为TLR1_mouse；TLR2_mouse；TLR3_mouse；TLR4_mouse；TLR5_mouse；TLR6_mouse；TLR7_mouse；TLR8_mouse；TLR9_mouse；TLR10_mouse。小鼠TLR11在GenBank中的登记号为AY531552。本领域技术人员可以为其他哺乳动物种的TLR受体建立相应的试验。
根据本发明进行这种检测的典型且优选的例子如下3×106HEK293细胞在200伏和960μF条件下用1μg的TLR表达质粒和20ng NF-KB萤光素酶报道分子-质粒进行电穿孔。质粒DNA的总量通过加入适当的空表达载体而维持恒定在每次电穿孔15μg。以每孔105个细胞的密度接种细胞，过夜培养后用受试配体刺激7到10个小时。已知TLR配体的浓度范围的典型例子是25μg/ml与DOTAP复合的RNA40-42(促进RNA在细胞内的内化)，1μM CpG-ODN 2006，10μMR-848，50μg/ml poly(I:C)或1μg/ml Pam3Cys(Heil，FH.等人，Science 3031526)。受刺激的细胞用报道裂解缓冲液(Promega，Mannheim，德国)裂解，且根据厂商说明，使用发光计，典型和优选地使用Berthold发光计(Wildbad，德国)，测定裂解物的萤光素酶活性。为了检测任意配体而对前述试验作相应调整是本领域技术人员的常识。
根据本发明，当诱导产生的萤光素酶活性在统计学上显著高于从阴性对照活性测得的阈值(同样的试验、同样的试验条件，只是不加入受试配体)时，认为该配体活化TLR。这里所指的阈值被定义为六个独立试验中阴性对照的萤光素酶活性的平均值加来自这六个试验的萤光素酶活性的标准差的三倍。典型和优选地，当配体的萤光素酶活性高于如上述所测的阈值时，认为该配体″统计学上显著地″活化TLR。优选地，当配体的荧光素酶活性高于如上述所测的阈值至少两倍，优选高于三倍，更优选高于五倍时，认为该配体″统计学上显著地″活化TLR。
RNA噬菌体的病毒样颗粒如此处使用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段或者优选基本由其组成或者由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，并且是非复制性或非传染性的，典型且优选地是非复制性且非传染性的。典型且优选地，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”应当还涉及这样的RNA噬菌体的病毒样颗粒其缺少编码RNA噬菌体的复制机制的至少一个基因，优选所有基因，典型且进一步优选地，甚至缺少编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的至少一个基因，优选所有基因。然而，该定义应当也包括上述基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体的病毒样颗粒，于是也产生非复制性和/或非传染性的RNA噬菌体的病毒样颗粒。而且，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”在其最广义的定义中应当也包括其基因组已通过物理或化学或遗传方法灭活，因而该病毒颗粒不能感染和/或复制的RNA噬菌体的病毒颗粒。优选的来源于RNA噬菌体的VLP表现为二十面体对称，并且由180个亚单位组成。在本申请的公开内容中，术语“亚单位”和“单体”可互换使用，并且在上下文中等同地使用。
多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序的已知计算机程序常规确定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序，优选使用Bestfit确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5％的同源性缺口。上述测定多肽之间百分同一性的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多肽或其片段。
一种或一个术语“一种”或“一个”在本申请中使用时，除非另外说明，是指“至少一种/个”或“一种/个或一种/个以上”。
本发明提供一种组合物，包含(a)一种病毒样颗粒(VLP)，其包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述VLP具有至少一个第一附着位点，其中所述VLP是由宿主重组产生的，并且其中VLP包含的具有二级结构的宿主RNA，优选宿主核酸的量为所述VLP原来所含的具有二级结构的宿主RNA，优选宿主核酸的量的最多20％，优选最多10％，更优选5％，更优选3％，更优选1％；(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原；其中所述至少一种抗原(b)与所述VLP(a)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。在一个优选实施方案中，本发明的VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。
在一个方面，本发明提供一种组合物，包含(a)一种病毒样颗粒(VLP)，其包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述VLP具有至少一个第一附着位点，其中所述VLP是由宿主重组产生的，并且所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原；其中所述至少一种抗原(b)与所述VLP(a)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
在一个方面，本发明提供一种组合物，包含(a)一种病毒样颗粒(VLP)，其包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述VLP具有至少一个第一附着位点，其中所述VLP是由宿主重组产生的，并且其中所述VLP含有不超过60μg，优选不超过50μg，更优选不超过40μg，更优选不超过27μg，更优选不超过20μg，更优选不超过9μg，最优选不超过5μg的具有二级结构的宿主RNA，优选宿主核酸；(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原；其中所述至少一种抗原(b)与所述VLP(a)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。在一个优选实施方案中，本发明的VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。
本发明的病毒样颗粒是重组VLP。典型且优选地，重组VLP如下产生将编码保留形成VLP能力的病毒外壳蛋白或其突变体或片段的基因克隆到表达载体中，在适合的宿主，如细菌中，典型且优选地在大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物表达系统中表达得到的构建体。
优选的例子已经在WO02/056905中公开，在此引用作为参考。特别地，WO 02/056905的实施例18公开了由Qβ制备VLP颗粒的详述。应当注意，现有技术如WO02/056905中描述的VLP-抗原偶联物在通过上述方法表达而获得并产生的VLP内仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，VLP或本发明的VLP-抗原偶联物已经用本发明的方法制备或者进一步处理，以排除、减少或者去除宿主RNA，优选宿主核酸。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由RNA-噬菌体的外壳蛋白和/或其突变体和/或片段组成。在一个进一步优选的实施方案中，该组合物包含具有至少一个第一附着位点的RNA-噬菌体的病毒样颗粒。在一个进一步优选的实施方案中，该RNA-噬菌体选自a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；j)噬菌体f2；k)噬菌体PP7和l)噬菌体AP205。在一个进一步优选的实施方案中，RNA-噬菌体的外壳蛋白具有选自包括下列序列或由下列序列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO10；SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的混合物；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14；SEQ ID NO15；SEQ ID NO15和SEQ ID NO16的混合物；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；和SEQ ID NO29。
如此处使用的术语“外壳蛋白的片段”被定义为优选地能够装配为RNA-噬菌体的病毒样结构并且长度为野生型外壳蛋白的至少70％，优选至少80％，更优选至少90％的多肽。优选地，该片段通过至少一个内部缺失或至少一个N和/或C末端的截短或至少一个其组合而获得。外壳蛋白的片段还包括优选能够装配为RNA-噬菌体的病毒样颗粒并且与如上定义的外壳蛋白的片段具有至少80％，优选90％，更优选95％的氨基酸序列同一性的多肽。
术语“突变外壳蛋白”或术语“外壳蛋白突变体”在本发明中可以交换使用，是指具有来源于野生型外壳蛋白的氨基酸序列的多肽，其序列与野生型序列至少80％，优选至少85％，90％，95％，97％或99％相同，并且优选地保留装配为VLP的能力。突变的典型且优选的例子包括相对于野生型外壳蛋白而言截短、内部缺失、添加或置换一个或多个氨基酸，相对于野生型外壳蛋白而言优选最多10个，进一步优选最多6个，更进一步优选最多4、3、2、1个氨基酸突变。“突变外壳蛋白”优选地也应当包括能够装配为VLP的野生型外壳蛋白的片段。另外，如此处使用的术语“突变外壳蛋白”优选地也应当包括具有与相应野生型外壳蛋白或其片段至少80％，优选至少85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，优选地能够装配为VLP的多肽。
如本领域技术人员应当知道的，通过在大肠杆菌中表达外壳蛋白或其突变体或片段，任选地通过凝胶过滤从细胞裂解物中纯化衣壳，并且用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(EM)(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))分析衣壳的形成，可以检测外壳蛋白或其突变体或片段向VLP的装配。免疫扩散试验和EM可以直接用细胞裂解物进行。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，VLP是一种嵌合VLP，包含RNA噬菌体外壳蛋白和/或其突变体和/或片段的一个以上的序列，优选两个序列，或者由该序列组成。优选地，嵌合VLP包含或者由RNA噬菌体的两个不同的外壳蛋白组成，所述两个外壳蛋白具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11，或SEQ ID NO15和SEQ ID NO16的氨基酸序列。在一个进一步优选的实施方案中，嵌合VLP包含或者由RNA噬菌体的两个不同的外壳蛋白组成，所述两个外壳蛋白具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的C末端截短，或SEQ ID NO15和SEQ ID NO16的C末端截短的氨基酸序列。如此处使用的术语“SEQID NO11的C末端截短”是指从SEQ ID NO11的C末端截短1，2，3，...50，...100，...150，...195或196个氨基酸产生的序列。
在本发明的进一步优选的实施方案中，本发明的病毒样颗粒和组合物包含或者基本由或者由RNA噬菌体的外壳蛋白和/或其片段和/或突变体组成，该RNA噬菌体选自a)噬菌体AP205；b)噬菌体fr；c)噬菌体R17；d)噬菌体f2；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；和j)噬菌体PP7。
在本发明的进一步优选的实施方案，本发明的病毒样颗粒和组合物包含或者基本由或者由RNA-噬菌体Qβ或RNA-噬菌体fr或RNA-噬菌体AP205或RNA噬菌体GA的外壳蛋白和/或其片段组成。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述RNA-噬菌体不是MS2。
RNA-噬菌体Qβ的衣壳或病毒样颗粒显示二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T＝3半对称。该衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，它们通过二硫键连接为共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure 4543-5554(1996))，使Qβ衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有不通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接的或不完全连接的亚单位。然而，在VLP内一般约80％以上的亚单位通过二硫键彼此连接。Qβ衣壳蛋白也表现出对有机溶剂和变性剂的不同寻常的抗性。
WO 2004/007538，特别是在实施例1和实施例2中，描述了如何获得包含或者由AP205外壳蛋白组成的VLP，以及特别是其表达和纯化。WO 2004/007538，特别是实施例1和实施例2，在此引入作为参考。然而应当注意，WO 2004/007538描述的VLP-抗原偶联物在通过表达获得和产生的VLP内仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，包含RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的VLP或本发明的VLP-抗原偶联物已经用本发明的方法制备或者进一步处理，以排除、减少或者去除宿主RNA，优选宿主核酸。
还发现其它RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后自装配(Kastelein，RA.等人，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。特别是已经公开了GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Tars，K等人，J.Mol.Biol.271759-773(1997))和fr(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993)，Liljas，L等人.J Mol.Biol.244279-290，(1994))的生物学和生化性质。
在一个优选实施方案中，通过置换或通过删除而除去至少一个或至少两个赖氨酸残基，从而修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白。在另一个实施方案中，通过置换或通过插入而添加至少一个或至少两个赖氨酸残基，从而修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白。在一个非常优选的实施方案中，突变外壳蛋白是RNA噬菌体Qβ的突变外壳蛋白，其中已经通过置换或通过删除除去了至少一个或至少两个赖氨酸残基。在一个可替代的非常优选的实施方案中，突变外壳蛋白是RNA噬菌体Qβ的突变外壳蛋白，其中已经通过置换或通过插入添加了至少一个或至少两个赖氨酸残基。在一个进一步优选的实施方案中，RNA噬菌体Qβ的突变外壳蛋白具有选自SEQ ID NO23-27中任一个的氨基酸序列。至少一个赖氨酸残基的缺失、置换或添加可以改变偶联程度，即每个RNA-噬菌体VLP亚单位上本发明的抗原的量，特别是，用来匹配和适应疫苗的要求。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO 02/056905中描述。特别参考上述申请的实施例18。应当注意，在现有技术如WO 02/056905中描述的VLP-抗原偶联物在通过表达而获得和产生的VLP内仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，包含Qβ突变外壳蛋白的VLP或本发明的VLP-抗原偶联物已经通过本发明的方法制备或者进一步处理，以排除、减少或去除宿主RNA，优选宿主核酸。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的组合物和疫苗具有0.05到4.0的抗原密度。如此处所用的术语“抗原密度”是指RNA噬菌体的VLP的每个亚单元上，优选每个外壳蛋白上连接的抗原的平均数。因此，该值可以计算为在本发明的组合物或疫苗中VLP的所有亚单元或单体上的平均数。在其中抗原分子量等于或大于8KDa的本发明一个进一步优选的实施方案中，抗原密度优选地为0.1至1.5。在其中抗原优选地由5-30个氨基酸组成的一个进一步优选的实施方案中，抗原密度优选地为0.5至4。
在一个优选实施方案中，VLP包含或者基本由或者由RNA噬菌体Qβ、fr、AP205或GA的突变外壳蛋白和/或其片段组成。
在本发明的一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由Qβ的外壳蛋白、其突变体或片段组成，其中该外壳蛋白包含、基本由或者由上述一种突变体和相应的A1蛋白的混合物组成。
在本发明的实践中也可以使用AP205VLP的能够装配的突变形式，包括在氨基酸5位脯氨酸置换为苏氨酸或在氨基酸14位天冬氨酰胺置换为天冬氨酸的AP205外壳蛋白，导致本发明的其他优选的实施方案。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-554(1996))。利用这些信息，能够确定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA-噬菌体的外壳蛋白，以便能够通过插入或置换插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，噬菌体外壳蛋白的那些修饰形式也可用于本发明。来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中，特别是在大肠杆菌中的高表达产量，这允许以可承受的成本产生大量的物质。
在本发明的另外一个优选实施方案中，该组合物还包含与VLP结合的至少一种聚阴离子大分子。优选地，所述聚阴离子大分子包装在VLP内。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种聚阴离子大分子选自(a)聚阴离子多肽；(b)聚阴离子糖，其中优选地所述聚阴离子糖不是LPS；(c)聚阴离子有机聚合物；和(d)核酸，其中优选地所述核酸不是Toll-样受体配体，优选地不是免疫刺激性核酸。
在进一步优选的实施方案中，所述至少一种聚阴离子大分子是核酸，其中所述核酸不是Toll-样受体配体。在进一步优选的实施方案，所述核酸包含或者由20种以上的核苷酸组成。在一个进一步优选的实施方案中，所述核酸是tRNA。tRNA可以购自化学公司或者从生物体中提取。用于本发明的优选的tRNA是，例如，小麦胚tRNA或酵母tRNA。在另一个优选的实施方案中，所述核酸是DNA，其中该DNA不含CpG基序，并且不刺激TLR9。
在优选的实施方案中，所述聚阴离子多肽选自(a)聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d)(a)至(c)的任意化学修饰。化学修饰的例子包括但不限于糖基化、乙酰化和磷酸化。
在本发明其他优选实施方案中，所述聚阴离子糖选自(a)阴离子葡聚糖；(b)磷酸纤维素；(c)聚葡萄糖醛酸；(d)聚半乳糖醛酸；(e)聚唾液酸；(f)透明质酸；和(g)糖胺聚糖。在进一步优选的实施方案中，所述阴离子葡聚糖选自(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙基葡聚糖；(d)磺酸甲酯葡聚糖；和(e)磷酸葡聚糖。在另一个进一步优选的实施方案中，所述糖胺聚糖选自(a)肝素；(b)硫酸乙酰肝素；(c)硫酸皮肤素；(d)硫酸软骨素；和(e)硫酸角质素。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述聚阴离子有机聚合物选自(a)聚乙烯硫酸酯和(b)聚丙烯酸酯。
在本发明的特定优选的实施方案中，所述至少一种聚阴离子大分子的分子量是约2,000到约200,000道尔顿，最低分子量优选为至少约3000道尔顿，更优选至少约5000道尔顿，更优选至少约7000道尔顿。最高分子量优选为最多约200,000道尔顿，优选最多约180,000道尔顿，更优选最多约160,000道尔顿，更优选最多约150,000道尔顿。
根据聚阴离子大分子的性质，优选的分子量范围不同。例如，对于聚阴离子多肽，特别是对于聚谷氨酸和聚天冬氨酸，优选的分子量为5000道尔顿至150,000道尔顿。最低分子量优选为至少约5000道尔顿，更优选至少约10,000道尔顿，更优选至少约30,000道尔顿。最高分子量优选为最多约150,000道尔顿，优选最多约120,000道尔顿，更优选地最多约100,000道尔顿。
在一个非常优选的实施方案中，本发明的组合物包含至少一种聚阴离子大分子，其中优选地所述聚阴离子大分子是至少一种聚阴离子多肽，更优选地其中所述聚阴离子大分子是至少一种聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。
聚阴离子大分子可以方便地购自化学公司。例如，聚谷氨酸和聚天冬氨酸可以购自Sigma(Sigma，New Jersey，USA)，包括宽范围的分子量(聚谷氨酸750-1,500，1,500-3,000，3,000-15,000，15,000-50,000，50,000-100,000；聚天冬氨酸5,000-15,000，15,000-50,000)。分子量的测定基于粘度(Idelson，M.和Blout，E.R.(1958)J.Am.Chem.Soc.80，p.4631)和LALLS法，即小角激光光散射法。
聚半乳糖醛酸(MW，25,000-50000)可以购自Fluka(Fluka，Buchs，Switzerland)，硫酸葡聚糖(MW 5,000，8,000和10000)购自Sigma，硫酸葡聚糖(MW 100,000)购自Fluka。分子量通过LALLS、粘度法或凝胶过滤法测定。有机聚合物如聚乙烯硫酸酯(MW～170,000)购自Aldrich。
在另一个方面，本发明提供一种分别制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，包括以下步骤(a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段；(b)将所述VLP与能够水解宿主RNA，优选宿主核酸的含有金属离子的溶液温育；和(c)连接具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原与从(a)或(b)获得的所述VLP，优选从步骤(b)获得的所述VLP。在优选的实施方案中，金属离子选自锌(Zn)离子、铜(Cu)离子和铁(Fe)离子。进一步优选地，所述VLP的温育步骤之后为至少一个纯化所述VLP的步骤，优选通过透析除去被消化的核酸。
在另一个方面，本发明提供一种分别制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，包括以下步骤(a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段；(b)将所述VLP与RNase温育；和(c)连接具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原与从步骤(a)或(b)获得的所述VLP，优选从步骤(b)获得的所述VLP。在一个优选实施方案中，RNase是RNase A。在另一个优选的实施方案中，所述VLP与所述RNase，优选所述RNase A的温育在低离子强度缓冲液中进行，其中优选地，所述低离子强度缓冲液具有低于50mM，更优选低于40mM，更优选等于或低于30mM的浓度，其中进一步优选地，所述低离子强度缓冲液具有30mM的浓度。进一步优选地，所述VLP的温育步骤之后为至少一个纯化所述VLP的步骤，优选通过透析除去被消化的核酸。
在另一个方面，本发明提供一种分别制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，包括以下步骤(a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段；(b)将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA-噬菌体的所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(d)将所述纯化的所述RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；和(e)连接具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原与从步骤(d)获得的所述VLP。在一个进一步优选的实施方案中，纯化的外壳蛋白的重装配在存在和/或添加至少一种聚阴离子大分子的条件下实现。本发明的方法特别有利，因为它特别是通过解装配步骤允许释放基本上全部的宿主核酸。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述病毒样颗粒的解装配优选地在变性条件下进行。优选的变性条件是高盐浓度，如0.5M至1M氯化镁或5M以上的尿素。进一步优选地，纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段的步骤通过阳离子交换层析和/或大小排阻层析实现，特别是，从而分离宿主核酸和所述外壳蛋白、其突变体或片段。
在另一方面，本发明提供一种分别制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，包括以下步骤(a)由宿主重组产生RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段；(b)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)形成具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；和(d)连接具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原与从步骤(c)获得的所述VLP。在一个进一步优选的实施方案中，纯化的外壳蛋白的重装配在存在和/或添加至少一种聚阴离子大分子的条件下实现。
在另一个方面，本发明提供一种分别制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，其中VLP和抗原通过至少一个肽键连接。该方法包括以下步骤(a)由宿主重组产生含有RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段和抗原的融合蛋白；(b)纯化所述融合蛋白；(c)形成病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本上不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，纯化的融合蛋白的重装配在存在和/或添加至少一种聚阴离子大分子的条件下实现。
可替代的方法包括以下步骤由宿主重组产生一种病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含含有RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段和至少一种抗原的融合蛋白；将所述VLP解装配为所述融合蛋白；纯化所述融合蛋白；将所述纯化的融合蛋白重装配为VLP，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，纯化的融合蛋白的重装配在存在和/或添加至少一种聚阴离子大分子的条件下实现。在一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。
在本发明一个非常优选的实施方案中，本发明的组合物包含RNA噬菌体Qβ、AP205、fr或GA的，更优选RNA噬菌体Qβ或GA的，最优选RNA噬菌体Qβ的基本不含宿主核酸的VLP，该组合物还包含至少一种聚阴离子分子，优选聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。在本发明的另外一个优选实施方案中，该组合物包含基本不含宿主核酸的RNA噬菌体AP205或fr的VLP，进一步不含至少一种聚阴离子大分子。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原选自蛋白质、多肽、碳水化合物、类固醇激素、有机分子和半抗原。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是半抗原。优选的半抗原是激素、药物和毒性化合物。进一步优选的是药物，特别是成瘾性药物和滥用药物，特别是消闲性药物(recreationaldrug)。这种抗原的代表性例子包括类罂粟碱和吗啡衍生物，如可待因、芬太尼、海洛英、吗啡和鸦片；弛缓剂，如地西泮；兴奋剂，如安非他命、可卡因、MDMA(亚甲基二氧基甲基苯丙胺)、甲基苯丙胺、哌甲酯和尼古丁；致幻剂，如PCP、LSD、麦斯卡林和西洛西宾；大麻素类，如印度大麻(hashish)和大麻(marijuana)；以及地昔帕明/米帕明类药物，和去甲替林/阿米替林类药物。尼古丁成瘾的治疗也可以针对尼古丁衍生物，如O-琥珀酰基-S′-羟甲基-尼古丁，代谢物，包括降烟碱和可替宁。
连接尼古丁或尼古丁衍生物或其它滥用药物如可卡因与VLP的详述在WO 2004/009116中，特别是第61页第28行至第66页第13行公开。WO 2004/009116的一般性和具体的公开内容在此引用作为参考。
因此在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是选自成瘾性药物的有机分子，其中优选地所述成瘾性药物是尼古丁或可卡因，优选尼古丁。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是自身抗原或其片段或变体。优选地，该自身抗原是适合诱导针对所述自身抗原的免疫应答的蛋白质或其片段。因此，本发明提供适合在预防和/或减弱由“自身”基因产物(例如肿瘤坏死因子)引起或加重的疾病或状况的方法中使用的疫苗组合物。因此，本发明的疫苗组合物包括导致产生预防和/或减弱由“自身”基因产物引起或加重的疾病或状况的抗体的组合物。这类疾病或状况的例子包括移植物抗宿主疾病、IgE-介导的变态反应、过敏症、成人型呼吸窘迫综合征、克罗恩病、变应性哮喘、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、格雷夫斯氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性自身免疫病、重症肌无力、免疫增生性淋巴结病(IPL)、血管免疫增生性淋巴结病(AIL)、免疫母细胞性淋巴结病(IBL)、类风湿性关节炎、糖尿病、牛皮癣、心肌炎、多发性硬化、阿尔茨海默病和骨质疏松症。
在本发明一个非常优选的实施方案中，本发明的至少一种抗原选自淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))，淋巴毒素受体，核因子kB配体的受体激活物(RANKL)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管内皮生长因子受体(VEGF-R)，白介素-5，白介素-17，白介素-13，IL-23 p19，生长素释放肽(Ghrelin)，CCL21，CXCL 12，SDF-1，M-CSF，MCP-1，Endoglin，GnRH，TRH，嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)，缓激肽，BLC，肿瘤坏死因子α，淀粉样β肽(Aβ1-42)，Aβ1-6，血管紧张肽，胃泌素，前胃泌素，CETP，CCR5，C5a，CXCR4，Des-Arg-缓激肽，或上述抗原的片段或变体。用于上述抗原时，术语这些抗原的“片段”是指(i)包含或者优选地由下列氨基酸组成的任何多肽相应抗原的序列的，或者对于自身抗原而言，GeneBank登录的野生型抗原的人序列的，或来自任何其他动物的相应直向同源物的，优选GeneBank登录的野生型抗原的人序列的至少4、5、优选至少6、7、8、9、10、11、12、17、18、19、20、25或30个连续氨基酸；以及(ii)与(i)的任意一种多肽具有氨基酸序列同一性的任何多肽，其中所述氨基酸序列同一性大于65％，优选大于80％，更优选大于90％，更优选大于95％。此外，术语上述抗原的“片段”应当包括至少一个抗原性位点。优选地，如此处所用的术语上述抗原的“片段”应当是指长度不超过100个氨基酸，优选不超过80个氨基酸，优选不超过60个氨基酸，更优选不超过40个氨基酸，更优选不超过30个氨基酸，更优选不超过20个氨基酸的多肽。进一步优选地，如此处所用的并且当用于自身抗原时，术语上述抗原的“片段”应当是指当根据本发明呈递时应当能够在体内诱导抗体产生的多肽，这种抗体特异性结合上述相应的抗原。而且，如此处所用的术语上述抗原的“片段”应当优选地指由相应抗原的至少一个，优选两个，更优选一个截短或内部缺失而产生的多肽。测定蛋白质的抗原性位点的方法是本领域技术人员公知的。美国临时申请60/569,322从第26页第一段到第27页第四段详细描述了一些这样的方法，这些具体公开内容在此引用作为参考。应当注意，这些方法通常适用于其他多肽抗原，因此不限于如US 60/569,322所述的IL-23 p19。
当用于上述抗原时，术语这些抗原的“变体”应当指包含或者优选由任何天然或基因工程多肽或蛋白质组成的任何多肽或任何蛋白质，它与上述抗原的序列，或者对于自身抗原而言，与GeneBank登录的野生型抗原的人序列或来自任何其他动物的相应直向同源物的序列，优选地与GeneBank登录的野生型抗原的人序列，具有70％以上，优选80％以上，甚至更优选90％以上，再更优选95％以上，最优选97％以上的氨基酸序列同一性。产生蛋白质变体的优选方法是通过基因工程，优选通过插入、置换、缺失或其组合。蛋白质的变体当根据本发明呈递时，应当能够在体内诱导抗体的产生，该抗体特异性结合上述相应的抗原。
在本申请中，如果抗体与本发明的抗原、抗原蛋白质、抗原片段或抗原变体结合的结合亲和力(Ka)为106M-1或更高，优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高，则该抗体被定义为特异性结合。本领域技术人员可以容易地测定抗体的亲和力，典型且优选地通过Scatchard分析。
在一个优选实施方案，所述至少一种抗原是GnRH-肽(促性腺激素释放激素，也被称为促黄体激素释放激素，或LHRH)。PCT/EP2005/053858中公开了在疫苗生产中有用的VLP-GnRH偶联物，在此完整引入作为参考。
如此处所用的术语“GnRH-肽”是包含或者基本由或者由以下成分组成的多肽至少一个，优选一个哺乳动物GnRH，特别是SEQ ID NO1或SEQ ID NO28，优选SEQ ID NO1的至少一个氨基酸序列，优选一个氨基酸序列，或其片段或变体。在一些实施方案中，GnRH肽包含N末端焦谷氨酸(puroglutamic acid)(pGlu或pE)。在其他实施方案中，GnRH肽包含C末端甘氨酸酰胺(G-NH2)。在本发明的另一个实施方案中，GnRH肽包含一个以上的GnRH肽或其片段，例如两个如SEQ ID NOs30-32所示的，三个或更多的串联的GnRH肽或其片段。本发明的串联-GnRH肽也包括其中GnRH序列通过间隔区互相连接的肽。间隔基的性质可能非常不同，从一个或多个氨基酸到较短或较长的烃链和其他化合物基团或分子。
在优选的实施方案中，GnRH肽与包含半胱氨酸或者由半胱氨酸组成的氨基酸连接体连接。在一个进一步优选的实施方案中，所述氨基酸连接体是与GnRH肽的N或C末端融合的半胱氨酸。在一个进一步优选的实施方案中，半胱氨酸与SEQ ID NO1的N或C末端融合(产生SEQ ID NO4或5)，优选与SEQ ID NO1的N末端融合(SEQ ID NO4)。在另一个优选的实施方案，连接体CGG与GnRH肽的N末端融合，优选地与SEQ ID NO1或SEQ ID NO28的N末端融合，更优选地与SEQID NO1的N末端融合，产生SEQ ID NO2。在另一个优选的实施方案中，连接体GGC与GnRH肽的C末端融合，优选与SEQ ID NO1或SEQ ID NO28的C末端融合，更优选与SEQ ID NO1的C末端融合，产生SEQ ID NO3。
这种含有GnRH作为至少一种抗原的本发明的组合物可以向诸如猪的哺乳动物施用，以防止肉的膻味。这种含有GnRH的组合物可以向诸如狗、猫、绵羊、牛的动物施用，以控制它们的繁殖行为和/或降低它们的繁殖力。这种含有GnRH的修饰的VLP可以向患有依赖于类固醇性激素的癌症的人施用。
在一个优选实施方案中，本发明的至少一种抗原是淀粉样β肽(Aβ1-42)，其具有氨基序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO86)，或其片段，如具有氨基序列DAEFRH(SEQ IDNO87)的Aβ1-6。淀粉样β肽的积累可能引起或加重阿尔茨海默病，因此本发明的组合物提供一种治疗或缓解该疾病状态的方法。各种Aβ片段与各种VLP如Qβ或fr的偶联和它们对小鼠的免疫已经在WO02/056905的实施例13、15、17和54中公开，在此完整引入作为参考。Aβ1-6片段与病毒外壳蛋白的融合在WO04/016282的实施例7、8、9、10、11中已经公开；Aβ1-6与VLP的偶联在实施例13、18、20中公开；VLP-Aβ1-6对动物的免疫和产生的疫苗效果在WO04/016282的实施例12、14、16、17、19和20中已经公开。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是生长素释放肽或其片段或变体。生长素释放肽是进食行为的一种关键调节剂。外周施用生长素释放肽增加了食物摄取，导致体重增加(Tschop等人，Nature 407908-12)。因此，根据本发明针对生长素释放肽免疫提供了一种治疗肥胖症的方法。优选的生长素释放肽或生长素释放肽的肽已经在WO04/009124的第68-74页公开。除人类以外，生长素释放肽可以选自其他哺乳动物种，如狗和猫。WO04/009124的实施例8、9、13、15公开了一些偶联生长素释放肽和VLP的方法，在此引用作为参考。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原是包含或者由氨基酸序列SEQ ID NO77，SEQ ID NO78，SEQ ID NO79或SEQ ID NO82或SEQ ID NO85组成的生长素释放肽片段。在另一个进一步优选的实施方案，所述至少一种抗原是包含或者由SEQ IDNO83组成的生长素释放肽片段，其中所述本发明的组合物优选地向狗施用；或者是包含或者由SEQ ID NO84的生长素释放肽片段，其中所述本发明的组合物优选地向猫施用。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是IL-23 p19蛋白或IL-23 p19片段，如PCT/EP2005/004980所述，其在此完整引用作为参考。在一个优选实施方案中，IL-23蛋白包含、或者基本由、或者由SEQ ID NO6或SEQ ID NO7组成。在一个优选实施方案中，IL-23片段包含、或者基本由、或者由选自以下的任意序列组成(a)SEQ ID NOs8-9和(b)SEQ ID NOs33-44(c)序列(a)和(b)中任一个的片段或变体。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是血管紧张肽或其片段。如此处所用的术语“血管紧张肽”应当包括含有血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的序列或其片段的任何肽。其序列如下血管紧张肽原DRVYIHPFHLVIHN(SEQ ID NO108)；血管紧张肽IDRVYIHPFHL(SEQ ID NO109)；血管紧张肽IIDRVYIHPF(SEQ ID NO110)。典型地，一个或多个另外的氨基酸被添加到血管紧张肽序列的C末端或N末端。这些另外的氨基酸特别地具有与VLP定向且有序地结合的价值。进一步优选的实施方案在WO03/031466中已经公开，在此引用作为参考。特别优选的具有第二附着位点的血管紧张肽片段序列选自a)CGGDRVYIHPF(SEQ IDNO111)；b)CGGDRVYIHPFHL(SEQ ID NO112)；c)DRVYIHPFHLGGC(SEQID NO113)；d)CDRVYIHPFHL(SEQ ID NO114)；e)CHPFHL(SEQ IDNO115)；f)CGPFHL(SEQ ID NO116)；g)CYIHPF(SEQ ID NO117)；h)CGIHPF(SEQ ID NO118)；i)CGGHPF(SEQ ID NO119)；j)DRVYIGGC(SEQ ID NO120)；k)DRVYGGC(SEQ ID NO121)；和l)DRVGGC(SEQID NO122)。因此本发明的组合物提供一种治疗或缓解高血压的疾病状态的方法。该组合物的制备及其用途的详细描述在WO 03/031466中已经公开，该完整申请在此引用作为参考。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是RANKL(NF kB配体的受体激活物)，或其片段或变体。RANKL是一种245个氨基酸的跨膜蛋白，属于TNF超家族。胞外区部分(178aa)可以被TACE-样蛋白酶释放出(Lum等人，J Biol Chem.27413613(1999))。人RANKL的胞外部分的氨基酸序列在WO02/056905的SEQ IDNO221(TrEMBL014788)中显示，人同种型的氨基酸序列在SEQ IDNO222中显示。鼠RANKL和同种型的胞外部分的序列在WO02/056905的SEQ ID NO223(TrEMBL035235)和SEQ ID NO224(TrEMBLQ9JJK8和TrEMBLQ9JJK9)中显示。
已经表明RANKL是破骨细胞生成(osteoclastogenesis)中的一种重要因子。RANKL与其受体RANK的相互作用的抑制可以导致破骨细胞生成的抑制，因此提供了一种终止在骨质疏松症和其他疾病中所见的过度骨再吸收的方法。
本发明的一个非常优选的实施方案是一种人-RANKL构建体，它具有含有半胱氨酸残基的N末端氨基酸连接体，该连接体与RANKL的胞外部分融合。关于RANKL的生理学功能、其表达方法的其他信息在WO02/056905第62至64页已经公开，人-RANKL构建体在WO02/056905的实施例6中已经公开，在此引入作为参考。RANKL蛋白、片段或RANKL肽变体的进一步优选的实施方案在WO03/039225第223至235段中已经公开，在此引入作为参考。
在本发明的另一个实施方案中，所述至少一种抗原是白介素-17(IL-17)，或其片段或变体。人IL-17是一种32-kDa的、二硫键连接的、具有可变糖基化的同型二聚体蛋白质(Yao，Z.等人，J.Immunol.1555483-5486(1995))。人和小鼠IL-17的氨基酸序列在WO02/056905的SEQ ID No228(登记号AAC50341)和SEQ ID NO229(登记号AAA37490)中分别给出。
临床研究表明IL-17可能参与许多炎性疾病。在类风湿性关节炎患者中已经报道了高水平的IL-17(Ziolkowska M.等人，J Immunol.1642832-8(2000))。白介素17已经表明对鼠膝关节中的蛋白聚糖降解具有影响(Dudler J.等人，Ann Rheum Dis.59529-32(2000))，并且引起滑膜基质的破坏(Chabaud M.等人，Cytokine.721092-9(2000))。在多发性硬化患者的单核细胞中已经发现IL-17 mRNA水平升高(Matusevicius，D.等人，Mult.Scler.5101-104(1999))。在系统性红斑狼疮患者中观察到IL-17血清水平升高(Wong CK.等人，Lupus 9589-93(2000))。另外，在从病变的牛皮癣皮肤上分离的T细胞中IL-17 mRNA水平升高(Teunissen，M.B.等人，J.Invest.Dermatol.111645-649(1998))。IL-17参与肾移植排斥已经得到证明(Fossiez F.等人，Int.Rev.Immunol.16541-51(1998))。上述发现提示IL-17在炎症反应的引发或保持中可能起关键作用(Jovanovic，D.V.等人，J.Immunol.1603513-3521(1998))。人和小鼠IL-17序列在WO02/056905的SEQ ID NO228(AAC50341)和SEQ ID NO229(AAA37490)中给出。表达IL-17的方法在WO02/056905的第69页已经描述，在此引用作为参考。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是白介素-13(IL-13)，或其片段或变体。前体人IL-13的氨基酸序列在WO02/056905的SEQ ID No230中显示，加工后的人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID No231中显示。前体蛋白的前20个氨基酸对应于信号肽，在加工后的蛋白质中不存在。
IL-13是T辅助细胞2衍生的细胞因子(类似于IL-4、IL-5)，最近表明它与变应性气管反应(哮喘)有关。在许多肿瘤类型(例如何杰金淋巴瘤)中已经发现IL-13和IL-13受体的上调。白介素13由何杰金和Reed-Sternberg细胞分泌并刺激该细胞的生长(Kapp U等人，J Exp Med.1891939-46(1999))。因此针对IL-13免疫提供了一种治疗上述疾病如哮喘或何杰金淋巴瘤的方法。表达IL-13的方法在WO02/056905第70页已经描述，IL-13构建体在WO02/056905的实施例9中已经公开，在此引用作为参考。
在本发明的另外一个实施方案中，所述至少一种抗原是白介素-5(IL-5)，或其片段或变体。IL-5是嗜酸细胞生成(eosinophilopoiesis)的谱系特异性的细胞因子，在与嗜酸粒细胞数量增多有关的疾病如哮喘中起重要作用。前体和加工后的人IL-5的序列分别在WO02/056905的SEQ ID No233和SEQ ID No234中提供，加工后的鼠氨基酸序列在WO02/056905的SEQ ID No235中显示。
在几项研究中已经表明了IL-5的生物学功能(Coffman R.L.等人，Science 245308-10(1989)；Kopf等人，Immunity 415-24(1996))，这些研究针对在通过嗜酸粒细胞介导的疾病中抑制IL-5功能的有益作用。IL-5作用的抑制提供了一种治疗哮喘和其他与嗜酸粒细胞有关的疾病的方法。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是CCL-21，或其片段或变体。在一个相关的优选的实施方案中，所述抗原是CXCL 12，也被称为SDF-1。已经表明，趋化因子受体CCR7和CXCR4在乳腺癌细胞中上调，其各自的配体CCL21和CXCL 12在作为乳腺癌转移第一目标的器官中高度表达(Müller等人.Nature 41050-6(2001))。因此，针对CCL21和CCL12免疫分别提供了治疗癌症，更特别是乳腺癌的转移扩散的方法。另外，CCL12/CXCR4趋化因子-受体对已经显示提高更初级的造血组细胞向骨髓归巢(homing)的效力。另外，提出CXCR4和SDF-1影响慢性淋巴细胞性白血病的分布。因此，针对CXCL 12免疫提供了一种治疗慢性淋巴细胞性白血病的方法。而且，据报道CCL12-CXCR4相互作用在类风湿性关节炎滑膜中的CD4+T细胞积累中起中心作用(Nanki等人，2000)。针对SDF-1免疫因此提供了一种治疗类风湿性关节炎的方法。
人和小鼠CCL21序列分别在WO02/056905的SEQ ID No236(SwissprotSY21_human)和SEQ ID NO237(SwissprotSY21_mouse)中显示。人和小鼠CCL 12序列分别在WO02/056905的SEQ ID NO238(SwissprotSDF1_human)和SEQ ID NO239(SwissprotSDF1_mouse)中显示。
在本发明的另一个实施方案中，所述至少一种抗原是B-淋巴细胞化学引诱物(BLC，CXCL 13)，或其片段或变体。人和小鼠BLC序列分别在WO02/056905的SEQ ID NO240(登记号NP_006410)和SEQ IDNO241(登记号NP_061354)中显示。人和小鼠的信号肽分别是前22或21个氨基酸。本发明的含有BLC的组合物优选地含有成熟形式的蛋白质。
BLC的其他生理学功能和制备组合物的方法在WO02/056905的第74和75页已经公开，在此引用作为参考。针对BLC的免疫可以提供一种治疗涉及淋巴新生的自身免疫病如类风湿性滑膜炎和类风湿性关节炎或I型糖尿病的方法。
在另一个特定实施方案中，本发明的至少一种抗原是嗜酸细胞活化趋化因子，或其片段或变体。尽管IL-5似乎负责嗜酸粒细胞从骨髓到血液的迁移，但是嗜酸细胞活化趋化因子负责在组织中的局部迁移(Humbles等人，J.Exp.Med.186601-12(1997))。人嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列在WO02/056905的SEQ ID NO242中显示(aa1-23对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列在SEQ ID NO243中显示(aa 1-26对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-3的序列在SEQ ID NO.244中显示(aa 1-23对应于信号肽)，小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列在SEQ ID No.245中显示(aa 1-23对应于信号肽)，小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列在SEQ ID No.246中显示(aa 1-2对应于信号肽)，因此该申请在此引用作为参考。嗜酸细胞活化趋化因子的其他生理学、生化信息及其根据本发明的表达和构建在WO02/056905的第75和76页公开，在此引用作为参考。
在本发明的另一个特定实施方案中，所述至少一种抗原是巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)，或其片段或变体。M-CSF和其受体表达升高与几种上皮癌症如乳腺癌、子宫癌和卵巢癌的较差预后有关。关于可溶性形式的M-CSF的结构数据可以获得(晶体结构Pandit等人，Science 2551358-62(1992))。人序列在WO02/056905的SEQID NO247(登记号NP_000748)中显示。本发明进一步优选的抗原包括由SEQ ID NO247的残基33-181或33-185组成的N-末端片段，其对应于受体的可溶性形式。小鼠序列(登记号NP_031804)在WO02/056905的SEQ ID NO248中显示。M-CSF的其他生物学信息以及其表达和根据本发明的组合物的构建在WO02/056905的第77和78页公开，在此引用作为参考。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是TNF-超家族成员，或其片段或变体。如此处所用的术语“TNF-超家族成员”是指包含TNF样域的蛋白质。如此处所用的术语“TNF-超家族成员”包括在人、猫、狗、小鼠、大鼠、一般的真哺乳亚纲动物、一般的哺乳动物以及其它的动物中已知的所有形式的TNF-超家族成员。TNF-超家族成员包含约150个残基的球状TNF-样胞外域，该域在保守域数据库CDD中被分类为cd00184、pfam00229或smart00207(Marchler-Bauer A等人(2003)，″CDDa curated Entrez databaseof conserved domain alignments″，Nucleic Acids Res.31383-387)。如此处所用的TNF-超家族成员包括TNFα、LTα、LTα/β、FasL、CD40L、TRAIL、RANKL、CD30L、4-1BBL、OX40L、GITRL和BAFF、CD27L、TWEAK、APRIL、TL1A、EDA和在其中可以识别出TNF-样域的任何其他的多肽。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的至少一种抗原是TNF-肽。如此处所用的“TNF-肽”是指一种肽，它包含与保守域pfam00229(SEQ ID NO45)的共有序列的氨基酸残基3到8同源的，即在本文中，相对应的氨基酸序列，优选与保守域pfam 00229(SEQ ID NO45)的共有序列的氨基酸残基1到8同源的肽序列，更优选与所述共有序列的氨基酸残基1到13同源的肽序列。当TNF-肽是来自人或小鼠TNFα的肽时，所述TNF-肽由长度为6到18个氨基酸残基，优选6到16个氨基酸残基，更优选6到14个氨基酸残基的肽组成。同源性肽是这样一种肽，它来源于一种动物，包括人类的TNF-超家族成员，特别是哺乳动物TNF-超家族成员，例如小鼠或人RANKL或小鼠或人TNFα，表现对应于SEQ ID NO45的氨基酸残基。这些同源性肽对于技术人员来说通过比对TNF超家族的共有序列(SEQ ID NO45)和另一种动物的所述TNF-超家族成员是可以确认的。如上所述，TNF-肽包括对应于共有序列的上述氨基酸残基的肽序列。也就是，在具有共有序列的特定同源区之外(例如共有序列的氨基酸残基3-8)，TNF-肽可能不同于是TNF超家族成员的多肽。但是优选地，位于上述具有共有序列的同源区之外的TNF-肽的部分与是TNF超家族成员，优选哺乳动物TNF-超家族成员，更优选人TNF-超家族成员的多肽至少70％相同，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或甚至100％相同。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的至少一种抗原是具有序列SSRTPSDKPVAHVVANPQAE(SEQ ID NO88)的人TNFα肽(4-23)。在本发明的另一个进一步优选的实施方案中，该抗原是具有序列SSQNSSDKPVAHVVANHQVE(SEQ ID NO89)的小鼠TNFα肽(4-23)。在另一个优选的实施方案，该抗原是成熟鼠TNF-α的氨基酸残基22-32VEEQLEWLSQR(SEQ ID NO90)。在另一个优选的实施方案中，该抗原是人TNF-α的氨基酸残基22-32AEGQLQWLNRR(SEQ ID NO91)。
在一个优选实施方案中，含有TNFα肽(4-23)的本发明的组合物用于生产治疗自身免疫病或骨相关疾病的药物，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化、糖尿病、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性肝炎、牛皮癣和牛皮癣性关节炎，其中所述骨相关疾病选自骨质疏松症、牙周变性(periondontis)、假体周围骨溶解、骨转移、骨癌痛、佩吉特病、多发性骨髓瘤、舍格伦综合征和原发性胆汁性肝硬变。
在本发明的一个优选实施方案中，所述自身抗原可以是如WO02/056905的第55和56页公开的VEGF或VEGFR，或其片段或变体；WO02/056905的第79和80页公开的淋巴毒素β；WO02/056905第93页的淋巴毒素β和淋巴毒素α和淋巴毒素β受体。这些信息在此引用作为参考。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是CXCR4或其片段或变体。趋化因子受体CXCR4，也被称为LESTR或融合素，属于七跨膜域G-蛋白偶联受体家族(Federsppiel等人(1993)，Genomics16707)。CXCR4的唯一已知的配体是SDF-1(Pelchen-Mattews，等人(1999)Immunol.Rev.16833)。CXCR4和SDF-1被认为参与人生理学的许多领域，如血细胞生成、T细胞活化和向炎症部位的迁移和细胞归巢、血管化、脑发育和胚胎发生(Murdoch，(2000)Immunol.Rev.177175)。
CXCR4后来被确定为HIV的共同受体(Feng等人(1996)Science272872)。因此，其进入需要CXCR4的HIV株被分类为X4株。SDF-1已经显示阻止HIV-1的进入(Oberlin等人(1996)，Nature 382833；Bleul，等人(1996)Nature 382829)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CXCR4胞外域的片段组成。CXCR4胞外域的片段具有至少6、7个，优选至少8、9、10个氨基酸，CCR5胞外域的片段具有少于30个，优选20个，更优选15个，甚至更优选12个氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CXCR4的N-末端胞外域组成。在一个进一步优选的实施方案中，CXCR4的N-末端胞外域包含或者由SEQ ID NO66组成。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CXCR4胞外域ECL2的片段组成。优选地，所述片段具有至少6个，优选7个氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由具有如SEQ ID NO65所示氨基酸序列的CXCR4胞外域ECL2的片段组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是CCR5或其片段或变体。HIV R5株使用细胞表面分子CD4和CCR5附着并进入巨噬细胞和CD4+T细胞。CCR5是一种七跨膜受体，具有4个胞外域N末端序列和三个暴露于胞外间隙的环，它们后来分别被称为PNt、ECL-1、ECL-2和ECL-3。天然CCR5配体RANTES、M1P-1α、MIP-1β及其类似物能够阻断病毒-共同受体的相互作用，并进一步引起CCR5的内化(Lederman等人，2004，Science 306，p485)。CCR5特异性自身抗体已经在12.5％的重复暴露于HIV但是仍未感染的女性中发现(Lopalco等人，2000，J.Immunology 164，3426)。这些抗体表现为结合CCR5的第一胞外环(ECL-1)，并且能够抑制外周血单核细胞(PBMC)的R5-向性HIV感染。女性中的同种异体免疫导致能够在体外抑制R5-HIV感染的CCR5特异性抗体(Wang等人，2002，Clin.Exp.Immunol.129，493)。
单克隆α-CCR5抗体能够防止HIV感染(Olson等人，1999，J.Virol.73，4145；Wu和LaRosa等人，1997，J.Exp.Med.186，1373)。与对应于小胞外环ECL-2A(Arg168-Thr177)的环肽结合的抗体抑制HIV-1 R5的感染(Misumi等人，2001，J.Virol.75，11614)。用线性CCR5肽(来自N-末端，ECL-1或ECL-2序列)免疫猴子产生的抗体在外体具有病毒抑制作用(Lehner等人，2001，J.Immunology 166，7446)。CCR5的N-末端域也展示在乳头瘤病毒样颗粒上，并免疫猴子。在所有5只检测的猴子中，病毒载量较低，较快速地下降，最终成为不可检测的(Chackerian等人，2004，J.Virol.78，4037)，尽管在6只对照恒河猴中有一半其血浆结合的病毒也下降到不可检测的水平。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CCR5胞外域的片段组成。CCR5胞外域的片段具有至少6或7个，优选至少8、9或10个氨基酸，CCR5胞外域的片段具有不到35个，优选不到30个，优选不到20个，更优选不到15个，甚至更优选不到12个氨基酸。
在一个优选实施方案中，CCR5胞外域的片段包含或者由ECL2A组成。如本领域中公知的，ECL2A优选地开始于ECL2的第一个氨基酸，优选地终止于在ECL2中恰好位于半胱氨酸之前的苏氨酸。在一个进一步优选的实施方案中，ECL2A包含或者由SEQ ID NO62组成。在一个优选实施方案中，ECL2A被环化。在一个进一步优选的实施方案中，环化的ECL2A包含或者由SEQ ID NO62组成。在一个进一步优选的实施方案中，ECL2A是如SEQ ID NO61所示的环肽，其中该肽通过两个末端处的C和G残基环化。
在一个优选实施方案中，本发明的抗原包含或者由CCR5胞外域PNt组成。在一个进一步优选的实施方案中，PNt域包含或者优选由SEQ ID NO63组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是胃泌素和/或前胃泌素。胃泌素(G17)是一组经典的肠肽激素，它们在结肠和胰脏中含量非常低(Koh，Regulatory Peptides.93，37-44(2000))。胃泌素是从它的前体前胃泌素(G34)加工而来的。胃泌素和前胃泌素都以C末端甘氨酸延伸的形式和C末端苯丙氨酸酰胺化的形式存在。
众所周知胃泌素具有刺激胃酸分泌的能力(Pharmacol Ther.98，109-127(2003))。相关的激素胆囊收缩素(CCK)，其具有如胃泌素的C-末端四肽酰胺，在十二指肠中合成，并负责胰酶分泌。酰胺化的G17与CCK-2受体结合，CCK与CCK-1受体和CCK-2受体都结合(Steel.IDrugs.5，689-695(2002))。甘氨酸延长的胃泌素的受体仍然不清楚。最近的数据提示胃泌素可能促进胃肠道癌症的发展(Watson.Aliment Pharmacol Ther.14，1231-1247(2000))。相反，非酰胺化的胃泌素刺激结肠粘膜生长，加速结肠癌形成的早期步骤，并且在结肠癌患者的肿瘤和循环中升高(Watson.Aliment Pharmacol Ther.14，1231-1247(2000))。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或优选地由G17(SEQ ID NO50)组成。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由在C末端添加了甘氨酸的G17(SEQ ID NO51)组成。在一个可替代的进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或优选地由最后一个氨基酸F被酰胺化的G17组成。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由前胃泌素G34(SEQ ID NO52)组成。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由在C末端增加有另一个甘氨酸的前胃泌素G34(SEQ ID NO53)组成。在一个可替代的进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由最后一个氨基酸F被酰胺化的前胃泌素G34组成。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由G17 1-9片段(SEQ ID NO49)组成，优选地具有与其C末端融合的连接序列，更优选地具有与C末端融合的连接序列SSPPPPC。
在一个非常优选的实施方案中，与连接体融合的至少一种抗原包含或者由如SEQ ID NO54所示的氨基酸序列组成。
应当指出，作为胃泌素序列一部分的EGPWLEEEE的位点1处的E可以是E、pyro E或Q。当另外的氨基酸融合到EGPWLEEEE的N端时，序列EGPWLEEEE的位点1处的E可以是E，或者优选Q。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是C5a或其片段或变体。C5a是一种74个氨基酸的四螺旋束糖蛋白(Fernandez和Hugli，J.Biol.Chem.253，6955-6964，1978)，负责产生针对细胞系统，特别是嗜中性粒细胞、内皮细胞和巨噬细胞的大量多样化的效应，以诱导局部炎症来对抗传染性微生物(Ward P，Nat.Rev.Immunol.4133，2004)。但是，通过相同的方式，脓毒症中C5a的过量产生导致嗜中性粒细胞的严重的功能缺陷(Czermak等人，Nat.Med.5788，1999；Huber-Lang等人，J.Immunol.1661193，2001)。提高的C5a的活化也与许多原发和/或慢性炎性疾病有关，如类风湿性关节炎(Jose P.Ann Rheum.Dis.49747，1990)、牛皮癣(Takematsu H，Arch.Dermatol.12974，1993)、成人型呼吸窘迫综合征(Langlois P，Heart Lung 1871，1989)、再灌注损伤(Homeister，J.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.3417，1994)、狼疮肾炎和大疱性类天疱疮。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或由C5a组成。在一个进一步优选的实施方案中，C5a蛋白具有SEQ ID NO57的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或由C5a组成。在一个进一步优选的实施方案中，C5a片段具有SEQ ID NO59的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是CETP或其片段或变体。胆固醇酯转移蛋白(CETP)是一种血浆糖蛋白，其介导胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)在高密度脂蛋白(HDL)颗粒和富含apoB的颗粒如极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒或低密度脂蛋白(LDL)颗粒之间的交换。CETP也转移磷酯(PL)。人CETP cDNA编码476个氨基酸的分子量为53000的蛋白质，其通过糖基化产生Mr 74000的糖蛋白。
HDL被认为是抗动脉粥样硬化的，因为在HDL-胆固醇水平和冠心病(CHD)之间已经观察到负相关(Barter P.J.和Rye K.-A.(1996)Atherosclerosis 1211-12)。相反，LDL和VLDL是致动脉粥样化的脂蛋白。人的CETP缺陷与HDL-c水平升高和LDL-c水平降低有关，它们一般都是抗动脉粥样硬化的。受代谢性综合征影响的患者具有低HDL-c，富含的一部分小密度LDL颗粒，轻度至中度高甘油三酯血症、轻度高血压、躯干性肥胖和胰岛素抵抗，特别是CHD的危险。非胰岛素依赖性糖尿病或家族性复合高脂血症患者也具有低HDL-c，并且具有CHD的危险(Barter P.J.和Rye K.-A.(1996)Atherosclerosis 1211-12)。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由具有SEQID NO69的氨基酸序列的CETP片段组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由缓激肽、其片段或变体组成。缓激肽(BK，KRPPGFSPFR，SEQ ID NO80)是一种重要的血管扩张肽，在血压、血流和血管通透性的局部调节中起重要作用(Margolius H.S，等人，Hypertension，1995)。另外还描述了缓激肽的几种另外的生物活性，包括平滑肌收缩和舒张、伤害感受和痛觉过敏的诱导、和炎症反应的介导。缓激肽通过B2受体发挥其作用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由des-Arg9-缓激肽、其片段或变体组成。des-Arg9-BK(KRPPGFSPF，SEQID NO81)与缓激肽既有重叠的也有不同的功能。证据表明des-Arg9-BK在组织损伤后快速产生，并且调节在炎症过程期间观察到的大多数事件，包括血管扩张、血管通透性增加、血浆外渗、细胞迁移、疼痛和痛觉过敏(Calixto J.B.等人，Pain 2000)。Des-Arg9-BK通过B1受体发挥其作用。
已经报道BK和Des-Arg9-BK在几种炎性疾病中起作用。例如，在抗原诱导的慢性或类风湿性关节炎(RA)的过程中观察到滑液成纤维细胞中B2和B1-受体的上调和血清激肽产生的增加(Cruwys S.C.等人，Br J Pharmacol，1994；Cassim B.等人，Immunopharmacology1997)。实验证据提示BK和des-Arg9-BK在哮喘的发展过程中起作用。在哮喘患者的BALF中发现BK和des-Arg9-BK水平升高(ChristiansenS.C.等人，Am.Rev.Dis.1992)。BK和Des-Arg9-BK在原发性和慢性炎性疾病，特别是在变应原或颗粒抗原如病毒诱导的关节炎和气管炎症中起作用。
本发明进一步包括含有此处所述抗原的模拟位的组合物。关于在本发明的疫苗组合物中使用模拟位的其他信息在WO02/056905第83-85页已经公开，在此引用作为参考。
至少一种抗原可以通过从天然来源中纯化，或优选地通过重组表达，甚至更优选地在细菌表达系统中，最优选地在大肠杆菌系统中表达而制备。为了纯化目的，本发明的抗原通常表达为具有诸如组氨酸标签、Flag标签、myc标签的标签或抗体恒定区(Fc区)的融合蛋白。典型但不是必须的，在抗原和标签之间有一个肠激酶切割位点，使该标签可以被切割。在另一个优选的实施方案，不超过50个氨基酸的至少一种抗原通过化学方法合成。
应当注意，现有技术如WO02/056905、WO03/031446、WO03/039225、WO03/040164、WO04/009116、WO04/009124、WO04/016282、US60/569322、WO 03/031466、WO 2004/007538以及其他引入本发明的参考文献中公开的VLP-抗原偶联物在通过表达而获得和产生的VLP内仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，根据本发明，本发明的VLP-抗原偶联物含有的宿主RNA，优选宿主核酸的量减少或基本去除。
在本发明的一个实施方案中，本发明的VLP和本发明的至少一种抗原通过至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点融合，即通过至少一个肽键融合。这种融合例如可以通过将本发明的至少一种抗原与病毒外壳蛋白，即病毒样颗粒的结构单元(building block)融合来实现，典型地通过基因工程融合。
编码本发明的抗原(优选不到100个氨基酸，更优选不到80个氨基酸，更优选不到60个氨基酸，更优选不到40个，最优选不到20个氨基酸的抗原)的基因，在内部或优选地在N末端或C末端与编码VLP外壳蛋白的基因符合读框地连接。也可以通过向VLP亚单位的变体内插入抗原的序列来实现融合，其中亚单位序列的一部分缺失，被称为截短突变体。截短突变体可能有VLP外壳蛋白的部分序列的N端或C端缺失或内部缺失。优选地，融合蛋白保留装配为VLP的能力，这可以通过电镜检查。
可加入侧翼氨基酸残基来增加外壳蛋白和外源表位之间的距离。甘氨酸和丝氨酸残基是用于侧翼序列的特别有利的氨基酸。这种侧翼序列赋予额外的柔性，可减少外源序列融合进入VLP外壳蛋白序列时可能的去稳定效应，并且可减少外源表位的存在对装配的干扰。
在一个优选的实施方案中，修饰的VLP是嵌合VLP，其中优选地，所述嵌合VLP包含或由至少一个融合蛋白和至少一个病毒外壳蛋白组成。
在优选的实施方案中，本发明的至少一种抗原，优选由不到50个氨基酸组成的抗原，能够与许多病毒外壳蛋白，例如QβA1蛋白截短形式的C-末端融合(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))，或插入CP延伸区的第72和73位之间。例如Kozlovska等人(Intervirology，399-15(1996))描述了其中的表位融合到在第19位截短的QβCP延伸区的C-末端的QβA1蛋白融合体。作为另一个例子，抗原可以插入fr CP的第2和3位氨基酸之间，形成抗原-fr CP融合蛋白(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。而且，抗原能够与RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N末端突出β-发夹融合(WO92/13081)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原与AP205噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的N-或C-末端融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原与AP205噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的N-或C-末端通过间隔区融合。通常，柔性的间隔区是有利的。第一多肽和第二多肽之间间隔区的构建可以通过重组DNA技术来实现。在本发明的一个特定实施方案中，间隔区的氨基酸序列选自(a)GSGG(SEQ ID NO92)；(b)GSG(SEQ ID NO93)；(c)GTAGGGSG(SEQ ID NO94)；和(d)GSGTAGGGSGS(SEQ ID NO95)。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述组合物包含或者基本由具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒组成，该病毒样颗粒与具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原通过至少一个共价键连接，优选地该共价键是非肽键。典型的固有的高度重复和组织的RNA噬菌体VLP结构有利地助于在优选高度有序且重复的阵列中展示本发明的抗原的能力，进一步通过如本发明公开的定向和确定的连接来确保这种展示。
在本发明的一个优选实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在本发明的另一个优选的实施方案中，第二附着位点包含，或优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。在本发明另一个优选的实施方案中，第二附着位点包含或优选是与至少一种抗原连接，优选共价连接的马来酰亚胺基团。
US 5,698,424描述了一种能够形成衣壳的修饰的噬菌体MS-2外壳蛋白，其中通过向N端发夹区中插入一个半胱氨酸残基，以及通过将位于N端发夹区外部的每一个半胱氨酸残基置换为非半胱氨酸氨基酸残基，来修饰外壳蛋白。插入的半胱氨酸然后可以直接连接到欲呈递的期望的分子种类如表位或抗原性蛋白质上。
然而我们注意到，衣壳中存在暴露的游离半胱氨酸残基可通过形成二硫键导致衣壳寡聚化。而且，衣壳和抗原性蛋白质之间通过二硫键的连接是不稳定的，特别是对于含有巯基部分的分子不稳定，而且，在血清中例如比硫醚连接的稳定性差(Martin FJ.和Papahadjopoulos D.(1982)Irreversible Coupling ofImmunoglobulin fragments to Preformed Vesicles.J.Biol.Chem.257286-288)。
因此，在一个进一步非常优选的实施方案中，VLP与至少一种抗原的连接不包括二硫键。进一步优选的，所述至少一个第二附着位点包含，或优选地是巯基。而且，在本发明一个非常优选的实施方案中，VLP与至少一种抗原的连接不包括硫-硫键。在一个进一步非常优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或者不包含半胱氨酸的巯基。在一个进一步非常优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或不包含巯基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，更优选赖氨酸的氨基，并且第二附着位点包含，或者优选地是巯基，更优选半胱氨酸的巯基。
在本发明的一个优选实施方案中，通过化学交联，一般且优选地通过使用异双功能交联剂，将至少一种抗原与VLP连接。在优选的实施方案中，异双功能交联剂含有能够与优选的第一附着位点(即含有氨基，优选VLP的赖氨酸残基的氨基)反应的一个官能团，和能够与优选的第二附着位点(即巯基，优选本发明的抗原固有的或人工添加的半胱氨酸残基的巯基，任选地也可通过还原用于反应)反应的另一个官能团。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可从Pierce ChemicalCompany获得的其它交联剂。上述交联剂均导致在与氨基反应后形成酰胺键和与巯基反应后形成硫醚键。适用于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶联时在抗原与VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含连接体。因此，在某些实施方案中，根据本发明的公开内容，通过连接包含适合作为第二附着位点的氨基酸或者由其组成的连接体，实现向抗原上构建第二附着位点。因此，在本发明的一个优选实施方案中，连接体通过至少一个共价键，优选地通过至少一个，典型一个肽键与抗原连接。优选地，连接体包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，连接体包含半胱氨酸残基的巯基。在另一个优选的实施方案中，连接体是半胱氨酸残基。
连接体的选择取决于抗原的性质，取决于其生化性质，如pI、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸连接体通常是有利的。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，连接体由氨基酸组成，其中进一步优选地，连接体由最多25个，优选最多20个，更优选最多15个氨基酸组成。在本发明的另一个优选的实施方案中，氨基酸连接体含有不超过10个氨基酸。连接体的优选实施方案选自(a)CGG(SEQ ID NO96)；(b)N-端γ-1连接体(例如CGDKTHTSPP，SEQ ID NO97)；(c)N-端γ-3连接体(例如CGGPKPSTPPGSSGGAP，SEQ ID NO48)；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸连接体(例如GCGGGG，SEQ ID NO98)；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸连接体((GGGGS)n，n＝1-3，具有另外一个半胱氨酸(例如SEQ ID NO99，它相当于其中n＝1的实施方案)；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(例如SEQ ID NO100，它相当于其中n＝1，k＝1，l＝1且m＝1的实施方案)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ-1连接体(例如DKTHTSPPCG，SEQ ID NO101)；(m)C-端γ-3连接体(例如PKPSTPPGSSGGAPGGCG，SEQ ID NO102)；(n)C-端甘氨酸连接体(GGGGCG，SEQ ID NO103)；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸连接体((SGGGG)n，n＝1-3，具有另外一个半胱氨酸(例如SEQ ID NO104，它相当于其中n＝1的实施方案)；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8(SEQ ID NO37)(例如SEQ ID NO105，它相当于其中n＝1，k＝1，l＝1，o＝1且m＝1的实施方案)。在一个进一步优选的实施方案中，连接体融合到抗原的N末端。在本发明的另一个优选实施方案中，接连体融合到抗原的C末端。
本发明优选的连接体是甘氨酸连接体(G)n，其还含有半胱氨酸残基作为第二附着位点，如N-末端甘氨酸连接体(GCGGGG)和C-末端甘氨酸连接体(GGGGCG)。进一步优选的实施方案是C-末端甘氨酸-赖氨酸连接体(GGKKGC，SEQ ID NO106)和N-末端甘氨酸-赖氨酸连接体(CGKKGG，SEQ ID NO107)，位于肽的C-末端的GGCG、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)连接体或位于其N-末端的CGG。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的可能的空间位阻。
在本发明的一个可替代的实施方案中，连接体与本发明的抗原通过化学相互作用连接，优选地通过至少一个非肽键的共价键连接。
连接抗原与VLP的其他方法包括使用碳化二亚胺EDC和NHS交联抗原和VLP的方法。本发明的抗原也可以先通过，例如与SATA、SATP或亚胺硫醇反应而被硫醇化。在另外一些方法中，使用例如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce)的同型双功能交联剂或其他已知的具有对VLP氨基或羧基反应性的官能团的同型双功能交联剂将抗原与VLP连接。
在一个优选实施方案中，第一附着位点包含或优选地是巯基，更优选天然存在的或人工添加到外壳蛋白上的半胱氨酸的巯基，该外壳蛋白包含于VLP中或者基本组成VLP。第二附着位点是连接体如MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸)的马来酰亚胺基，它与抗原化学结合，优选地与抗原共价结合，更优选地与抗原的氨基共价结合，更优选地通过连接体的NHS-酯基与抗原的N-末端氨基酸的氨基共价结合。在一个优选实施方案中，抗原，优选不超过70个，更优选不超过50个，更优选不超过30个氨基酸的抗原，优选地化学合成，并且马来酰亚胺基优选地与N-末端氨基酸的氨基连接。第一附着位点和第二附着位点通过硫醚键连接。
在该组合物的一个优选实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，优选赖氨酸的氨基，并且所述第二附着位点包含或优选地是马来酰亚胺基。第一附着位点，即赖氨酸的氨基，可以天然存在或人工添加到外壳蛋白上。优选地，第二附着位点是上述段落中详述的连接体的基团。VLP的氨基用异双功能交联剂如N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸(SATA)或2-亚氨硫醇(Iminothiolane)衍生化为巯基，巯基对于连接体的马来酰亚胺基具有反应性。
含有至少一个马来酰亚胺基的优选的连接体是，例如SMPH、Sulfo-MBS。进一步优选的连接体是Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其他可以获得的交联剂，例如从Pierce Chemical Company获得，并且含有一个氨基反应性官能团和一个巯基反应性官能团。
在本发明的其他实施方案中，本发明的VLP和至少一种抗原通过化学相互作用连接，其中这些化学相互作用中的至少一个不是共价键。VLP与抗原的连接可以通过生物素化VLP并将抗原表达为链霉抗生物素蛋白-融合蛋白而实现。或者，抗原和VLP都被生物素化，如WO 00/23955所述。其他结合对，如配体-受体、抗原-抗体，也可以按照与生物素-抗生物素蛋白相似的方式用作偶联试剂。
在一个方面，本发明提供一种含有本发明的组合物的疫苗组合物。优选地，该疫苗组合物还含有合适的缓冲液。疫苗组合物中与VLP连接的抗原可以来源于动物，优选哺乳动物或人。在优选的实施方案中，抗原来源于人、牛、狗、猫、小鼠、大鼠、猪或马。
在一个优选实施方案中，该疫苗组合物进一步包含至少一种佐剂。所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后进行。所述至少一种佐剂的例子包括铝盐、单磷酰脂质A(MPL)、不完全弗氏佐剂(IFA)。佐剂诱导局部抗原储库(depot)的形成。
在另一个优选实施方案中，本发明的疫苗组合物不含佐剂。本发明的一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时。而且，不含佐剂使得不希望的炎性T细胞应答的发生减至最少，这是针对自身抗原的接种中的一个安全性问题。因此，优选地向患者施用本发明的疫苗组合物而不需在施用该疫苗之前、同时或之后向同一名患者施用至少一种佐剂。
本发明进一步公开了一种免疫方法，包括向动物或人施用本发明的疫苗。动物优选的是哺乳动物，如猫、绵羊、猪、马、牛、狗、大鼠、小鼠，特别是人。疫苗可以用本领域所知的各种方法向动物或人施用，但是通常通过注射、输注、吸入、口服或其他适当的物理方法来施用。或者，偶联物可以肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内或皮下施用。用于施用的偶联物的成分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。
如果接受个体能够耐受本发明的疫苗的施用，则认为该疫苗是“药学可接受的”。进而，本发明的疫苗将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效果的量)施用。免疫应答的性质或类型不是本申请公开内容的限制因素。并非意在通过以下机制的解释来限制本发明，本发明的疫苗可以诱导结合本发明的抗原，因而减少其浓度和/或干扰其生理学或病理学功能的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物和可接受的药物载体。当向个体施用本发明的疫苗时，它可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他改善偶联物的效果所需的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多来源中提供，包括REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，ed，Mack PublishingCo，(1990))。
本发明提供一种使用本发明的组合物治疗和/或减弱疾病或状况的方法，其中本发明的至少一种抗原在动物或人中发挥重要的病理学功能。
在另一个方面，本发明提供本发明的组合物在制备用于治疗动物或人的疾病的药物中的用途，其中本发明的至少一种抗原发挥重要的病理学功能。
实施例为了简便起见，术语“现有技术VLP”和“本发明的VLP”以及更具体的术语“现有技术QβVLP”、“本发明的QβVLP”、“现有技术AP205VLP”和“本发明的AP205VLP”等，特别在该实施例部分和


部分中使用。如在该实施例部分使用的术语“现有技术VLP”以及更具体的术语“现有技术QβVLP”、“现有技术AP205VLP”等，是指如WO 02/056905、WO 04/007538或特别地如本申请的实施例1所述，通过从大肠杆菌中重组表达随后纯化而获得的VLP。如在该实施例部分使用的术语“本发明的VLP”以及更具体的术语“本发明的QβVLP”、“本发明的AP205VLP”等，是指本发明的VLP，特别是通过本发明的方法获得的VLP。而且，为了进一步简便起见，术语“重装配的VLP”以及更具体的术语“重装配的QβVLP”、“重装配的AP205VLP”等在该实施例部分中用于典型且优选地指通过如权利要求35，37，39或41所述的本发明的方法获得的VLP。另外，术语“RNase处理的VLP”以及更具体的术语“RNase处理的QβVLP”、“RNase处理的AP205VLP”等在该实施例部分中用于典型且优选地指通过如权利要求43的本发明的方法获得的VLP。另外，术语“金属离子处理的VLP”以及更具体的术语“金属离子处理的QβVLP”、“金属离子处理的AP205VLP”等在该实施例部分中用于典型且优选地指通过如权利要求44所述的本发明的方法获得的VLP。
实施例1Qβ外壳蛋白的表达和产生的现有技术QβVLP的纯化用Qβ外壳蛋白表达质粒转化大肠杆菌JM109。在含20μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基中接种用Qβ外壳蛋白表达质粒转化的克隆。接种后的培养物不加振摇在37℃温育16-24小时。培养物随后用含有20μg1ml氨苄青霉素的100-300ml新鲜LB培养基1∶100稀释，并且不加振摇在37℃温育过夜。获得的二次接种物在瓶中用含有1％酪蛋白氨基酸和0.2％葡萄糖的M9培养基1∶50稀释，并在37℃振摇下温育过夜。通过离心沉淀细胞，并冻存。
纯化纯化程序使用的溶液和缓冲液1.裂解缓冲液LB50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和新鲜制备的5μg/ml的PMSF，不含溶菌酶和DNAse。
2.饱和硫酸铵水溶液(SAS)。
3.缓冲液NET20mM Tris-HCl，pH 7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEGNET中的40％(w/v)聚乙二醇6000破碎与裂解将冷冻的细胞以2ml/g的浓度重悬浮于LB中。混合物以22kH超声处理5次各15秒，间隔1分钟，在冰上冷却该溶液。然后用Janecki K 60转头以14 000rpm离心裂解物1小时。除非另外说明，以下描述的离心步骤全都用相同的转头进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用LB洗涤2次。离心后合并裂解物的上清液和洗涤级分。
分级分离在搅拌下，向上述合并的裂解物中逐滴加入饱和硫酸铵溶液。调节SAS的体积为总体积的1/5，获得20％的饱和度。溶液静置过夜，次日以14 000rpm离心20分钟。沉淀物用少量20％硫酸铵洗涤，再次离心。合并获得的上清液，逐滴加入SAS，获得40％的饱和度。溶液静置过夜，次日以14 000rpm离心20分钟。将获得的沉淀物溶解于NET缓冲液中。
层析将溶解于NET缓冲液中的衣壳或VLP蛋白上样到SepharoseCL-4B柱上。在层析过程中洗脱出3个峰。第一个峰主要含有膜和膜片段，不予收集。衣壳含于第二个峰中，而第三个峰含有其它大肠杆菌蛋白质。
合并峰级分，将NaCl浓度调节至终浓度为0.65M。在搅拌下逐滴加入体积相当于合并峰级分一半的PEG溶液。该溶液不加搅拌静置过夜。以14 000rpm离心20分钟沉淀衣壳蛋白。然后将其溶解于最小体积的NET中，再次上样到Sepharose CL-4B柱上。合并峰级分，用60％饱和(w/v)的硫酸铵沉淀。离心并溶解于NET缓冲液后，将衣壳蛋白上样到Sepharose CL-6B柱上再次进行层析。
透析和干燥合并以上获得的峰级分，用无菌水充分透析，冻干保存。
实施例2RNase A水解包裹在现有技术QβVLP中的RNA通过加入RNaseA(Qiagen AG，瑞士)至终浓度为300μg/ml，消化在0.2x HBS(4mM HEPES，30mM NaCl，pH 7.4)中浓度为1.0mg/ml的现有技术QβVLP。样品在650rpm的恒温混匀器中37℃温育3小时。然后样品在300,000分子量截止膜中用0.2HBS缓冲液透析过夜，其中更换一次缓冲液。来自同一批的足够的一部分现有技术QβVLP不用RNaseA处理，而是保存起来用于在后续的程序中测定RNA，优选核酸的量。
为了测定保留在VLP内的具有二级结构的RNA，优选核酸的量，将等量(基于重量)的RNaseA-处理的QβVLP和未用RNaseA处理的现有技术QβVLP加样到含有溴化乙锭(典型且优选地浓度为0.5μg/ml)的1％琼脂糖凝胶上，溴化乙锭会嵌入RNA，优选核酸的二级结构内。按照厂商(BIO-RAD)给出的标准方案，典型且优选地使用白蛋白(PIERCE)作为标准，通过Bradford试验在同一实验内测定未用RNaseA-处理的现有技术QβVLP和RNaseA处理的QβVLP的蛋白质浓度，实现等量的VLP加样。如此处所用的“等量”意思是加样到凝胶上的RNase-处理的VLP，优选RNaseA-处理的VLP，更优选RNaseA-处理的QβVLP的量与加样到凝胶上的现有技术VLP，优选现有技术QβVLP的量相差不超过5％，优选不超过3％，更优选不超过1％。典型且优选地在80V下电泳典型且优选地1小时后，凝胶暴露于紫外线，典型且优选地如Sambrook，J.等人，eds，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)所述，特别如第6.15和6.19章所述。RNA的量用嵌入到RNA内的溴化乙锭的荧光强度表示。未用RNaseA处理的现有技术QβVLP显示出强荧光强度，而RNaseA-处理的VLP的强度强烈降低。用光密度法(Kodak 1D ScientificImaging System)定量荧光强度表明RNaseA-处理的VLP所含的具有二级结构的RNA，优选核酸的量不到未用RNaseA处理的现有技术QβVLP所含的具有二级结构的RNA，优选核酸的量的10％(各个实验得到3-9％的值)(图1)。
假定通过实施例17所述的方法测定，现有技术QβVLP所含的宿主RNA的量为300μg/mg VLP，则RNaseA-处理的QβVLP内保留的具有二级结构的RNA，优选核酸的量不到30μg/mg VLP(或相当于各个实验的9-27μg/mg VLP)。
实施例3VLP的RNA内容物的非酶水解VLP核酸内容物的ZnSO4依赖的降解现有技术QβVLP(1.0mg/ml，在0.2x HBS缓冲液中)在2.5mMZnSO4存在下60℃温育24小时。得到的样品在300,000分子量截止值的膜中用0.2HBS缓冲液透析过夜，其中更换一次缓冲液。来自同一批的足够的一部分现有技术QβVLP不用ZnSO4处理，而是保留起来用于在随后的程序中测定具有二级结构的RNA，优选核酸的量。
为了测定保留在VLP内的具有二级结构的RNA，优选核酸的量，将等量(基于重量)的ZnSO4-处理的QβVLP和未用ZnSO4处理的现有技术QβVLP加样到含有溴化乙锭(典型且优选地浓度为0.5μg/ml)的1％琼脂糖凝胶上，溴化乙锭会嵌入RNA，优选核酸的二级结构内。按照厂商(BIO-RAD)给出的标准方案，典型且优选地使用白蛋白(PIERCE)作为标准，通过Bradford试验在同一实验内测定未处理的现有技术QβVLP和ZnSO4-处理的QβVLP的蛋白质浓度，实现等量的VLP加样。如此处所用的“等量”意思是加样到凝胶上的ZnSO4-处理的VLP，优选ZnSO4-处理的QβVLP的量与加样到凝胶上的现有技术VLP，优选现有技术QβVLP的量相差不超过5％，优选不超过3％，更优选不超过1％。典型且优选地在80V下电泳典型且优选地1小时后，凝胶暴露于紫外线，典型且优选地如Sambrook，J.等人，eds，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)所述，特别如第6.15和6.19章所述。RNA的量用嵌入到RNA内的溴化乙锭的荧光强度表示。未处理的现有技术QβVLP显示出强荧光强度，而ZnSO4-处理的VLP的强度强烈降低。用光密度法(Kodak 1DScientific Imaging System)定量荧光强度表明与ZnSO4-处理的VLP结合的具有二级结构的RNA，优选核酸的量为与未用ZnSO4处理的现有技术QβVLP结合的具有二级结构的RNA，优选核酸的量的9％。
假定通过实施例17所述的方法测定，现有技术QβVLP包含的宿主RNA的量为300μg/mg VLP，则ZnSO4-处理的QβVLP内保留的具有二级结构的RNA的量为27μg/mg VLP。
实施例4在不同聚阴离子大分子存在下通过解装配/重装配制备本发明的QβVLP产生重装配的QβVLP(A)现有技术QβVLP的解装配从大肠杆菌裂解物中纯化的溶于PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.5)中的45mg现有技术QβVLP(2.5mg/ml，通过Bradford分析确定)在搅拌条件下于室温用10mM DTT还原15分钟。然后加入氯化镁至0.7M的终浓度，继续在搅拌条件下于室温温育15分钟，导致包裹的宿主细胞RNA沉淀。溶液于4℃以4000rpm离心10分钟(Eppendorf 5810R，在下列所有步骤中使用固定角转头A-4-62)，以从溶液中除去沉淀的RNA。含有释放的二聚Qβ外壳蛋白的上清液用于层析纯化步骤。
(B)通过阳离子交换层析和大小排阻层析纯化Qβ外壳蛋白含有二聚体外壳蛋白、宿主细胞蛋白质和残留的宿主细胞RNA的解装配反应的上清液用水1∶15稀释，以调节电导率低于10mS/cm，并加样到SP-Sepharose FF柱(xk16/20，6ml，Amersham Bioscience)上。该柱预先用20mM磷酸钠缓冲液pH 7平衡。结合的外壳蛋白的洗脱用20mM磷酸钠/500mM氯化钠的分步梯度来完成，以大约25ml的级分体积收集蛋白质。以5ml/min的流速在室温下进行层析，在260nm和280nm处测量吸光度。
在第二步中，分离的Qβ外壳蛋白(从阳离子交换柱上洗脱的级分)加样到(进行两次)用20mM磷酸钠/250mM氯化钠；pH 6.5平衡的Sephacryl S-100HR柱(xk26/60，320ml，Amersham Bioscience)上。以2.5ml/min的流速在室温下进行层析，在260nm和280nm处测量吸光度。收集5ml的级分。
(C1)通过透析重装配QβVLP纯化的Qβ外壳蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5中)、一种聚阴离子大分子(2mg/ml水溶液)、尿素(7.2M水溶液)和DTT(0.5M水溶液)混合至终浓度为1.4mg/ml外壳蛋白，0.14mg/ml各自的聚阴离子大分子，1M尿素和2.5mM DTT。混合物(各1ml)使用3.5kDa截止值的膜在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH 8中5℃透析2天。聚阴离子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000，Fluka)、硫酸葡聚糖(MW 5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MW 11000和33400，Sigma)、聚-L-谷氨酸(MW 3000，13600和84600，Sigma)和来自面包酵母和小麦胚的tRNA。
(C2)通过渗滤重装配QβVLP33ml纯化的Qβ外壳蛋白(1.5mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5，250mM NaCl中)与水和尿素(7.2M水溶液)、NaCl(5M水溶液)和聚-L-谷氨酸(2mg/ml水溶液，MW84600)混合。混合物的体积为50ml，成分的终浓度为1mg/ml外壳蛋白，300mM NaCl，1.0M尿素和0.2mg/ml聚-L-谷氨酸。然后在使用Pellicon XL膜柱(Biomax 5K，Millipore)的正切流动过滤装置中，应用10ml/min的横流速和2.5ml/min的渗透流速，将混合物用500ml 20mM TrisHCl pH 8，50mMNaCl在室温渗滤。
重装配的Qβ-VLP的分析(D1)Qβ-VLP中二硫键的形成如实施例4(C1)和4(C2)所述在不同聚阴离子大分子存在下重装配的Qβ-VLP通过非还原SDS-PAGE分析，并与现有技术QβVLP比较。重装配的Qβ-VLP显示为二硫键连接的五聚体和六聚体形式的外壳蛋白的带；这类似于现有技术QβVLP，表明在重装配的QβVLP中外壳蛋白单元具有正确的结构排列(图2)。
(D2)通过分析型大小排阻层析，在不同聚阴离子大分子存在下重装配的Qβ-VLP的流体动力学大小如实施例4(C1)和4(C2)所述在不同聚阴离子大分子存在下重装配的Qβ-VLP样品通过分析型大小排阻层析来分析，并与现有技术QβVLP比较。重装配的QβVLP显示一个峰，该峰迁移的保留时间与代表现有技术QβVLP的峰相同，表明重装配的VLP的总体大小和结构与现有技术VLP相同。
实施例5AP205 VLP的体外装配(A)AP205外壳蛋白的纯化解装配20ml AP205 VLP溶液(1.6mg/ml，在PBS中，从大肠杆菌提取物中纯化)与0.2ml 0.5M DTT混合，室温温育30分钟。加入5ml 5M NaCl，混合物然后于60℃温育15分钟，导致DTT-还原的外壳蛋白沉淀。将浑浊的混合物离心(转头Sorvall SS34，10000g，10min，20℃)，弃去上清液，将沉淀物分散到20ml 1M尿素/20mM柠檬酸钠pH 3.2中。室温搅拌30分钟后，加入1.5M Na2HPO4将分散液调节至pH 6.5，然后离心(转头Sorvall SS34，10000g，10min，20℃)，获得含有二聚体外壳蛋白的上清液。
阳离子交换层析上清液(见上)用20ml水稀释，以调节电导率约为5mS/cm。将得到的溶液加至预先用20mM磷酸钠pH 6.5缓冲液平衡的6ml SP Sepharose FF柱(Amersham Bioscience)上。加样后，用48ml 20mM磷酸钠pH 6.5缓冲液洗柱，然后用20倍柱体积上达1M NaCl的线性梯度洗脱结合的外壳蛋白。合并主峰级分，通过SDS-PAGE和UV光谱法分析。根据SDS-PAGE，分离的外壳蛋白是从其他蛋白质污染物中基本纯化的。根据UV光谱法，蛋白质浓度为0.6mg/ml(总量12mg)，1个A280单位反映1.01mg/ml AP205外壳蛋白。此外，A280值(0.5999)与A260值(0.291)的比为2，表明该制品基本不含核酸。
(B)AP205 VLP的装配在不含任何聚阴离子大分子的条件下的装配将上述洗脱的蛋白质级分渗滤并且通过TFF浓缩，至蛋白质浓度为在20mM磷酸钠pH 6.5中1mg/ml。500μl该溶液与50μl 5M NaCl溶液混合，室温温育48小时。混合物中重装配的VLP的形成通过非还原SDS-PAGE和大小排阻HPLC显示(图5A)。HPLC分析使用用20mM磷酸钠，150mM NaClpH 7.2平衡的TSKgel G5000 PWXL柱(Tosoh Bioscience)。
在聚谷氨酸存在下的装配375μl纯化的AP205外壳蛋白(1mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5中)与50μl NaCl贮存溶液(5M水溶液)、50μl聚谷氨酸贮存溶液(2mg/ml水溶液，MW86400，Sigma)和25μl水混合。混合物在室温温育48小时。混合物中重装配的VLP的形成通过非还原SDS-PAGE和大小排阻HPLC显示(图5B)。混合物中的外壳蛋白几乎完全加入到VLP中，表明装配效率高于在不含任何聚阴离子大分子情况下装配的AP205外壳蛋白(图5A)。
实施例6在聚阴离子大分子存在下重装配的fr VLP或重装配的GA的制备如实施例1和4所公开的类似的实验条件应用于在大肠杆菌中重组产生现有技术fr或GA VLP，纯化和解装配这些VLP，和纯化获得的相应RNA噬菌体的外壳蛋白。类似的实验条件然后应用于将外壳蛋白重装配为重装配的fr VLP或重装配的GA VLP。
实施例7偶联尼古丁衍生物到现有技术QβVLP和本发明的QβVLP上适合与VLP偶联的尼古丁衍生物根据Langone等人(1982，见上)所述合成。反式-4′-羧基可替宁可从商业来源获得。通过反式-4′-羧基可替宁与甲醇硫酸反应生成反式-4′-羧基可替宁的甲酯。该溶液用碳酸氢钠中和，用氯仿抽提，在旋转蒸发器上浓缩，从醚-丙酮中重结晶。用醚中的氢化铝锂还原甲酯生成反式-3′-羟甲基尼古丁。然后加入苯中的琥珀酸酐生成O′-琥珀酰-羟甲基尼古丁。在旋转蒸发器上浓缩该溶液。然后加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)实现羧基的活化，生成O′-琥珀酰-羟甲基尼古丁的N-羟基琥珀酰亚胺酯(下面缩写为″Suc-Nic″)。
现有技术QβVLP和本发明的QβVLP，包括RNase A处理的QβVLP，如图3所示在不同聚阴离子大分子存在下重装配的QβVLP，用Hepes-缓冲的盐水HBS(50mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.0)透析。尼古丁衍生物Suc-Nic以121mM的浓度溶解于HBS中。将其以1x、5x、50x、100x和500x摩尔过量加入不同的QβVLP溶液(0.14mM)中，在振荡器上室温温育2小时。反应溶液然后用HBS，pH 8.0(截止值10000Da)透析，在液氮中急冻，贮存于-80℃。在形成酰胺键的条件下，尼古丁衍生物suc-nic与Qβ表面上的赖氨酸反应。生成的共价偶联物在此分别被称为“现有技术QβVLP-Nic”和“本发明的QβVLP-Nic”。
实施例8本发明的QβVLP-Nic诱导特异性抗体应答(A)小鼠的免疫7-8周大的雌性Balb/c小鼠分别接种60μg现有技术QβVLP-Nic和本发明的QβVLP-Nic疫苗两次，其中尼古丁衍生物是Suc-Nic。该疫苗在200μl无菌PBS中稀释，皮下注射到左和右腹股沟区。第一次免疫14天后对小鼠加强免疫。在第14天(加强前)和第21天(加强7天后)采集血清。通过ELISA测定血清中尼古丁-特异性抗体的效价。
(B)ELISA微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用PBS(pH 7.3-7.7)中的5μg/ml与BSA偶联的尼古丁(BSA-NicB01)包被过夜。洗涤(0.05％Tween20/PBS)并用PBS中的2％BSA封闭后，加入在2％BSA/1％FCS/PBS中不同稀释的血清。为了检测IgE，通过与蛋白G珠(Pharmacia)温育从血清中除去IgG。室温温育2小时后，洗板，加入HRP-标记的小鼠IgG特异性抗体(山羊抗-小鼠IgG(H+L)，Jackson ImmunoResearch)、IgG1(兔抗-小鼠IgG1，Zymed)、IgG2a(大鼠抗-小鼠IgG2a，Pharmingen)和IgE(山羊抗-小鼠IgE)。温育1小时后，洗板，按照使用说明加入溶于柠檬酸缓冲液中的显色底物OPD(Fluka)。5分钟后用5％H2SO4终止显色反应。用ELISA读板器(Benchmark，Biorad)读取450nm处的光密度。ELISA效价被定义为在ELISA中获得半数最大光密度信号(OD 50％)的血清稀释度的倒数。
所有本发明的QβVLP-Nic疫苗诱导的尼古丁特异性抗体的水平都与现有技术QβVLP-Nic疫苗诱导的抗体效价相当(图3)。在第14天和第21天为总IgG应答测定每组3只小鼠的合并血清的ELISA效价。如图3所示，在第21天，本发明的QβVLP-Nic疫苗的IgG效价类似于现有技术QβVLP-Nic疫苗的效价。
图4显示通过ELISA测定的第21天的亚类IgG1和IgG2a的抗-尼古丁效价。现有技术QβVLP-Nic诱导Th1型免疫应答，具有高IgG2a效价。IgG2a/IgG1效价之比约为0.5。RNAse-处理的QβVLP-Nic不影响IgG1效价，但是明显降低IgG2a效价，导致比值为0.006，总抗体效价与现有技术VLP相比下降。重装配的QβVLP-Nic疫苗诱导较高的IgG1效价，但是与现有技术QβVLP-Nic相比降低了IgG2a效价。这由低于0.035的IgG2a/IgG1效价比反映出来，表明更多Th2型应答。然而，尽管更多TH2应答，但是在用重装配的QβVLP-Nic接种的血清中未能检测出IgE。同样，在用现有技术QβVLP-Nic接种的血清中未能检测出IgE。
数据表明重装配的QβVLP-Nic保持高免疫原性，而同时免疫应答转移到更多Th2型应答，而不诱导IgE产生。
实施例9GnRH肽与重装配的QβVLP的偶联化学合成下列含有GnRH的氨基酸1-10(SEQ ID NO1)的肽类似物，它们延长了一个半胱氨酸作为偶联附着位点，或者两个甘氨酸残基加一个半胱氨酸残基作为附着位点CGG-GnRH CGGEHWSYGLRPG-NH2(SEQ ID NO2)GnRH-GGC pEHWSYGLRPGGGC (SEQ ID NO3)C-GnRH CEHWSYGLRPG-NH2 (SEQ ID NO4)GnRH-C pEHWSYGLRPGC (SEQ ID NO5)如下所述将肽与重装配的QβVLP偶联。
通过于25℃用20倍摩尔过量的SMPH(100mM，在DMSO中，Pierce)将50mM NaCl，20mM Hepes pH7.2中的重组产生的重装配的QβVLP(2mg/ml)衍生化0.5小时，可实现CGG-GnRH(SEQ ID NO2)的高偶联效率(＞90％的带有至少一个肽的单体)。然后使用10,000MWCO透析管用2OmM Hepes pH 7.2在4℃透析反应物2次各2小时，以除去未反应的SMPH。以7倍摩尔过量加入GnRH肽(5mM，在DMSO中)，在恒温混匀器中25℃反应2小时。反应物用20mM Hepes pH7.2透析过夜，以除去未偶联的肽。
通过于25℃用18倍摩尔过量的SMPH将20mM Hepes pH7.2中的重装配的QβVLP(1mg/ml)衍生化0.5小时，可实现肽CGG-GnRH(SEQID NO2)和GnRH-GGC(SEQ ID NO3)的中偶联效率(82％的带有至少一个肽的单体)。反应物随后用20mM Hepes pH7.2透析，通过在恒温混匀器上25℃温育2小时，与10倍摩尔过量的GnRH肽(10mM，在DMSO中)偶联。
通过于25℃用20倍摩尔过量的SMPH(50mM，在DMSO中)将20mMHepes pH7.2中的重装配的QβVLP(2.8mg/ml)衍生化0.5小时，进行肽C-GnRH(SEQ ID NO4)和GnRH-C(SEQ ID NO5)的偶联，然后用20mM Hepes pH 7.2透析过夜。然后通过在恒温混匀器上分别与7倍和2.5倍摩尔过量的肽(5mM，在DMSO中)25℃温育2小时，可获得高(＞90％)和低(60-71％)偶联效率。反应物用20mM Hepes pH7.2透析过夜以除去未偶联的肽。离心Qβ-GnRH偶联产物，上清液在还原条件下的SDS-PAGE凝胶上分析。根据用于偶联的相应的肽(SEQ ID NO2，3，4和5)，Qβ-GnRH偶联产物被命名为Qβ-CGG-GnRH、GnRH-GGC-Qβ、Qβ-C-GnRH和GnRH-C-Qβ。
实施例10偶联人IL-23 p19与本发明的VLP重装配的Qβ病毒样颗粒(2g/l)、AP205(2g/l)、fr(2g/l)和GA(2g/l)，RNase A处理的Qβ病毒样颗粒(2g/l)、AP205(2g/l)、fr(2g/l)和GA(2g/l)，ZnSO4处理的Qβ病毒样颗粒(2g/l)、AP205(2g/l)、fr(2g/l)和GA(2g/l)，用0.714mM SMPH(Pierce，PerbioScience)于25℃衍生化30分钟，然后用20mM Hepes pH8，150mM NaCl透析。人IL-23 p19蛋白(SEQ ID NO7，0.28g/l)和衍生化的Qβ颗粒(0.5g/l)在1mM EDTA和10μM、30μM或90μM TCEP(Pierce，Perbio Science)的存在下25℃温育2小时。偶联产物通过SDS-page分析。疫苗的抗原密度通过光密度分析来确定。
实施例11Aβ1-6肽与CP延伸位点19处截短的QβA1蛋白C末端的融合在以pQβ10作为模板的PCR反应中使用一条与QβA1基因5′末端退火的引物和一条与A1基因3′末端退火的引物，该引物还含有编码序列为DAEFRH或DAEFGH的Aβ1-6肽的序列元件。将PCR产物克隆到pQβ10(Kozlovska T.M.等人，Gene 137133-37(1993))中，在与实施例1所述类似的条件下表达和纯化含有融合蛋白的VLP。
将纯化的QβVLP-Aβ1-6如实施例4所述解装配。纯化的Qβ-Aβ1-6融合蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5中)、一种聚阴离子大分子(2mg/ml，水溶液)、尿素(7.2M，水溶液)和DTT(0.5M，水溶液)混合为终浓度为1.4mg/ml融合蛋白，0.14mg/ml各自的聚阴离子大分子，1M尿素和2.5mM DTT。使用3.5kDa截止值的膜，将混合物(各1ml)在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH 8中5℃透析2天。聚阴离子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000，Fluka)、聚-L-谷氨酸(MW 3000，13600和84600，Sigma)或来自面包酵母或小麦胚的tRNA。
实施例12在fr外壳蛋白的位点2和3之间插入Aβ1-6肽通过标准分子生物学技术，将编码序列为DAEFRH或DAEFGH的Aβ1-6肽序列并且含有Bsp119I匹配末端和允许框内插入的其他核苷酸的互补引物插入到pFrd8载体(Pushko，P.等人，Prot.Eng.6883-91(1993))的Bsp119I位点中。或者，pFrd8载体的突出端在用Bsp119I消化后用Klenow补平，编码Aβ1-6肽序列的核苷酸和用于框内克隆的其它核苷酸在Klenow处理后连接到pFrd8中。含有正确方向的插入的克隆通过测序进行分析。嵌合融合蛋白在大肠杆菌JM109或大肠杆菌K802中的表达和纯化如Pushko，P.等人，Prot.Eng.6883-91(1993)所述进行，区别是使用Sepharose CL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)柱进行层析步骤。类似于实施例1中关于Qβ所述的程序，细胞裂解物用硫酸铵沉淀，通过连续两个凝胶过滤纯化步骤纯化。
纯化的嵌合fr VLP-Aβ1-6如实施例4所述解装配。纯化的fr Aβ1-6融合蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5中)、一种聚阴离子大分子(2mg/ml，水溶液)、尿素(7.2M，水溶液)和DTT(0.5M，水溶液)混合至终浓度为1.4mg/ml融合蛋白，0.14mg/ml各自的聚阴离子大分子，1M尿素和2.5mM DTT。使用3.5kDa截止值的膜，将混合物(各1ml)在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH 8中5℃透析2天。聚阴离子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000，Fluka)、硫酸葡聚糖(MW 5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MW 11000和33400，Sigma)。
实施例13来源于血管紧张肽I和血管紧张肽II的肽与重装配的AP205VLP和GA VLP的偶联，以及用获得的偶联物对小鼠的免疫A.偶联物的产生化学合成下列血管紧张肽的肽部分CGGDRVYIHPF(“Angio 1”)，CGGDRVYIHPFHL(“Angio 2”)，DRVYIHPFHLGGC(“Angio 3”)，CDRVYIHPFHL(“Angio 4”)，CHPFHL(“Angio 5”)，CGPFHL(“Angio 6”)，CYIHPF(“Angio 7”)，CGIHPF(“Angio 8”)，CGGHPF(“Angio 9”)，DRVYIGGC(“Angio13”)，DRVYGGC(“Angio 14”)，DRVGGC(“Angio 15”)。它们如下所述用来与重装配的AP205或GA VLP化学偶联。
对于肽Angio 1-Angio 45ml重装配的2mg/ml AP205或GA VLP在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4中的溶液与507μl 13mg/mlSulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上25℃反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4透析两次各2小时。665μl透析后的反应混合液然后与2.8μl每种相应100mM肽贮存溶液(DMSO溶液)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4透析2次各2小时。
对于肽Angio 5-9和Angio 13-153ml重装配的2mg/ml AP205或GA VLP在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与86μl 100mM SMPH(琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚氨基丙酰氨基己酸酯，Pierce)的DMSO溶液在25℃摇床上反应50分钟。反应溶液随后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。514μl透析后的反应混合液然后与3.6μl每种相应100mM肽贮存溶液(DMSO溶液)在25℃摇床上反应4小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析2次各2小时。
B.免疫对雌性Balb/C小鼠接种与重装配的AP205或GA VLP偶联的9种血管紧张肽衍生物之一，其中不添加佐剂。每种样品的50μg(Angio1-4疫苗)或20μg(Angio 5-9疫苗)总蛋白用PBS稀释为200μl，于第0天和第14天皮下注射(100μl，腹部两侧)。小鼠在第21天眼眶后放血，用血管紧张肽特异的ELISA分析其血清。
应当注意到，人和鼠的血管紧张肽序列彼此相同地对应。因此，分别用包含本发明的血管紧张肽部分作为抗原决定簇的疫苗或偶联物免疫人或小鼠，是针对自身抗原的接种。
实施例14在聚谷氨酸的存在下重装配的QβVLP导致CD8+T细胞应答消除C57BL/6小鼠通过皮下注射150μg与LCMV-肽gp33(KAVYNFATM)化学偶联的QβVLP(Qβx33)而免疫。一组小鼠接受完整的QβVLPx33颗粒，而另一组用在不同量的聚-L-谷氨酸存在下重装配的QβVLPx33(Qβ/poly L-Glu/x33，使用0.1mg/ml，0.2mg/ml和0.4mg/ml聚-L-谷氨酸)处理。8天后分析被免疫动物的血液中gp33-特异性CD8+T细胞的扩增。将血液收集在FACS缓冲液(PBS，2％FCS，5mM EDTA，pH 8.2)中，用PE标记的具有gp33-肽的H2-Db-四聚体(Proimmune，Oxford，UK)于37℃染色10分钟，然后用APC标记的大鼠抗-小鼠CD8a-抗体(BD PharMingen，San Jose，USA)于4℃染色30分钟。洗涤后，红细胞用BD-裂解溶液(BD Biosciences，San Jose，USA)室温裂解10分钟。最后，使用软件CellQuest在FACS Calibur上分析细胞。首先，在前向散射和侧向散射中获得细胞，并且将淋巴细胞画门(gate)。从这个淋巴细胞群体中，分别用FL2和FL3检测器检测gp33-PE标记的和CD8-APC标记的细胞。gp33-特异性T细胞的量计算为总CD8阳性淋巴细胞中CD8阳性且gp33阳性细胞的百分数。
流式细胞分析显示，与接受现有技术QβVLPx33的动物相比，没有Qβ/poly L-Glu/x33样品诱导gp33-特异性CD8阳性T细胞的扩增(见表1)。
在测定gp33-特异的T细胞应答后，用1.5×106pfu表达gp33-肽的重组痘苗病毒激发小鼠。5天后，检测这些小鼠卵巢中的病毒滴度。卵巢的单细胞悬液在BSC40细胞的系列稀释液中温育。在5％CO2下37℃温育过夜后，细胞用结晶紫染色(500ml 96％乙醇，5g结晶紫(Sigma C-3886)，8g NaCl，450ml H2O，50ml甲醛)，以显示病毒诱导的细胞裂解产生的细胞层中的噬斑。卵巢中残余病毒的数量计算为噬斑形成单位(pfu)。与接受现有技术QβVLPx33的小鼠组相比，接受重装配的QβVLPx33疫苗的小鼠中噬斑形成单位明显较高(见表1)。
表1
实施例15RNase A消化的与小鼠TNF偶联的QβVLP，及其诱导的免疫应答A.小鼠TNF蛋白与现有技术QβVLP的偶联由含有半胱氨酸的连接体、六组氨酸标签和成熟鼠TNF蛋白(对应于未成熟蛋白的氨基酸78至233)组成的融合蛋白(SEQ ID NO67)在大肠杆菌中重组表达，并且通过亲和层析纯化为均质的。在20mMHEPES，150mM NaCl，pH 7.2中含有1.4mg/ml该蛋白质的溶液与等摩尔量的TCEP在室温温育60分钟。
500μl 3.06mg/ml现有技术QβVLP在20mM HEPES，150mM NaClpH 7.2中的溶液然后与4.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)在室温反应60分钟。反应溶液于4℃用更换的两份31 20mM HEPES pH 7.2分别透析2小时和14小时。将60μl衍生化且已透析的Qβ溶液与30μl H2O和180μl纯化的和预先还原的小鼠TNF蛋白混合，并在15℃温育4小时进行化学交联。用分子量阻断值为300,000Da的纤维素酯膜于4℃用PBS透析两次各2小时除去未偶联的蛋白质。
B. Qβ-mTNF的RNase消化300μl从A1获得的与鼠TNFα偶联的现有技术Qβ(Qβ-mTNF，0.7mg/ml)与3μl RNase A(100mg/ml)在轻轻搅拌下37℃温育3小时。现有技术Qβ中所含的RNA的消化程度通过对一份反应物进行琼脂糖凝胶电泳及随后用溴化乙锭染色来证实。在这个处理后约95％的大肠杆菌宿主RNA被消化。RNase-处理的Qβ-mTNF用过量的20mMHEPES pH 7.2透析过夜。
C.小鼠的免疫用现有技术Qβ-mTNF免疫3只雌性balb/c小鼠，用RNase-处理的Qβ-mTNF免疫5只雌性balb/c小鼠。25μg总蛋白在PBS中稀释成200μ1，在第0、14天皮下注射(在两个腹侧，100μl)。小鼠在第0和21天眼眶后取血，通过ELISA分析血清中的鼠TNF-特异性抗体效价。
D.ELISA微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用1μg/ml重组鼠TNFα包被过夜。血清中的总IgG效价和对于现有技术或重装配的QβVLP和TNFα具有特异性的不同亚类(IgG1，IgG2a)效价通过与实施例8所述基本相同的ELISA进行测定。
表2显示现有技术Qβ-mTNF和RNase-处理的Qβ-mTNF诱导的鼠TNFα特异性抗体。现有技术Qβ-mTNF诱导Th1型免疫应答，具有高IgG2a效价。IgG2a/IgG1效价的平均比约为0.75。Qβ-mTNF的RNAse-处理不影响IgG1效价，但是显著降低IgG2a效价，导致0.135的比值。这些数据表明，与现有技术Qβ-mTNF诱导的免疫应答相比，RNase-处理的Qβ-mTNF诱导的免疫应答从更多Th1免疫应答转变为更多Th2应答。
表2
实施例16鼠TNFα(4-23)肽与现有技术QβVLP以及与重装配的Qβ和AP205VLP的偶联3ml 3.06mg/ml完整QβVLP在20mM HEPES，150mM NaCl pH7.2中的溶液与99.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)室温反应60分钟。反应溶液用更换一次的20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2于4℃透析分别4小时和14小时。69μl衍生化并透析后的Qβ溶液与265.5μl 20mM HEPES pH 7.2和7.5μl具有与N末端融合的第二附着位点CGG的mTNFα(4-23)肽(23.6mg/ml，在DMSO中)混合，于15℃温育2小时进行化学交联。通过于4℃用PBS透析2次各2小时除去未偶联的肽。偶联产物在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。
类似的条件应用于将鼠TNFα(4-23)分别与重装配的Qβ和AP205VLP偶联。
实施例17VLP中包裹的RNA的量的测定VLP样品(见表2，1mg/ml)在10mM MgCl2和0.1M NaHCO3pH 9.7中60℃温育约16小时。这将包裹的RNA，优选核酸水解为核苷酸，并且沉淀蛋白质。使用转头F45-30-11(Eppendorf))将样品以14000rpm离心5分钟，分离从可溶性核苷酸中沉淀的蛋白质。
加入0.5M磷酸钠缓冲液pH 7将上清液的pH调节为pH 7。通过系列稀释进一步调节每个样品中的核苷酸浓度，以允许在低于2AU(AU表示“吸收单位”)的吸收范围内记录紫外数据。用相同，但是不含VLP的缓冲液作为参照。
考虑1 AU相当于33μg RNA/ml，由260nm处的吸收值计算对应于最初RNA，优选核酸的量的核苷酸浓度。样品的RNA浓度总结在表3中。
表3
实施例18马来酰亚胺-GnRH与现有技术QβVLP和重装配的QβVLP的偶联(A)马来酰亚胺-GnRH的制备肽GnRH按照标准方法化学合成。MBS(m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯)或SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸)在肽的N末端与氨基共价连接。
(B)QβVLP的氨基转化为巯基现有技术QβVLP和重装配的QβVLP(PBS中的贮存溶液)与0.1M磷酸钠pH 7和2-亚氨硫醇(200mM，在DMSO中的贮存溶液)混合至终浓度为2mg/ml QβVLP，50mM磷酸钠pH 7，和15mM 2-亚氨硫醇。该混合物室温温育2小时，随后通过凝胶过滤(Sephadex G25，在PBS中)除去过量的未反应的2-亚氨硫醇，生成纯化的、SH修饰的QβVLP溶液，浓度约为1.4mg/ml。
(C)马来酰亚胺-GnRH的偶联由步骤(B)获得的SH-修饰的现有技术QβVLP和SH-修饰的重装配的QβVLP(1.4mg/ml)与1/20体积的马来酰亚胺-GnRH贮存溶液(10mM，在DMSO中)混合，室温温育1小时。使用300kDa的膜通过渗滤除去未偶联的马来酰亚胺-GnRH。偶联结果通过SDS-PAGE凝胶法证实。
实施例19热原试验该试验按照如欧洲药典第4版第2.6.8章第131-132页的标准热原试验程序进行，在此引用作为参考。
试验样品是在聚谷氨酸的存在下重装配的QβVLP，RNase处理的QβVLP，ZnSO4处理的QβVLP，和含有大肠杆菌RNA的现有技术Qβ。QβVLP的浓度为0.3mg/ml。在注射前将样品预加温到38.5℃。
该试验中使用的动物是体重约为3kg的健康成年兔。每组检测3只兔。
简要地说，在不超过4分钟的时间内将0.3ml/kg体重的量的样品缓慢注射到每只兔的耳边缘静脉内。每只兔的初始温度是在注射样品前紧接的40分钟内以30分钟间隔记录的该兔的两个温度读数的平均值。每只兔的最高温度是在注射后3小时内记录的该兔的最高温度。以不超过30分钟的间隔记录每只兔的温度，从样品注射前至少90分钟开始，在注射后继续3小时。以每只兔的最高温度和初始温度之差作为它的应答。研究了被检测的VLP在兔中诱导发热的能力，并与现有技术VLP比较。
实施例20IL-5与重装配的QβVLP的偶联和它诱导的免疫应答的测定实施例21IL-5与现有技术QβVLP以及与在聚-L-谷氨酸存在下重装配的QβVLP的偶联，和它诱导的免疫应答的测定与N末端γ3氨基酸连接体(SEQ ID NO48)融合的小鼠IL-5(SEQID NO46)或人IL-5(SEQ ID NO47)在大肠杆菌中重组产生并且纯化。现有技术QβVLP和在聚-L-谷氨酸存在下重装配的QβVLP用10倍摩尔过量的SMPH于25℃衍生化30分钟。衍生化反应物在MWCO为10,000的Slide-A-Lyzer透析盒中用1000倍体积的由20mM Hepes，150mM NaCl；pH 7.4组成的透析缓冲液透析2次各2小时。纯化的小鼠IL-5用2倍摩尔过量的pH中和的TCEP预还原60分钟。还原的小鼠IL-5(42μM)分别与根据实施例1制备的40μM SMPH-衍生化的现有技术QβVLP和42μM小鼠IL-5在20℃温育3小时，与根据实施例4制备的40μM SMPH-衍生化的在聚-L-谷氨酸存在下重装配的QβVLP于20℃温育3小时。使用300kDa截止值的透析膜透析偶联反应物12小时，再用PBS pH 8.0透析6小时。
每组5只雌性BalbC小鼠在第0、14、28天皮下注射在200μl PBS中的50μg、25μg和50μg的“现有技术-Qβ-小鼠IL-5”或“重装配的Qβ-小鼠IL-5”疫苗(100μl，两腹侧)。作为对照，5只小鼠在第0、14、28天只用现有技术QβVLP或在聚-L-谷氨酸存在下重装配的QβVLP免疫。疫苗施用时不加佐剂。小鼠在免疫方案的第0、14、21、28天采血。
微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用2μg/ml重组鼠IL-5或2μg/ml现有技术Qβ或2μg/ml在聚-L-谷氨酸存在下重装配的Qβ包被过夜。血清中的总IgG效价和对现有技术或重装配的QβVLP和IL-5具有特异性的不同亚类(IgG1，IgG2a)效价通过基本与实施例8所述相同的ELISA进行测定。
表4
表4显示现有技术-Qβ-小鼠-IL-5和重装配的Qβ-小鼠-IL-5诱导的鼠IL-5特异性抗体。现有技术Qβ-IL-5诱导Th1型免疫应答，具有高IgG2a效价。IgG2a/IgG1效价的平均比约为2.5。而用在聚-L-谷氨酸存在下重装配的QβVLP制备的Qβ-小鼠-IL-5疫苗免疫小鼠显著降低了IgG2a效价，得到0.0077的平均比。这些数据表明，与现有技术Qβ-mIL-5诱导的免疫应答相比，含有聚-L-谷氨酸的重装配的Qβ-mIL-5诱导的免疫应答从Th1免疫应答转变为更多Th2应答。注意，合并来自5只小鼠(每组包括5只小鼠)的血清进行ELISA分析。
一致地，抗-Qβ效价显示针对VLP的相同的免疫应答。使用现有技术QβVLP诱导针对Qβ的Th1型免疫应答，具有高IgG2a效价。相反，使用在聚-L-谷氨酸存在下重装配的QβVLP诱导更多Th2型的针对Qβ的免疫应答(数据未显示)。
嗜酸粒细胞增多模型利用变应性气管炎症的一种实验性哮喘模型来评价接种对嗜酸粒细胞增多的效果。Balb/c小鼠(每组5只)如上所述用与小鼠IL-5偶联的重装配的QβVLP免疫。在接种程序的第35天，对小鼠腹膜内注射在Alumn(Alu-Gel-S)中的50μg卵白蛋白(OVA)。不接受免疫的第三组4只小鼠也进行注射。10天后(即第33天)，小鼠每天接受鼻内给药的PBS中的100μg OVA，共4天。最后一次激发后24小时，处死小鼠，用PBS洗肺。支气管肺泡灌洗液(BAL)中所含的细胞用Maigrünwald-Giemsa染色，并计数嗜酸粒细胞的数目(TrifilieffA，等人.Clin Exp Allergy.2001 Jun；31(6)934-42)。
实施例21胃泌素片段与重装配的QβVLP偶联按照标准程序化学合成下列具有融合的连接体序列的胃泌素片段。
G17(1-9)C2pEGPWLEEEESSPPPPC(SEQ ID NO72)c1G17 pEGPWLEEEEEAYGWMDFGGC(SEQ ID NO73)nG17amide CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2(SEQ ID NO74)nG17-GCGGQGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO54)nG34amidc CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2(SEQ ID NO75)nG34-GCGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO76)2ml 2.0mg/ml重装配的QβVLP在20mM Hepes，150mM NaClpH 7.2中的溶液与114.4μl SMPH(Pierce)溶液(来自溶于DMSO中的50mM贮存溶液)于25℃反应60分钟。反应溶液随后用2L 20mMHepes，150mM NaCl，pH 7.2于4℃透析两次2小时。
然后用透析后的衍生化QβVLP来偶联c1G17。简要地说，1ml衍生化的QβVLP(浓度为2mg/ml)与167μl 10mM肽在DMSO中的溶液和100μl乙腈在15℃反应2小时。偶联反应物然后以16 100rcf离心5分钟，收集上清液，并透析1次2小时，然后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2于4℃透析过夜。偶联的产物被命名为Qβ-clG17。在基本上相同的条件下，nG17amide、nG17-G、nG34amide和nG34-G与重装配的QβVLP偶联。
实施例22用Qβ-clG17、Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide、Qβ-nG34-G、Qβ-G17(1-9)C2和DT-G17(1-9)C2免疫小鼠，和通过ELISA检测抗体效价成年雌性C57BL/6小鼠接种Qβ-clG17(每组5小鼠)、Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide或Qβ-nG34-G(每组3小鼠)。50μg Qβ-clG17或25μg Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide和Qβ-nG34-G(在实施例21中获得)用PBS稀释至200μl的体积，并在第0、14天皮下注射(100μl，在两腹侧)。不加佐剂施用疫苗。作为对照，一组小鼠注射50μg重装配的Qβ。用Qβ-ClG17免疫的小鼠在第0，14，21，28，42，69和101天眼眶后采血，用Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide和Qβ-nG34-G免疫的小鼠在第0，14，21，28，42，56和77天眼眶后采血。
5mg/ml RNase和0.2mM SPDP(终浓度)室温温育1小时。RNase-SPDP溶液用PD10柱(Amersham)纯化。纯化后，将10mM EDTA和1mM肽加入RNase-SPDP溶液中。
ELISA板(96孔MAXIsorp，NUNC)用在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中浓度为10μg/ml的RNase-偶联的clG17或nG17amide、nG17-G、nG34smide、nG34-G包被，4℃过夜。用洗涤缓冲液(PBS-0.05％Tween)洗板后，板用封闭缓冲液(2％BSA-PBS-Tween 20溶液)37℃封闭2小时，然后再次洗涤，并与系列稀释的小鼠血清一起温育。作为对照，也检测了同一小鼠的免疫前血清。板在室温下温育2小时。进一步洗涤后，用HRPO-标记的Fc特异性山羊抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoresearch)检测结合的抗体，室温温育1小时。进一步洗涤后，将板用OPD溶液(1片OPD片，25μl OPD缓冲液和8μl H2O2)显色6分钟，用5％H2SO4溶液终止反应。用ELISA读板器(Biorad Benchmark)在450nm处读板。ELISA效价表示为在ELISA测定中达到半数最大OD的血清稀释度。
实施例23CXCR4片段与现有技术和重装配的QβVLP的偶联根据标准程序(Peter Henklein，Charite，Berlin，Germany)化学合成具有与CXCR4片段1-39的N-或C-末端融合的CGG或GGC连接体序列的CXCR4片段1-39(SEQ ID NO66)，和通过将在N末端添加的C与在C末端添加的G连接而环化的CXCR4片段176-185(SEQ IDNO65)。
3ml(1.0mg/ml)现有技术或重装配的QβVLP在20mM Hepes，pH 7.2中的溶液与85μl SMPH(50mM在DMSO中，Pierce)25℃反应30分钟。反应物然后用3L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析2次2小时。然后利用透析后的衍生化的现有技术Qβ或重装配的VLP偶联肽CXCR4-CGG-1-39、CXCR4-1-39-GGC或CXCR4-C-176-185-G。简要地说，1ml浓度为1mg/ml的衍生化的现有技术或重装配的QβVLP与70μl 5mM肽溶液在20mM Hepes，pH 7.2中25℃反应2小时。偶联反应物然后以13 000rpm离心5分钟，收集上清液，用1L 20mMHepes，pH 7.2于4℃透析一次2小时，然后过夜。
实施例24用Qβ-CXCR4-CGG-1-39、Qβ-CXCR4-1-39-GGC或Qβ-CXCR4-C-176-185-G免疫小鼠及抗体亚型的检测成年雌性C57BL/6小鼠(每组3只)接种与CXCR4片段偶联的现有技术或重装配的QβVLP(实施例23中获得的)，仅使用现有技术或重装配的QβVLP作为对照。来自每个样品的100μg透析后的疫苗用PBS稀释至体积为200μl，在第0天和第14天皮下注射(100μl，在两腹侧)。施用疫苗时不使用或使用佐剂(Allhydrogel，1mg/注射)。小鼠在第14、21、28天眼眶后采血，并通过与实施例8所述基本相同的ELISA测定小鼠中的IgE效价、总IgG效价和对CXCR4片段具有特异性的不同亚类(IgG1，IgG2a)的效价。
实施例25CCR5片段与现有技术或重装配的QβVLP的偶联和小鼠的免疫按照标准程序化学合成在C末端具有另外一个酰胺化的Cys的环肽ECL2A(SEQ ID NO61)或PNt(SEQ ID NO63)。
2g/l现有技术或重装配的QβVLP用1.43mM SMPH(Pierce，Perbio Science)于25℃衍生化30分钟，然后用20mM Hepes pH8，150mM NaCl透析。将1g/l衍生化的QβVLP溶解在20％乙腈，150mM NaCl，20mM磷酸盐pH7.5中。加入0.286mM CCR5片段ECL2A或PNt，于25℃温育2小时。
6只雌性黑色小鼠在第0天用50μg与CCR5片段偶联的现有技术或重装配的QβVLP初次免疫(皮下，在0.2ml PBS中)，并与只用50μg现有技术或重装配的QβVLP免疫的BalbC小鼠进行比较。在第14天用相同疫苗加强免疫后，在第14天和第21天通过ELISA检测抗-Qβ和抗-CCR5抗体的效价。
实施例26CCR5特异性小鼠多克隆抗体的纯化及其在HIV-中和测定中的作用来自被免疫小鼠的血清(在实施例25中获得)以14,000rpm离心5分钟。将上清液加样到3.3ml预洗的蛋白Gsepharose柱(AmershamBiosciences)上。然后用PBS洗柱，用100mM甘氨酸pH2.8洗脱。将1ml级分收集到预先装有100μl 1M Tris pH8的管中。合并在280nm处具有吸收的峰级分。
CCR5共同受体特异的株，JR-FL和SF162，以前已有描述(O′Brien等人，Nature 1990，348，69；和Shioda等人，Nature 1991，349，167)。用测定培养基将贮存溶液中的HIV-1接种物调节为含有大约1,000至4,000 TCID50/ml(TCID5050％组织培养感染剂量)。
刺激的排除CD8的初级PBMC(用于HIV中和测定)简言之，使用Rosette Sep混合物(StemCell Technologies Inc.，BIOCOBA AG，Switzerland)将从3名健康献血者获得的血沉棕黄层除去CD8+T细胞，通过Ficoll-Hypaque离心(Amersham-PharmaciaBiotech)分离PBMC。将细胞用培养基(RPMI 1640，10％FCS，100U/mlIL-2，谷氨酰胺和抗生素)调节为4×106/ml，分成三份，并用5μg/ml植物凝集素(PHA)、0.5μg/ml PHA或1mg/l抗-CD3 MAb OKT3刺激。72小时后，将所有三种刺激的细胞混合，作为刺激的CD4+T细胞的来源用于感染和病毒中和实验。
简言之，细胞与系列稀释的纯化的多克隆小鼠IgG或对照抗体2D7(25μg/ml-25ng/ml；Pharmingen)在96-孔培养板中37℃温育1小时。然后加入病毒接种物(100 TCID50；50％组织培养感染剂量；Trkila等人，J.Virol.，1999，8966)，将培养板培养4-14天。总感染体积为200μL。优选地，在感染后的第6天，如以前所述(Moore等人，1990.Science 250，1139)，利用免疫测定法测定上清液基质中HIV-1 p24抗原的产生。
实施例27缓激肽(BK)和des-Arg-缓激肽(des-Arg9-BK)与现有技术和重装配的QβVLP偶联按照标准程序化学合成具有与序列N末端融合的Cys的缓激肽(BK)(SEQ ID NO55)和des-Arg9-缓激肽(SEQ ID NO56)或具有与C末端融合的Cys的缓激肽(BK)。
3ml(1.0mg/ml)现有技术或重装配的QβVLP在20mM Hepes，pH 7.2中的溶液与84μl SMPH(50mM，在DMSO中，Pierce)25℃反应30分钟。反应物然后用3L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析2次2小时。然后利用透析后的衍生化的QβVLP偶联缓激肽或des-Arg9-缓激肽。简要地说，3ml浓度为1mg/ml的衍生化的现有技术或重装配的QβVLP与42μl 50mM缓激肽或des-Arg-缓激肽在20mM Hepes，pH 7.2中25℃反应2小时。偶联反应物然后以13 000rpm离心5分钟，收集上清液，用3L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析一次2小时，然后过夜。
实施例28用Qβ-BK和Qβ-des-Arg9-BK免疫小鼠及抗体亚型的检测成年雌性C57BL/6小鼠(每组10只)接种与现有技术或重装配的QβVLP偶联的Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK(实施例27中获得的)。来自每个样品的50μg透析后的疫苗用PBS稀释至体积为200μl，在第0、14、28天皮下注射(100μl，在两腹侧)。施用疫苗时不使用佐剂。作为对照，一组小鼠注射PBS。小鼠在第0、14、21、33天眼眶后采血。
通过与实施例8所述基本相同的ELISA测定血清中的总IgG效价和对现有技术或重装配的QβVLP和TNFα具有特异性的不同亚类(IgG1，IgG2a)的效价。ELISA血清效价(表5和表6)被定义为达到饱和时测定的光密度的50％所需的稀释度的倒数。
表5在第0、14、28天分别用现有技术Qβ、重装配的Qβ、Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK免疫的小鼠中抗-现有技术Qβ、抗-重装配的Qβ、抗-BK和抗-des-Arg9-BK特异性tIgG、IgG2a和IgG1(以稀释倍数表示)的平均值。数据表明，与未偶联或偶联到抗原上的现有技术QβVLP诱导的免疫应答相比，重装配的QβVLP，无论与抗原偶联或未偶联，均已从更多Th1免疫应答转变至更多Th2应答。
表6
数据表明，与现有技术Qβ-mTNF诱导的应答相比，未偶联或偶联到抗原上的重装配的QβVLP已经从更多Th1免疫应答转变为更多Th2应答。
实施例29与AP205VLP的C末端融合的CETP片段的克隆、表达和纯化通过使两种编码CETP片段并分别含有Kpn2I和Mph1103I限制性位点的互补寡核苷酸退火而产生编码CETP片段(SEQ ID NO69)的DNA片段。获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到载体pAP405-61(如美国临时申请60/611,308的实施例1所述)的相同限制性位点内，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。获得的构建体是AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-FGFPEHLLVDFLQSLS。
AP205-11-CETP1蛋白基本如WO04/007538所述表达和纯化。除去AP205VLP内包装的大肠杆菌RNA的其他步骤基本与以上实施例5所述相同。
实施例30CETP肽CETP1与重装配的QβVLP的化学偶联具有与N末端融合的额外CGG连接体的CETP片段(SEQ ID NO69)由EMC microcollections GmbH(Germany)固相化学法合成。该肽在C末端酰胺化。
2ml(2.0mg/ml)重装配的QβVLP(实施例4获得的)在20mMHepes，150mM NaCl pH 7.4中的溶液与57μl SMPH溶液(在DMSO中的50mM贮存液，Pierce)25℃反应30分钟。反应物然后用2L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析2次2小时。然后利用透析后的衍生化的重装配的QβVLP偶联CETP片段。简要地说，1ml浓度为2mg/ml的衍生化的重装配的QβVLP与100μl 50mM肽溶液在20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4中15℃反应2小时。偶联反应物然后以16 000g离心5分钟，收集上清液，用2L 20mM Hepes，pH 7.4于4℃透析两次2小时。
实施例31在胆固醇饲养的兔动脉粥样硬化模型中CETP疫苗的检测新西兰白兔(每组n＝12)在第0天皮下接种200μg如实施例30或实施例29获得的VLP-CETP片段疫苗或VLP，在第3、6、9、12、15、19、23、27周加强免疫。在第16周将兔置于高胆固醇(0.25％)饮食下，在该饮食下再保持16周。以固定间隔从禁食的兔中收集血浆样品，用于抗体效价、脂蛋白、胆固醇和CETP活性测定。在第32周处死动物，取出主动脉进行动脉粥样硬化病变分析。在主动脉″enface″制备后，主动脉用油红0染色，并计算每只动物被病变覆盖的主动脉的百分比。
实施例32mC5acys与重装配的QβVLP偶联含有N-末端CGSGG连接体的鼠C5a氨基酸序列(SEQ ID NO58，下文中称为mC5acys)由Dictagene SA化学合成。化学合成(EMCMicrocollections GmbH，Germany)鼠C5a序列的C-末端19个氨基酸，它在N末端具有一个额外的CGG连接体(SEQ ID NO71，下文中称为mC5acys59-77)。
143μM重装配的QβVLP在4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.2)中的溶液与2倍摩尔过量的(286μM)SMPH(Pierce)在振摇下25℃反应30分钟。使用具有10,000Da分子量截止值的透析单位，将反应产物用更换一次的Dulbecco′s PBS(Gibco)透析(Slide-A-Lyzer，Pierce)。
将等摩尔量的mC5acys加入到36μM SMPH-衍生化的QβVLP溶液中。反应体积为100μl，平行进行多个反应。反应物在15℃振摇下温育2小时。偶联后，将等份于4℃以16,000×g离心3分钟，以沉淀不可溶的物质。疫苗在可溶的级分中。
将2倍摩尔过量的mC5acys59-77加入到5摩尔过量的SMPH-衍生化的QβVLP的107μM溶液中。反应体积为100μl，平行进行多个反应。反应物在15℃振摇下温育2小时。偶联后，将等份于4℃以16,000×g离心3分钟，以沉淀不可溶的物质。使用10,000MW截止值的透析盒，将可溶的疫苗用PBS透析2次各2小时。
实施例33在胶原诱导的关节炎模型中用Qβ-mC5acys VLP免疫小鼠6周大的雄性DBA/1JCr1小鼠(Charles River，Deutschland)在胁部用在Dulbecco′s PBS中稀释的50μg重装配的Qβ-mC5acys(n＝8)或只用30μg重装配的QβVLP(n＝8)皮下免疫。在初次免疫后的第15和24天皮下给予另外两次加强免疫。通过ELISA测定抗-mC5acys抗体效价。在初次免疫后的第35和57天，用使用玻璃注射器在弗氏完全佐剂(CFA)中以1∶1比例乳化的100μg II型牛胶原(MDBiosciences)在小鼠尾巴根部皮内免疫两次。然后通过每日测量前肢和后肢关节厚度以及通过每日评估关节的临床得分，监测小鼠中胶原诱导的关节炎的诱导和严重程度。使用恒定张力卡尺测量关节厚度。
实施例34用Qβ-CCR5片段免疫小鼠及抗体亚型的检测成年雌性C57BL/6小鼠(每组3只)接种与CCR5片段偶联的现有技术或重装配的QβVLP(实施例25中获得的)，使用现有技术或重装配的QβVLP作为对照。来自每个样品的100μg透析后的疫苗用PBS稀释至体积为200μl，在第0天和第14天皮下注射(100μl，在两腹侧)。施用疫苗时不使用或使用佐剂(Allhydrogel，1mg/注射)。小鼠在第14、21、28天眼眶后采血，并通过ELISA测定小鼠中的IgE效价、总IgG效价和对CCR5片段具有特异性的不同亚类(IgG1，IgG2a)的效价。
微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用10μg/ml与RNAse偶联的CCR5片段包被过夜。血清中的总IgG效价和对现有技术或重装配的QβVLP和TNFα具有特异性的不同亚类(IgG1，IgG2a)的效价通过与实施例8所述基本相同的ELISA进行测定。
实施例35针对Qβ-BK、Qβ-des-Arg9-BK接种在治疗胶原诱导的关节炎中的效果在胶原诱导的关节炎(CIA)鼠模型中检测重装配的Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK的效果。每组10只雄性DBA/1小鼠用50μg Qβ-BK、Qβ-des-Arg9-BK或单独的Qβ皮内免疫三次(第0、14、28天)。然后给小鼠皮内注射两次(第34、55天)与完全弗氏佐剂混合的200μg II型牛胶原。
第二次胶原/CFA注射后，定期检查小鼠，并根据观察到的变红和肿胀程度给予每一肢从0到3之间的临床得分。在第二次胶原/CFA注射后三周，确定三个实验组中每肢的平均临床得分。
实施例36针对Qβ-BK和Qβ-des-Arg9-BK接种在治疗变应性气管炎症(AAI)中的效果利用变应性气管炎症的一个实验哮喘模型评估针对缓激肽(BK)和des-Arg9-缓激肽(des-Arg9-BK)接种对Th2-介导的免疫应答的效果，该免疫应答的特征在于嗜酸性粒细胞向肺内流入，细胞因子(IL-4，IL-5，IL-13)产生，IgE抗体和粘液产生，和支气管高反应性(BHR)。Balb/c小鼠(每组5只)如实施例15所述用Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK免疫，或单独注射Qβ。第一次免疫35天后，对小鼠腹膜内注射50μg卵白蛋白(OVA)，其中使用或不使用佐剂(Alhydrogel，1mg AlOH/注射)。10天后(即第45天)，所有小鼠每天用PBS中的50μg OVA鼻内激发，连续4天。最后一次激发后24小时，用全身容积描记器测定BHR。然后在特定时间点处死小鼠，分析肺的炎症和Th2-介导的免疫应答。用PBS/1％BSA进行肺灌洗。用Coulter计数器(Instrumenten Gesellschaft AG)计数支气管肺泡灌洗液(BAL)中所含的细胞，并用如前所述(Trifilieff A，等人.ClinExp Allergy.2001 Jun；31(6)934-42)的Maigrünwald-Giemsa染色进行鉴别。
序列表<110>赛托斯生物生物技术公司M·巴克曼K·普罗巴P·毛雷尔E·米杰林克K·施瓦茨<120>VLP-抗原偶联物及其作为疫苗的用途<130>P1035PC00<160>122<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>10<212>PRT<213>哺乳动物<400>1Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>2<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH类似物CGG-GnRH<400>2Cys Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH类似物GnRH-GGC<400>3Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly Cys1 5 10<210>4<211>11<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>GnRH类似物C-GnRH<400>4Cys Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>5<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH类似物GnRH-C<400>5Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Cys1 5 10<210>6<211>189<212>PRT<213>人<400>6Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr1 5 10 15Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln20 25 30Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His35 40 45Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr50 55 60Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln65 70 75 80Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly85 90 95Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu100 105 110Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu115 120 125
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr130 135 140Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu145 150 155 160Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala165 170 175Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro180 185<210>7<211>170<212>PRT<213>人<400>7Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val20 25 30Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp35 40 45Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg50 55 60Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe65 70 75 80Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu85 90 95Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu100 105 110Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile115 120 125Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe130 135 140Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val145 150 155 160
Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro165 170<210>8<211>20<212>PRT<213>人<400>8Gln Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala1 5 10 15His Pro Leu Val20<210>9<211>21<212>PRT<213>人<400>9Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Ser Gln Leu Leu Gln20<210>10<211>132<212>PRT<213>噬菌体Q-beta<400>10Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>11<211>329<212>PRT<213>噬菌体Q-beta<400>11Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu260 265 270Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325<210>12<211>129<212>PRT<213>噬菌体R17<400>12Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>13<211>130<212>PRT<213>噬菌体fr<400>13Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
100 105 110Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125Ile Tyr130<210>14<211>130<212>PRT<213>噬菌体GA<400>14Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val50 55 60Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe100 105 110Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125Tyr Ala130<210>15<211>132<212>PRT<213>噬菌体SP<400>15Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1 5 10 15Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>16<211>329<212>PRT<213>噬菌体SP<400>16Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp1 5 10 15Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val50 55 60Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp65 70 75 80
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<210>17<211>130<212>PRT<213>噬菌体MS2<400>17Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe85 90 95Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu100 105 110Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125Ile Tyr130<210>18<211>133<212>PRT<213>噬菌体M11<400>18Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>19<21l>133<212>PRT<213>噬菌体MXl<400>19Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>20<211>330<212>PRT<213>噬菌体NL95<400>20Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly1 5 10 15Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly130 135 140Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro145 150 155 160Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly165 170 175Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys180 185 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp210 215 220Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp225 230 235 240Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp245 250 255Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr260 265 270Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala275 280 285Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro305 310 315 320Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu325 330<210>21<211>129<212>PRT<213>噬菌体f2<400>21Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>22<211>128<212>PRT<213>噬菌体PP7<400>22Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu1 5 10 15Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg65 70 75 80Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85 90 95Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 105 110Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 125<210>23<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Qbeta 240突变体<400>23Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>24<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta 243突变体<400>24Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>25<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta 250突变体<400>25Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>26<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta 251突变体<400>26Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>27<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta 259突变体
<400>27Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>28<21l>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH类似物GnRH 1Q-10<400>28Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>29<211>131<212>PRT<213>噬菌体AP205<400>29Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210>30<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH类似物串联序列<400>30Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly1 5 10 15Leu Arg Pro Gly20<210>31<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH类似物串联序列<400>31Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gln His Trp Ser Tyr Gly
1 5 10 15Leu Arg Pro Gly20<210>32<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH类似物串联序列<400>32Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gln His Trp Ser Tyr Gly1 5 10 15Leu Arg Pro Gly20<210>33<211>14<212>PRT<213>人<400>33Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu1 5 10<210>34<211>22<212>PRT<213>人<400>34Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser1 5 10 15Leu Leu Pro Asp Ser Pro20<210>35<211>17<212>PRT<213>人<400>35Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln1 5 10 15
Pro<210>36<211>27<212>PRT<213>人<400>36Gly Glu Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala1 5 10 15Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro20 25<210>37<211>19<212>PRT<213>人<400>37Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro1 5 10 15Ser Gln Pro<210>38<211>8<212>PRT<213>人<400>38Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro1 5<210>39<211>7<212>PRT<213>人<400>39Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala1 5<210>40<211>39<212>PRT<213>人<400>40
Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser1 5 10 15Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly20 25 30Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro35<210>41<211>6<212>PRT<213>人<400>41Leu Leu Pro Asp Ser Pro1 5<210>42<211>28<212>PRT<213>人<400>42Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu Leu Pro Asp1 5 10 15Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly20 25<210>43<211>32<212>PRT<213>人<400>43Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser1 5 10 15Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly20 25 30<210>44<211>7<212>PRT<213>人<400>44Gln Pro Glu Gly His His Trp
1 5<210>45<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TNF-超家族成员之间的同源序列<400>45Lys Pro Ala Ala His Leu Val Gly Lys Pro Leu Gly Gln Gly Pro Leu1 5 10 15Ser Trp Glu Asn Asp Gly Gly Thr Ala20 25<210>46<211>113<212>PRT<213>小鼠<400>46Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1 5 10 15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro20 25 30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln35 40 45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu50 55 60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65 70 75 80Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp85 90 95Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu100 105 110Gly<210>47
<211>115<212>PRT<213>人<400>47Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg20 25 30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile35 40 45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr50 55 60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65 70 75 80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe85 90 95Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile100 105 110Ile Glu Ser115<210>48<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端gamma 3连接体<400>48Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15Pro<210>49<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胃泌素片段1-9<400>49Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu1 5<210>50<211>17<212>PRT<213>人<400>50Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15Phe<210>51<211>18<212>PRT<213>人<400>51Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15Phe Gly<210>52<211>34<212>PRT<213>人<400>52Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys1 5 10 15Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30Asp Phe<210>53<211>35<212>PRT<213>人
<400>53Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys1 5 10 15Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30Asp Phe Gly35<210>54<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胃泌素CCG1-17G<400>54Cys Gly Gly Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly1 5 10 15Trp Met Asp Phe Gly20<210>55<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>55Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg1 5<210>56<211>8<212>PRT<213>小鼠<400>56Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe1 5<210>57<211>74<212>PRT<213>人<400>57Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser
1 5 10 15Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu20 25 30Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile35 40 45Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn50 55 60Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg65 70<210>58<211>82<212>PRT<213>小鼠<400>58Cys Gly Ser Gly Gly Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp20 25 30Gly Ala Arg Val Asn Phe Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg35 40 45Val Thr Ile Gly Pro Leu Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr50 55 60Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu65 70 75 80Gly Arg<210>59<211>20<212>PRT<213>人<400>59Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met1 5 10 15Gln Leu Gly Arg
20<210>60<211>352<212>PRT<213>人<400>60Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu20 25 30Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn35 40 45Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met50 55 60Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu65 70 75 80Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe85 90 95Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe100 105 110Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu115 120 125Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe130 135 140Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser145 150 155 160Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr165 170 175Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn180 185 190Phe Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu195 200 205
Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys210 215 220Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile225 230 235 240Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu245 250 255Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser260 265 270Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr275 280 285His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe290 295 300Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe305 310 315 320Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser325 330 335Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu340 345 350<210>61<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>环状CCR5 ECL2A<400>61Cys Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Gly1 5 10<210>62<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CCR5 ECL2A<400>62Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr1 5 10
<210>63<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CCR5 PNt<400>63Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg20 25 30<210>64<211>352<212>PRT<213>人<400>64Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met1 5 10 15Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu20 25 30Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile35 40 45Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly50 55 60Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu65 70 75 80Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val85 90 95Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val100 105 110His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala115 120 125Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser130 135 140
Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val145 150 155 160Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn165 170 175Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn180 185 190Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu195 200 205Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser210 215 220Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr225 230 235 240Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr245 250 255Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln260 265 270Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu275 280 285Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe290 295 300Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val305 310 315 320Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly325 330 335His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser340 345 350<210>65<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CXCR4 176-185<400>65
Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile1 5 10<210>66<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CXCR4 1-39<400>66Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met1 5 10 15Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu20 25 30Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile35<210>67<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在N末端具有含his和cys的连接体的小鼠TNF<400>67Met Gly Cys Gly Gly Gly His His His His His His Gly Ser Leu Arg1 5 10 15Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala20 25 30Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn35 40 45Ala Leu Leu Ala Asr Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val Val50 55 60Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly65 70 75 80Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe85 90 95Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys Ser
100 105 110Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln130 135 140Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu165 170<210>68<211>476<212>PRT<213>人<400>68Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile Val Cys Arg Ile Thr1 5 10 15Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu Asn His Glu Thr Ala Lys Val Ile Gln20 25 30Thr Ala Phe Gln Arg Ala Ser Tyr Pro Asp Ile Thr Gly Glu Lys Ala35 40 45Met Met Leu Leu Gly Gln Val Lys Tyr Gly Leu His Asn Ile Gln Ile50 55 60Ser His Leu Ser Ile Ala Ser Ser Gln Val Glu Leu Val Glu Ala Lys65 70 75 80Ser Ile Asp Val Ser Ile Gln Asn Val Ser Val Val Phe Lys Gly Thr85 90 95Leu Lys Tyr Gly Tyr Thr Thr Ala Trp Trp Leu Gly Ile Asp Gln Ser100 105 110Ile Asp Phe Glu Ile Asp Ser Ala Ile Asp Leu Gln Ile Asn Thr Gln115 120 125Leu Thr Cys Asp Ser Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Pro Asp Cys Tyr130 135 140
Leu Ser Phe His Lys Leu Leu Leu His Leu Gln Gly Glu Arg Glu Pro145 150 155 160Gly Trp Ile Lys Gln Leu Phe Thr Asn Phe Ile Ser Phe Thr Leu Lys165 170 175Leu Val Leu Lys Gly Gln Ile Cys Lys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn180 185 190Ile Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser Ile Leu Ser Asp195 200 205Gly Asp Ile Gly Val Asp Ile Ser Leu Thr Gly Asp Pro Val Ile Thr210 215 220Ala Ser Tyr Leu Glu Ser His His Lys Gly His Phe Ile Tyr Lys Asn225 230 235 240Val Ser Glu Asp Leu Pro Leu Pro Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Gly245 250 255Asp Ser Arg Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe His Ser260 265 270Leu Ala Lys Val Ala Phe Gln Asp Gly Arg Leu Met Leu Ser Leu Met275 280 285Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr Trp Gly Phe Asn Thr Asn290 295 300Gln Glu Ile Phe Gln Glu Val Val Gly Gly Phe Pro Ser Gln Ala Gln305 310 315 320Val Thr Val His Cys Leu Lys Met Pro Lys Ile Ser Cys Gln Asn Lys325 330 335Gly Val Val Val Asn Ser Ser Val Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg340 345 350Pro Asp Gln Gln His Ser Val Ala Tyr Thr Phe Glu Glu Asp Ile Val355 360 365Thr Thr Val Gln Ala Ser Tyr Ser Lys Lys Lys Leu Phe Leu Ser Leu370 375 380Leu Asp Phe Gln Ile Thr Pro Lys Thr Val Ser Asn Leu Thr Glu Ser385 390 395 400
Ser Ser Glu Ser Ile Gln Ser Phe Leu Gln Ser Met Ile Thr Ala Val405 410 415Gly Ile Pro Glu Val Met Ser Arg Leu Glu Val Val Phe Thr Ala Leu420 425 430Met Asn Ser Lys Gly Val Ser Leu Phe Asp Ile Ile Asn Pro Glu Ile435 440 445Ile Thr Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro450 455 460Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser465 470 475<210>69<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CETP 461-476<400>69Phe Gly Phe Pro Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser1 5 10 15<210>70<211>82<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGSGG小鼠C5a<400>70Cys Gly Ser Gly Gly Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp20 25 30Gly Ala Arg Val Asn Phe Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg35 40 45Val Thr Ile Gly Pro Leu Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr50 55 60Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu
65 70 75 80Gly Arg<210>71<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGG小鼠C5a59-77<400>71Cys Gly Gly Thr Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys1 5 10 15Pro Val Gln Leu Gly Arg20<210>72<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>G17(1-9)C2<400>72Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys1 5 10 15<210>73<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>clG17<400>73Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15Phe Gly Gly Cys20<210>74<211>20<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>nGl7amide<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>F被酰胺化<400>74Cys Gly Gly Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly1 5 10 15Trp Met Asp Phe20<210>75<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>nG34amide<400>75Cys Gly Gly Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp1 5 10 15Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr20 25 30Gly Trp Met Asp Phe35<210>76<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>nG34-G<400>76Cys Gly Gly Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp1 5 10 15Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr20 25 30Gly Trp Met Asp Phe Gly35
<210>77<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长素释放肽1-6<400>77Gly Ser Ser Phe Leu Ser1 5<210>78<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长素释放肽1-7<400>78Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro1 5<210>79<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长素释放肽1-8<400>79Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu1 5<210>80<211>10<212>PRT<213>人<400>80Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg1 5 10<210>81<211>9<212>PRT<213>人<400>81
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe1 5<210>82<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长素释放肽1-14<400>82Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln1 5 10<210>83<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>狗生长素释放肽1-13<400>83Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln1 5 10<210>84<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>猫生长素释放肽1-13<400>84Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln1 5 10<210>85<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长素释放肽1-10<400>85Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln1 5 10
<210>86<211>42<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人Ab 1-42<400>86Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>87<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人Ab1-6<400>87Asp Ala Glu Phe Arg His1 5<210>88<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人TNF 4-23<400>88Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15Pro Gln Ala Glu20<210>89<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠TNF 4-23
<400>89Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15His Gln Val Glu20<210>90<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠TNF 22-32<400>90Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg1 5 10<210>91<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人TNF 22-32<400>91Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg1 5 10<210>92<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205间隔区1<400>92Gly Ser Gly Gly1<210>93<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205间隔区2
<400>93Gly Ser Gly1<210>94<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205间隔区3<400>94Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ser Gly1 5<210>95<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205间隔区4<400>95Gly Ser Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser1 5 10<210>96<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>连接体1<400>96Cys Gly Gly1<210>97<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gamma连接体1<400>97Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10
<210>98<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N末端甘氨酸连接体<400>98Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210>99<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端甘氨酸丝氨酸连接体<400>99Cys Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>100<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GCGSGGGGS连接体<400>100Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>101<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端gamma 1连接体<400>101Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 10<210>102<211>18<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>C末端gamma连接体3<400>102Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210>103<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端甘氨酸连接体<400>103Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210>104<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端甘氨酸丝氨酸连接体<400>104Ser Gly Gly Gly Gly Cys1 5<210>105<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GSGGGGSGCG连接体<400>105Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210>106<211>6<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>甘氨酸赖氨酸连接体<400>106Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210>107<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甘氨酸赖氨酸连接体2<400>107Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210>108<211>14<212>PRT<213>人<400>108Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Val Ile His Asn1 5 10<210>109<211>10<212>PRT<213>人<400>109Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210>110<211>8<212>PRT<213>人<400>110Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5<210>111<211>11<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>CGGDRVYIHPF<400>111Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5 10<210>112<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGGDRVYIHPFHL<400>112Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210>113<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVYIHPFHLGGC<400>113Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Gly Gly Cys1 5 10<210>114<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRVYIHPFHL<400>114Cys Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210>115<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CHPFHL<400>115
Cys His Pro Phe His Leu1 5<210>116<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGPFHL<400>116Cys Gly Pro Phe His Leu1 5<210>117<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CYIHPF<400>117Cys Tyr Ile His Pro Phe1 5<210>118<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGIHPF<400>118Cys Gly Ile His Pro Phe1 5<210>119<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGGHPF<400>119Cys Gly Gly His Pro Phe1 5<210>120
<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVYIGGC<400>120Asp Arg Val Tyr Ile Gly Gly Cys1 5<210>121<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVYGGC<400>121Asp Arg Val Tyr Gly Gly Cys1 5<210>122<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVGGC<400>122Asp Arg Val Gly Gly Cys1 权利要求
1.一种组合物，包含(a)一种病毒样颗粒(VLP)，其包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述VLP具有至少一个第一附着位点，其中所述VLP是由宿主重组产生的，并且其中所述VLP包含的具有二级结构的所述宿主RNA的量最多为所述VLP原来所含的具有二级结构的宿主RNA的量的20％；(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原；其中所述至少一种抗原(b)与所述VLP(a)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
2.一种组合物，包含(a)一种病毒样颗粒(VLP)，其包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述VLP具有至少一个第一附着位点，其中所述VLP是由宿主重组产生的，并且所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原；其中所述至少一种抗原(b)与所述VLP(a)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
3.权利要求2或3的组合物，还包含与所述VLP结合的至少一种聚阴离子大分子，优选地所述聚阴离子大分子被包装在所述VLP内。
4.权利要求3的组合物，其中所述聚阴离子大分子的分子量为10,000到100,000道尔顿。
5.权利要求3或权利要求4的组合物，其中所述聚阴离子大分子选自(a)聚阴离子多肽；(b)聚阴离子糖；(c)聚阴离子有机聚合物；和(d)核酸，其中所述核酸不是toll-样受体配体。
6.权利要求5的组合物，其中所述核酸是tRNA。
7.权利要求5的组合物，其中所述聚阴离子多肽选自(a)聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d)(a)-(c)的任意化学修饰物。
8.权利要求3或4的组合物，其中所述聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，其中优选地所述聚阴离子大分子是聚谷氨酸。
9.权利要求5的组合物，其中所述聚阴离子糖选自(a)阴离子葡聚糖；(b)磷酸纤维素；(c)聚葡萄糖醛酸；(d)聚半乳糖醛酸；(e)聚唾液酸；(f)透明质酸；和(g)糖胺聚糖。
10.权利要求9的组合物，其中所述阴离子葡聚糖选自(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙基葡聚糖；(d)磺酸甲酯葡聚糖；和(e)磷酸葡聚糖。
11.权利要求9的组合物，其中所述糖胺聚糖选自(a)肝素；(b)硫酸乙酰肝素；(c)硫酸皮肤素；(d)硫酸软骨素；和(e)硫酸角质素。
12.权利要求5的组合物，其中所述聚阴离子有机聚合物选自(a)聚乙烯硫酸酯；和(b)聚丙烯酸酯。
13.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述RNA-噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(j)噬菌体f2；(k)噬菌体PP7；和(l)噬菌体AP205。
14.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述VLP包含RNA-噬菌体Qβ、fr、AP205或GA的外壳蛋白，和/或其突变体，和/或其片段。
15.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述第一附着位点与所述第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽共价键连接。
16.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述第一附着位点包含氨基，优选赖氨酸的氨基。
17.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述第二附着位点包含巯基，优选半胱氨酸的巯基。
18.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述第一附着位点包含赖氨酸的氨基，并且所述第二附着位点包含半胱氨酸的巯基。
19.前述权利要求中任意一项的组合物，还包含连接体。
20.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述至少一种抗原选自(a)多肽；(b)碳水化合物；(c)类固醇激素；(d)有机分子；和(e)半抗原。
21.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述至少一种抗原是自身抗原，或其片段，或其变体。
22.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述抗原选自(a)淋巴毒素(优选淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))；(b)淋巴毒素受体；(c)核因子kB配体的受体激活物(RANKL)；(d)血管内皮生长因子(VEGF)；(e)血管内皮生长因子受体(VEGF-R)；(f)白介素-5；(g)白介素-17；(h)白介素-13；(i)IL-23 p19；(j)生长素释放肽；(k)CCL21；(l)CXCL12；(m)SDF-1；(n)M-CSF；(o)MCP-1；(p)Endoglin；(q)GnRH；(r)TRH；(s)嗜酸细胞活化趋化因子；(t)缓激肽；(u)BLC；(v)肿瘤坏死因子α；(w)淀粉样β肽(Aβ1-42)；(x)Aβ1-6；(y)血管紧张肽；(z)胃泌素和/或前胃泌素；(aa)CETP；(bb)CCR5；(cc)C5a；(dd)CXCR4；(ee)Des-Arg-缓激肽；(ff)GnRH肽；(gg)血管紧张肽；(hh)TNF-肽；(ii)上述抗原(a)至(hh)的片段；和(jj)上述抗原(a)至(hh)的变体。
23.一种包含前述权利要求中任意一项的组合物的疫苗组合物。
24.权利要求23的疫苗组合物，其中所述疫苗不含佐剂。
25.权利要求23的疫苗组合物，还包含至少一种佐剂。
26.一种分别制备本发明的组合物和RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，包括以下步骤(a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白，其突变体或片段；(b)将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA-噬菌体的所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(d)将所述纯化的所述RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；和(e)将具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原与步骤(d)获得的所述VLP进行连接。
27.权利要求26的方法，其中所述纯化的外壳蛋白的所述重装配在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。
28.一种制备RNA-噬菌体的VLP-抗原偶联物的方法，包括以下步骤(a)由宿主重组产生一种病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含含有RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段和至少一种抗原的融合蛋白；(b)将所述VLP解装配为所述融合蛋白；(c)纯化所述融合蛋白；(d)将所述纯化的融合蛋白重装配为VLP，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。
29.权利要求28的方法，其中所述纯化的外壳蛋白的所述重装配在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。
30.权利要求28或权利要求29的方法，其中所述VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。
31.一种免疫方法，包括向动物或人施用权利要求23-25中任意一项的疫苗组合物。
32.权利要求1-22中任意一项的组合物或权利要求23-25中任意一项的疫苗组合物在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病优选地是炎性疾病和/或慢性自身免疫病。
33.一种治疗疾病的方法，包括向动物或人施用权利要求1-22中任意一项的组合物或权利要求23-25中任意一项的疫苗组合物，其中所述疾病优选地是炎性疾病和/或慢性自身免疫病。
34.一种药物组合物，含有(a)权利要求1-22中任意一项的组合物；和(b)一种可接受的药物载体。
35.一种可以通过权利要求26-30中任意一项的方法获得的组合物。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种包含RNA噬菌体的病毒样颗粒(VLP)和至少一种抗原的组合物，其中所述VLP是在宿主中重组产生的，并且其中所述VLP所包含的具有二级结构的宿主RNA的量最多为所述VLP原来所包含的具有二级结构的宿主RNA量的20％；并且其中所述VLP和至少一种抗原彼此连接。而且，本发明的组合物特别可用于有效诱导针对特定环境内的抗原的强抗体应答，同时降低或消除不希望的T细胞应答。
文档编号A61K39/39GK101052411SQ200580032183
公开日2007年10月10日 申请日期2005年10月5日 优先权日2004年10月5日
发明者M·巴克曼, P·毛雷尔, E·米杰林克, K·普罗巴, K·施瓦茨 申请人:赛托斯生物技术公司