专利名称：Sj16蛋白在制备免疫抑制药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种新型的免疫抑制药物。
背景技术：
免疫抑制剂(immunosuppressant，ISA)是一类具有免疫抑制作用的药物，主要功 能为抑制机体异常的免疫反应，从而达到治疗自身免疫性疾病，抗肿瘤，抗器官移植排斥等 目的。免疫抑制剂主要的作用机理是，通过抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等免 疫细胞)的增殖和功能，达到降低机体的免疫反应的目的。免疫抑制剂大致可分为四代。第 一代以肾上腺皮质激素、雷公藤多苷片、硫唑嘌呤和抗淋巴细胞球蛋白为代表；第二代以环 孢素和他克莫司为代表；第三代以单克隆抗体雷帕霉素(抗T淋巴细胞单克隆抗体)、霉酚 酸脂(MycophenolateMofetiLMMF)为代表；第四代以抗IL_2受体单克隆抗体为代表。但 以上的免疫抑制剂药物均有一定的毒性，增加宿主对感染和肿瘤的易感性；另外也无法抑 制慢性排斥反应，是移植器官难以在宿主体内长期稳定存活的主要原因。随着分子生物学和基因组学的发展，使从微生物病原体等生物资源中寻找研发有 别于现有免疫抑制剂机制的、低毒高效的原创性新的型免疫抑药物成为可能。特别是随着 对免疫逃避机制的研究深入，发现了一批与免疫逃避有关的免疫调节分子，与寄生虫主动 调节宿主的免疫应答相关，为从微生物病原体中寻求新的免疫抑制剂奠定了基础。众所周知，血吸虫是一种多细胞生物，它能在广泛分布免疫细胞的人体血液系 统中存活而不被功能完善的免疫系统清除，提示血吸虫在和人类长期共进化的过程中，可 以产生一些可调节宿主免疫应答功能的物质，下调宿主免疫反应，借以逃避宿主的免疫应 答。研究发现，当血吸虫尾蚴侵入宿主体内的过程中，在皮肤停留2-3d转化为童虫，在此过 程中血吸虫只引起轻微的炎症反应，而死的血吸虫尾蚴或皮内注射死虫的提取物却可以引 起强烈的炎症反应。这提示，活的血吸虫可能合成、分泌抑制炎症反应的物质，而这种物质 可能有抑制炎症反应的免疫调节功能。SJ16是从血吸虫的分泌物中寻找到一种分子量为 16. 8kDa的蛋白质。我们于1999年，克隆到SJ16的编码基因，并构建了重组表达体系，其纯 化表达产物rSjl6可降低和减轻角叉菜胶引起的实验动物皮肤足趾肿胀。同时rSjl6可引 起实验小鼠的腹腔毛细血管通透性增加，白细胞计数降低，及耳廓肿胀的缩小。这些研究提 示SJ16是具有确切抗炎作用的虫源性分子。但尚未有人对SJ16在免疫抑制作用方面进行 研究。
发明内容
本发明对SJ16在免疫抑制作用方面进行了研究。其目的在于提供一种低毒高效 的新型生物免疫抑制药物。具体的技术方案如下我们猜测SJ16参与了血吸虫的免疫逃避，SJ16作为抗炎分子，很可能具有抑制宿 主免疫应答的效应或作用。通过动物实验，证实了以上猜测，证明Sjl6具有良好的免疫抑制功能。进一步，我们对SJ16基因进行分析，目的在于找出Sjl6免疫抑制功能的活性片段 及其基因表达序列。通过对SJ16蛋白全长序列(SEQ ID NO 4)进行了分析，发现有2个核 定位序列肽段。分别将这两个核定位序列肽段去除，或同时去除，得到了三个不同的活性成 分片段。在本发明中，对这三个活性片段分别命名为SJ16-1、SJ16-2、SJ16-3(对应于SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 3 基因编码见序列表)。体外细胞实验表明，Sjl6及其活性成分片段或其任意组合物均具有抑制树突状细 胞的成熟、抑制T细胞增殖，下调IL-12等细胞因子的表达，抑制TH1和增强TH2的细胞免 疫应答的作用。可通过抑制淋巴细胞对组织，特别是对移植物的攻击，或抑制炎症细胞因子 的产生与其相关炎症反应；达到免疫抑制的目的。根据需要针对活性片段进行重组表达，得到一系列具有免疫抑制作用的重组表达 产物。通过实验证明，在重组蛋白中，与SJ16蛋白或其活性片段具有70%以上的同一性的 功能性变体或这些功能性变体的组合物都具有较好的免疫抑制作用，其中更优选的范围是 具有80%以上的同一性的功能性变体或这些功能性变体的组合物。在对上述SJ16蛋白及其活性片段进行重组多肽的研究结果也表明，含SJ16蛋白 活性氨基酸片段的数量为10以上的多肽的免疫抑制作用较好。在此研究的过程中，我们还提供了含有SJ16蛋白活性成分基因编码所述的融合 蛋白的多核苷酸及该多核苷酸序列相应的核酸构建体系、表达载体和宿主细胞。居于上述研究，我们将上述活性物质应用于制备免疫抑制药物。药物的必要组成 性多肽序列可以包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2或 SEQ ID NO :3序列或与上述蛋白具有70%以上同一性的功能性变体中的一种或几种。此类药物可应用于免疫相关性疾病，包括免疫移植反应、肿瘤、器官特异性自身免 疫病，系统性自身免疫病，如系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、强直性脊柱炎、硬皮病、结 节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病等。本发明可以用来制备注射用制剂、口服制剂或缓释制剂等各种适合免疫治疗的剂型。本发明与现有的免疫抑制药物相比，有以下明显的创新和优点第一，本发明首次提出将SJ16应用于制备免疫抑制药物。第二，本发明提供的免疫制药物来源于天然血吸虫蛋白，在长期与宿主的共进化 过程中发展出了一系列的免疫抑制和免疫逃避作用，通过免疫耐受机制及诱导，可以在很 大程度上避免现有的免疫抑制药物的毒副作用，具有低毒高效的特点，这是本发明的最大 优势所在。第三，本发明提供的疫抑制药物来源于病原体生物资源，具有极其广阔的市场空 间和较好的社会、经济效益。
具体实施方式
实施例1
根据日本血吸虫SJ16基因序列设计引物，经PCRDESIGN软件分析，由上海生工生 物工程公司合成，引物P1为5，GCCATATGAACATGACTTTAATTAAC，引入Ndel酶切位点；引物P2 为5，ACTTAATACTTTGTAGAATTCGAACC，引入Hindlll酶切位点。扩增出全长SJ16基因。实施例2SJ16全长的表达和鉴定及纯化利用所设计的一对引物(P1、P2)成功扩增。将其克隆到PGEX-4T-1载体上，挑 取筛选到的pGEX-4T-l-Sjl6-l重组质粒的DNA，以其为模板，用PI、P2引物进行PCR扩增 获取的特异性条带；双酶切验证其大小与预期序列一致；将所筛选的重组质粒送TaKaRa 公司测序，测序结果无误。获得的重组质粒确实为pGEX-4T-l-Sjl6-l重组质粒。将 PGEX-4T-1-SJ16-1重组质粒转化的工程菌经IPTG诱导表达后，15% SDS-PAGE电泳显示在 分子量约46kDa处出现一明显蛋白条带，而空质粒转化菌在诱导前后以及重组质粒工程菌 在诱导前后均无此条带的出现，表明此蛋白条带可能为目的蛋白条带。菌体裂解上清上亦 有此蛋白条带的出现，显示该蛋白为可溶性表达。将裂解上清经过GST亲和层析柱，经过 thrombin酶酶切以后，可以得到分子量为19kDa左右的单一蛋白。pGEX-4T BL21转化菌经诱导后出现一分子量约为26kDa明显表达带，此为GST蛋 白。pGEX-4T-l转化的BL 21-DE3菌经IPTG诱导后，较诱导前于约40Da出现一条明显的融 合蛋白表达条带。免疫印迹分析，该蛋白能特异地被抗GST抗体(1 500稀释)识别，于 约40Da位置有一条条带，pGEX24T-l转化菌经诱导于约26kDa处有一条条带为pGEX_4T_l 转化菌经诱导表达GST蛋白能特异地被抗GST抗体识别。GST柱亲和层析纯化。实施例3SJ16-1、SJ16-2、SJ16-3 的表达和鉴定根据SJ16-1的蛋白序列直接合成相应的DNA序列，命名为SJ16-1序列。根据 SJ16-2、SJ16-3之间引入柔性臂(-GGAGGA-)，使SJ16-2、SJ16-3融合；再根据其蛋白序列设 计相应的核酸序列。分别将其克隆到PGEX-4T-1载体上，挑取筛选到的pGEX-4T-l-Sjl6-l、 pGEX-4T-l-Sjl6-2、pGEX-4T-l-Sjl6_3重组质粒的DNA,以其为模板，用相应引物进 行PCR扩增获取的特异性条带；双酶切验证其大小与预期序列一致；将所筛选的重组 质粒送TaKaRa公司测序，测序结果无误。获得的重组质粒确实为pGEX_4T_ 1 _S j 16-1、 pGEX-4T-l-Sj 16-2-3 重组质粒。将 pGEX_4T-l-Sjl6-l、pGEX-4T-l_Sj 16-2-3 重组质粒转化 的工程菌经IPTG诱导表达后，15% SDS-PAGE电泳显示其分别在分子量约40kDa、84kDa处 出现一明显蛋白条带，而空质粒转化菌在诱导前后以及重组质粒工程菌在诱导前后均无此 条带的出现，表明此蛋白条带可能为目的蛋白条带。菌体裂解上清上亦有此蛋白条带的出 现，显示该蛋白为可溶性表达。将裂解上清经过GST亲和层析柱，经过thrombin酶酶切以 后，可以得到分子量为14kDa、36kDa左右的单一蛋白pGEX-4T-l转化的BL21-D E3菌经IPTG诱导后，较诱导前于约40kDa、84kDa出现 一条明显的融合蛋白表达条带。免疫印迹分析，该蛋白能特异地被抗GST抗体(1 500稀 释)识别，于约40kDa、84kDa位置有一条条带，pGEX24T 21转化菌经诱导于约26kDa处有 一条条带为PGEX-4T-1转化菌经诱导表达GST蛋白能特异地被抗GST抗体识别。
GST柱亲和层析纯化。实施例4内毒素测定通过利用鲎试剂法检测重组蛋白Sjl61mg/ml中的内毒素含量，并利用AffinityP akTMDetoxi-GelTMEndotoxin Removing Gel去除重组蛋白中的内毒素，并用鲎试剂法最后 检测内毒素含量，保证reSjl6的内毒素含量小于0. 2EU/Kg(0. 2内毒素含量每千克)。实施例5SJ16的抗炎作用不同剂量的Sjl6(l，5，10i!g/kg)均可以明显减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和毛 细血管通透性增加，抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀，明显抑制实验性腹膜炎小鼠腹腔毛 细血管通透性增高，且具有一定的剂量+赖关系(见表1)。表lreSjl6对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀作用和毛细血管通透性改变的影响
权利要求
1.SJ16蛋白在制备免疫治疗药物中的应用。
2.如权利要求1所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物的必要组成性多肽序列包 含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3序列 或与上述蛋白具有70%以上同一性的功能性变体中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的免疫治疗药物，其特征在于所述功能性变体的同一性为80% 以上。
4.如权利要求2所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物的必要组成性多肽包含权 利要求2所述的任一蛋白序列的数量为10以上。
5.如权利要求1所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物应用于制备免疫移植反应、 肿瘤、器官特异性自身免疫病或系统性自身免疫病的药物。
6.如权利要求1所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物制成适合免疫治疗的各种 剂型。
全文摘要
本发明公开了SJ16蛋白在制备免疫抑制药物中的应用方法。该药物的必要组成性多肽序列包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ IDNO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3序列或与上述蛋白具有70％以上同一性的功能性变体中的一种或几种。本发明是首次提出将SJ16应用于制备免疫抑制药物。该药物来源于病原体生物资源天然血吸虫蛋白，较之现有的同类药物具有低毒高效的优点，具有很好的社会和经济效益。
文档编号A61P37/06GK102000323SQ20101050176
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者刘灵辉, 卞国武, 吕志跃, 吴忠道, 孙希, 杨琳琳, 胡少敏, 阮志燕 申请人:中山大学