黄芪甲苷在制备药物中的应用的制作方法

专利名称：黄芪甲苷在制备药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芪甲苷的应用领域，特别是涉及在黄芪甲苷在加速皮肤再生和/或抑制疤痕形成的药物中的应用。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，它能使体内各种组织和器官免受物理性损伤、 机械性损伤、化学性损伤和生物性损伤的侵袭。皮肤的再生是指原来相对静止的各种细胞被激活，表型发生变化，如成纤维细胞经历增殖、迁移、产生细胞间质、转变为肌成纤维细胞或调亡诸阶段。皮肤的再生主要包括表皮层再生、真皮层再生及血管再生三方面。在正常情况下，表皮角质层细胞不断脱落，由基底细胞增殖补充，这是生理性再生。皮肤受到损伤后修复愈合，则称为补偿性再生，其再生过程和修复时间，取决于受伤的面积和深度，当皮肤损伤面积较小时，数天即能愈合，且不留瘢痕；当皮肤缺损较大较深时，由于皮肤对损伤过度的应激反应，会导致细胞的过度增生与细胞外基质的过度分泌，从而导致疤痕的形成。随着人类对皮肤再生机理的不断深入了解，促进皮肤再生已经成为皮肤修复与美容中重要导向，打破了传统的“受伤创面和手术切口愈合后必然产生疤痕”的陈旧观念，取而代之的是“陈旧性疤痕可以重新再生新的肌肤，并且没有皮肤色素差和痕迹的事实”。因此，寻找和开发能够促进皮肤再生，减少疤痕的药物及其制剂，实现对皮肤的非创伤性修复，对皮肤的再生与美容具有重要的应用价值，是医学界和美容界共同关注的话题。与皮肤创伤以后正常的愈合方式相比，皮肤再生过程中疤痕形成的特征显著减弱，胶原蛋白等细胞外基质过度分泌的现象明显减弱。为了实现皮肤的再生，减少疤痕的形成，核心的环节之一在于直接启动皮肤的再生潜能，在愈合初期迅速实现表皮组织的再上皮化，同时抑制纤维蛋白和胶原对新的受伤创面和手术切口的合成沉积，避免疤痕的产生及其后遗症。目前，被报道能直接促进皮肤再生，抑制疤痕形成的药物及其产品还很少，因此，亟需一种具有加速皮肤再生与抑制疤痕形成功效的药物来满足市场的需求。黄芪为植物和中药材的统称，始载于《神农本草经》，列为上品，有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌等功效。黄芪及其复方配伍可用于心脑血管疾病、急性肾小球肾炎、幽门螺旋杆菌阳性胃溃疡、重症肌无力、心律失常、银屑病、慢性肾病、糖尿病、肿瘤化疗放疗以及手术后的恢复、慢性鼻炎、骨质疏松、经久不愈的溃疡等疾病的治疗中。现代医学研究表明，黄芪至少有下面几个方面的生物医学功能(1)免疫调节作用；(2)改善心血管系统的机能；(3)延缓衰老作用；(4)抗疲劳作用；(5)作为传统中药的主要功效，有补气固表、 利尿脱毒、排浓和敛疮生肌的作用。植物化学成分研究表明黄芪中含有黄芪甲苷、氨基酸、 多糖、黄酮、生物碱、三萜皂苷、无机矿物质等多种化学成分。黄芪甲苷是从黄芪中获得的一种化合物，为中药黄芪的主要活性成分之一，分子式为C41H68O14,分子量784. 97，常温下为无色结晶，熔点为299 301°C，CAS号84687_43_4。
黄芪甲苷结构式如下
目前，黄芪甲苷已被报道具有增强免疫功能、抗氧化、抗衰老、强心、改善血液流变学等药理活性。许多药学研发人员都在进一步发掘其新用途，以充分利用黄芪的药用价值。 经过跟踪最新文献报道，未见黄芪甲苷在加速皮肤再生与抗疤痕方面的研究报道与治疗产品。

发明内容
本发明提供了一种黄芪甲苷在制备加速皮肤再生和/或抑制疤痕形成的药物中的应用，通过系统的体内外细胞与动物药理试验，发现黄芪甲苷能够有效加速皮肤的再生， 再通过其他的系统的体内外细胞与动物药理试验，又发现黄芪甲苷能够有效抑制疤痕的形成。本发明还提供了一种黄芪甲苷在制备增强再生皮肤力学强度的药物中的应用。本发明中所用黄芪甲苷采用市售产品，购于中国药品生物制品检定所，纯度(质量分数)> 99.9%。所述的黄芪甲苷在制备加速皮肤再生的药物中的应用。所述的黄芪甲苷在促进表皮层再生、促进真皮层再生和/或促进血管再生的药物中的应用。所述的黄芪甲苷在促进表皮层再生的药物中的应用。促进表皮层再生主要是通过促进皮肤角朊细胞增殖与迁移的作用来实现的。皮肤从里到外主要分为三层，分别为皮下组织、真皮层、表皮层。表皮层是皮肤的最外层，由两类细胞组成一类是角朊细胞，占表皮细胞的绝大多数，它们在分化中能合成大量角蛋白，使细胞角化并脱落；另一类细胞为非角蛋白形成细胞，数量少，分散存在于角蛋白形成细胞之间，包括黑(色)素细胞、郎格汉斯细胞和梅克尔细胞，它们各有特别的功能，但与表皮角化无直接关系。创面愈合过程中，角朊细胞迁移、增殖和分化形成新的表皮层是覆盖创面的必须过程之一，也是创面愈合的重要标志。因此，角朊细胞的增殖迁移试验，成为体外模拟表皮层新生的重要模型，被广泛地用于表征药物促进表皮新生的能力。所述的黄芪甲苷在促进真皮层再生的药物中的应用。促进真皮层再生主要是通过促进皮肤成纤维细胞增殖与迁移的作用来实现的。表皮下层，占有大部分结构的是真皮层，厚度为2公厘左右，又可分为三层，即乳头层、乳头下层及网状层。正常真皮中含有成纤维细胞，肥大细胞，组织细胞，淋巴细胞及少量真树皮突状细胞，噬黑素细胞，朗格汉斯细胞等。成纤维细胞能分泌产生胶原纤维，弹力纤维，网状纤维和基质；同时在皮肤组织深层损伤后是主要的组织修复细胞。因此，成纤维细胞的增殖与迁移试验成为体外模拟真皮层修复与再生以及衡量药物加速真皮修复与再生的重要技术手段。所述的黄芪甲苷在促进血管再生的药物中的应用。创伤修复大致分为局部炎症反应、细胞增殖分化和组织修复重建3个阶段。皮肤创口愈合是一个复杂的生物学过程，通常是由成纤维细胞增殖分化、新生血管生成、细胞外基质纤维化和表皮细胞增生覆盖创面等综合作用的结果。有效的创伤修复需要在新形成的肉芽组织中生成丰富的新生血管，以维持创伤区域的营养供给及细胞外基质的沉积。因此，血管再生在皮肤损伤愈合过程中发挥着非常重要的作用。所述的黄芪甲苷在制备抑制疤痕形成的药物中的应用。所述的黄芪甲苷在制备抑制皮肤成纤维细胞分泌转化生长因子β 1 (TGF-β 1)的药物中的应用。疤痕修复是组织损伤的必然结果，主要的过程包括成纤维细胞的趋化移动、 增殖、分化、细胞外基质和胶原的分泌等。在此过程中，细胞因子发挥着重要的作用，在已知的细胞因子中，TGF-β在疤痕形成和增生中发挥着极其重要的作用，被公认为疤痕形成和发展的启动枢纽，是与疤痕增生关系最密切的细胞因子。TGF-β可分为五种TGF-βΙ、 TGF-β 2, TGF-β 3, TGF-β 4 禾口 TGF—β 5，在喃乳动物中有 3 种形式=TGF-β 1、TGF-β 2 禾口 TGF-β 3。TGF-β 1存在于上皮细胞、造血细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞中；TGF-β 2存在于上皮细胞、神经元中；TGF-β 3存在于间叶细胞中。不同的TGF-β作用各有不同，TGF-β 1 能促进多种细胞分化增殖，趋化细胞的迁移，诱导纤维连接蛋白的产生，在瘢痕增生过程中起重要作用；TGF-β 2在渐进性系统性硬皮病的发病过程中起主要作用；TGF-i3 3在抑制角化细胞DNA合成上表现出更大活性。所述的黄芪甲苷在制备抑制皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的药物中的应用。更进一步，所述的黄芪甲苷在制备抑制皮肤成纤维细胞分泌I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例的药物中的应用。胶原是体内含量最多、分布最广的蛋白，依照不同的单链组合形成多种胶原纤维亚型，胶原蛋白是真皮层的主要成分之一，以I型和III型为主。主要由成纤维细胞合成。胶原蛋白除了具有生理支撑作用外，还可调节细胞的迁移、增殖、特异性基因表达，是细胞外基质中最活跃的成分之一，对创面愈合过程中疤痕的形成具有重要的影响。近几年，越来越多的文献报道，皮肤疤痕组织中I型胶原蛋白/III型胶原蛋白的比例远远大于其在正常组织中的比例，所以I型胶原蛋白/III型胶原蛋白的比例的考察是微观解析疤痕是否形成的有效工具之一。由于胶原蛋白α-链的螺旋方向相反，排列又是首尾相接、平行聚合，故具有一定的双折射现象。近年来，苦味酸-天狼星红染色法也因此被应用用于观察测量皮肤中I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例。皮肤组织经苦味酸天狼猩红染色后， 在偏光显微镜镜下观察。胶原纤维(胶原纤维主要含有胶原蛋白)有正单轴双折射光的属性，I型胶原纤维光谱峰值550nm，用500nm的滤光片时I型胶原呈黄、红色纤维，III型胶原纤维光谱峰值为700nm，用700nm的滤光片时III型胶原纤维呈绿色，从而可以区分两种蛋白亚型的分布、排列等情况。与正常皮肤对比，可进一步解析皮肤疤痕组织的形成情况。一种黄芪甲苷在制备增强再生皮肤力学强度的药物中的应用。黄芪甲苷可以增加创伤部位的皮肤张力，使皮肤的力学强度趋于正常的组织。所述的药物以黄芪甲苷为活性成分，加入药用辅料制成制剂。制剂的形式可以为凝胶、乳剂、贴片等形式。
本发明具有如下优点本发明根据皮肤再生的机理，系统地设计了体内外试验，对黄芪甲苷促进皮肤再生与抑制疤痕形成的作用进行了全面、科学的评价，包括证明了黄芪甲苷体内外促进皮肤表皮层、真皮层、局部微血管再生以及抑制TGF-β 1过度分泌的作用。本发明在设计上科学严谨、方法上合理实用，得到的实验结果系统全面。其结果将为黄芪甲苷开发成新型皮肤再生促进剂提供重要的科学依据和有力的支持。本发明发现了黄芪甲苷在促进皮肤再生与疤痕抑制方面的新功效，使得受伤创面能在较短的时间内修复并且较大程度减少了疤痕的产生，能最大限度的满足患者希望伤口快速愈合并且尽量不留下疤痕的愿景，具有很好的应用前景。本发明黄芪甲苷作为唯一活性成分，加入药用辅料制成制剂，其制剂能够显著地促进皮肤再生和抑制疤痕形成，具有很好的应用前景和广阔的市场需求。


图1为实施例1中不同浓度的黄芪甲苷溶液对于皮肤角朊细胞增殖迁移的影响试验结果图；图2为实施例2中不同浓度的黄芪甲苷溶液对于皮肤成纤维细胞增殖迁移的影响试验结果图；图3为实施例3中不同浓度的黄芪甲苷溶液对成纤维细胞的生长的影响的参考图；图4为实施例3中不同浓度的黄芪甲苷溶液对抑制成纤维细胞分泌TGF-β 1的效果对比图；图5为实施例4第30天的黄芪甲苷溶液组和空白对照组的大鼠伤口愈合效果图， 其中，左边三只为黄芪甲苷溶液组，右边三只为空白对照组；图6为实施例4的30天内黄芪甲苷溶液组和空白对照组的大鼠创面皮肤新生(再生)率的变化图；图7为实施例5的第30天的黄芪甲苷溶液组、空白对照组和正常皮肤组的大鼠创面新生皮肤与大鼠正常皮肤的生物力学强度对比图；图8为实施例6的第30天的黄芪甲苷溶液组、空白对照组和正常皮肤组的大鼠创面新生皮肤与大鼠正常皮肤的解剖镜下的显微观察图，其中，8a为正常皮肤组，8b为空白对照组，8c为黄芪甲苷溶液组；图9为实施例7的第30天的黄芪甲苷溶液组、空白对照组和正常皮肤组的大鼠创面新生皮肤与大鼠正常皮肤的马森三色组织染色图；图10为实施例8的第30天的黄芪甲苷溶液组和空白对照组的大鼠皮肤创面愈合后疤痕形成情况对比图，其中，左为空白对照组，右为黄芪甲苷溶液组；图11为实施例8中空白对照组、黄芪甲苷溶液组和正常皮肤组的大鼠创面新生皮肤与大鼠正常皮肤的苦味酸-天狼星红组织染色图；图12为实施例9的空白对照组和黄芪甲苷凝胶组的大鼠创面皮肤新生(再生) 率的变化图；图13为实施例9中空白对照组、黄芪甲苷凝胶组和正常皮肤组中的大鼠创面新生皮肤与大鼠正常皮肤的生物力学强度对比图；图14为实施例9中空白对照组、黄芪甲苷凝胶组和正常皮肤组中的大鼠创面新生皮肤与大鼠正常皮肤的马森三色组织染色图。
具体实施例方式实施例1 皮肤角朊细胞划伤实验(l)24-well wound healing assay (伤口愈合试验试剂盒，Cell Biolabs，INC)在室温下预热10分钟；(2)在无菌条件下将插件放入M孔板中；(3)将皮肤角朊细胞(购于ATCC，上海分公司)以4X IO5个/孔的密度接种于M 孔板中，每孔0. 5ml (从插件的两侧加入细胞悬液，每边250 μ L)，用含10 % (质量百分浓度)灭活胎牛血清的DMEM高糖培养液(均购自于Gibico，Brl, USA)培养，培养的时间为 13h ；(4)小心移掉M孔板中的插件，避免插件的移行而造成创伤区域的不规则；(5)弃去之前的培养液，用PBS (磷酸缓冲液，pH = 7. 3)洗去死亡细胞，加入含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液(黄芪甲苷购于中国药品生物制品检定所，纯度(质量百分数) > 99. 9% )(黄芪甲苷的浓度分别为 5(^11101/1、10(^11101/1、15(^11101/1)，每孔0· 5ml，每个浓度重复三个孔，作为黄芪甲苷溶液组，同时设定空白对照组(每孔加0. 5mL的DMEM高糖培养液)，空白对照组也同样重复三个孔；(6)各图片中，用实线标明了各划伤区域的边缘，以便于形象直观地观察实验结果，分析创伤区域面积的变化情况，A I组分别是不同组不同时间下的创伤愈合的情况， 具体详见图1，黄芪甲苷的浓度分别为50 μ mol/L、100 μ mol/L、150 μ mol/L的Oh伤口面积同图1中A图。A 空白对照组，OhB:空白对照组，48hC :50 μ mol/L黄芪甲苷溶液组，48hD :100 μ mol/L黄芪甲苷溶液组，48hE :150 μ mol/L黄芪甲苷溶液组，48hF:空白对照组，96hG :50 μ mol/L黄芪甲苷溶液组，96hH :100 μ mol/L黄芪甲苷溶液组，96hI :150 μ mol/L黄芪甲苷溶液组，96h如图1所示，在48h，黄芪甲苷溶液组C、D、E相比于空白对照组B，在96h，黄芪甲苷溶液组G、H、I相比于空白对照组F，皮肤角朊细胞的增殖迁移的速度均有显著的提高(细胞划伤区域面积显著减小)，在0 150 μ mol/L浓度范围内，药物效应与浓度之间呈现量效关系，证明黄芪甲苷可以促进人皮肤角朊细胞的增殖迁移能力，加速上皮化过程。实施例1 体外证实了黄芪甲苷具有促进皮肤角朊细胞增殖与迁移的作用，表明其促进皮肤表皮层再生的能力。实施例2 皮肤成纤维细胞划伤实验
细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用细胞刮在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。是体外衡量细胞迁移的又一经典模型。(1)在M孔细胞培养板每孔外底壁中央垂直划一条直径线。(2)取生长良好的皮肤成纤维细胞(成纤维细胞株购自ATCC，上海分公司)，以IO5 个/孔的密度接种于已经标记好的M孔板中，用含10%灭活胎牛血清的DMEM高糖培养液培养。(3)待细胞贴壁融合后，沿板外的直径线用200 μ 1的黄色枪头在孔内进行细胞损伤，用磷酸缓冲液PBS (pH = 7. 3)轻轻润洗划痕区域，以除掉划掉的细胞。(4)用RPMI-1640培养液(Invitrogen Life Science)稀释黄芪甲苷，得到含有黄芪甲苷的培养液(黄芪甲苷的浓度分别为12. 5 μ mol/L, 25 μ mol/L, 50 μ mol/L, 100 μ mol/ L)，加入到M孔板中，每孔0. 5mL，每个浓度重复三个孔，作为黄芪甲苷溶液组，同时设定空白对照组(每孔加0. 5ml RPMI-1640培养液)，空白对照组同样重复三个孔。(5)于M小时、72小时后拍照，观察药物对创伤愈合的影响情况，A K组分别为不同组不同时间下药物对创伤愈合的影响的情况，具体详见附图2，黄芪甲苷的浓度分别为 12. 5 μ mol/L、25 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L 的 Oh 创伤愈合情况与图 2 中 A 基本相同。A 空白对照组，Oh;B:空白对照组，24h;C :12. 5 μ mol/L 黄芪甲苷溶液组，24h ；D :25μπι01/1 黄芪甲苷溶液组，24h ；E :50ymol/L黄芪甲苷溶液组，24h ；F :100 μ mol/L 黄芪甲苷溶液组，24h ；G:空白对照组，72h;H :12. 5 μ mol/L 黄芪甲苷溶液组，72h ；I :25μπι01/1 黄芪甲苷溶液组，72h ；了5(^11101/1黄芪甲苷溶液组，7211;K :100 μ mol/L 黄芪甲苷溶液组，72h。如图2所示，在Mh，黄芪甲苷溶液组C、D、E、F相比于空白对照组B，在72h，黄芪甲苷溶液组H、I、J、K相比于空白对照组G，皮肤成纤维细胞增殖迁移的速度有了明显的提高(细胞划痕区域面积显著减小)，在0 100 μ mol/L浓度范围内，药物效应与浓度之间呈现量效关系。证明了黄芪甲苷可以显著增强皮肤角朊细胞的增殖迁移能力，效果显著。实施例2的实验结果证实了黄芪甲苷具有促进成纤维细胞增殖与迁移的作用，从而初步证实了黄芪甲苷促进皮肤真皮层新生(即再生)的能力。实施例3 皮肤成纤维细胞抑制分泌TGF- β 1的能力试验在测试黄芪甲苷对成纤维细胞分泌TGF-β 1影响的作用之前，首先，用MTT试验考察了黄芪甲苷对成纤维细胞是否存在细胞生长抑制作用。实验步骤将成纤维细胞以相同的剂量接种到96孔板上，0. ImL/孔，每孔细胞接种浓度为IXlO4个/mL。在培养箱中孵育M小时，待细胞贴壁后，加入用RPMI-1640 培养液稀释成不同浓度的黄芪甲苷，0、12. 5ymol/L、25ymol/L、50ymol/L、100ymol/L、200 μ mol/L共计6个浓度梯度，每个浓度设3个平行孔(即每个浓度重复3个孔)，再孵育 M小时。将MTT (四甲基偶氮唑，华美生物工程公司)溶解在PBS (pH= 7. 3)中，使其浓度为5mg/mL，过滤除菌后4°C避光保存。测定时先将上述培养板的原培养液弃去，每孔加入 200 μ 1无血清的RPMI-1640培养液，使每100 μ 1培养液中含MTT 10 μ 1，将培养板放入培养箱中继续培养4 6小时。然后每孔加入100 μ 1 二甲基亚砜(DMSO)中止反应，将培养板放在振荡器上充分混勻，用MTT酶标仪测定570nm波长下时每孔的OD值。细胞生长百分率(％ )=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值X 100%，其结果如图3所示(其中，与黄芪甲苷浓度为0的实验组相比，*P < 0. 05)。如图3所示，黄芪甲苷在(0 200ymOl/L)浓度范围内对成纤维细胞的生长没有任何抑制作用(即无细胞毒性)。在考察了高浓度黄芪甲苷对成纤维细胞的生长的影响之后，进一步研究了黄芪甲苷对成纤维细胞分泌TGF-β 1的影响。实验步骤如下(1)取对数生长期的成纤维细胞(人皮肤成纤维细胞株购自ATCC，上海分公司)， 胰酶消化1分钟，细胞计数，调整细胞的浓度为IO5个/孔，接种于M孔板中，于细胞培养箱中贴壁过夜，培养的时间为15h。( 用RPMI-1640培养液稀释黄芪甲苷，得到含有黄芪甲苷(黄芪甲苷的浓度分别为 12. 5 μ mol/L, 25 μ mol/L, 50 μ mol/L, 100 μ mol/L)加入到 24 孔板中，每孔 0. 5mL,每个浓度重复三个孔，同时设定阴性对照组，黄芪甲苷的浓度为0(每孔加0. 5mL培养液)，阴性对照组同样重复三个孔。(3)于48小时各取200 μ 1的细胞上清液，IOOOrpm离心5min，测定上清液中 TGF-β 1 含量。(4) TGF- β IELISA抗体测定具体操作步骤a.将TGF- β 1 一抗(Santa Cruz公司)(1 1000稀释)溶解在质量百分数为4% 的多聚甲醛溶液(上海肯强贸易有限公司供应)中，以50ul/孔铺在ELISA板后用宽透明胶密封ELISA板，于4°C过夜，培养的时间为15h ；b.先将固相化液除去，用PH为7. 4的TTBS缓冲液(在2. 5升TBS溶液中溶解 1. 25g聚山梨醇酯20，TBS溶液购于上海迪申生物技术有限公司，聚山梨醇酯20购于上海广赞化工科技有限公司)洗涤三次后，加入质量百分数为5%的BSA封闭液(广州展晨生物科技有限公司)300ul/孔，37°C孵育2小时；c.将样品以50 μ 1/孔加入ELISA板(无需稀释)，同时设定空白对照和标准品组别(标准品的浓度为 0，15. 6，31.2，62. 5，125，250，500pg/ml)；d.室温孵育池，倒掉液体后用TTBS缓冲液洗涤5次，每次洗涤时每孔加液均不少于 300 μ 1 ；e.准备磷酸缓冲液PBS (pH = 7. 3)与不含NaR封闭液(质量百分数为0. 05%的叠氮钠水溶液)的1 1稀释液，用该稀释液以(1 20000)稀释HRP (辣根过氧化物酶)， 标记抗体(取0. 5ul HRP标记抗体，用IOml的上述稀释液稀释，得到HRP稀释液，每孔加入 HRP稀释液50 μ 1)；f.室温孵育池，用TTBS缓冲液洗涤5次，每次洗涤时每孔加液均不少于300 μ 1，最后用蒸馏水洗净两次；g.每孔加入HRP基质液100 μ L，HRP基质液由IOOuL TMB基质溶液(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，浓度 13mg/ml)、5 μ L H2O2 禾口 IOml PH 为 5. 5 的 ABS 缓冲液(9. Oml 0. 2mol/L 醋酸钠溶液与1. Oml 0. 2mol/L醋酸溶液混和即可)配成，在室温下避光反应至出现适当的发光现象(大约15 30min)；h.加入50 μ 1/孔的浓度为lmol/L H2SO4终止反应，迅速在570nm波长下测定OD 吸光值，同时测定c步骤中所配标准品的OD吸光值，利用标准品浓度的OD值建立标准曲线，并计算样品中TGF-β 1的含量。在黄芪甲苷的浓度分别为0，12. 5 μ mol/L, 25 μ mol/L, 50 μ mol/L, 100 μ mol/L,实验组在4 小时测定上清液中TGF-β 1含量，TGF-β 1含量如图4所示(其中，和黄芪甲苷的浓度为0的试验组相比，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01)。如图4所示，黄芪甲苷的浓度分别为12. 5 μ mol/L, 25 μ mol/L, 50 μ mol/L, 100 μ mol/L实验组相比于黄芪甲苷的浓度为0的阴性对照组，黄芪甲苷对成纤维细胞分泌TGF-βΙ具有明显的抑制作用，随着黄芪甲苷的浓度的升高，抑制作用越来越强，在0 100 μ mol/L浓度范围内，药物效应与浓度之间呈现量效关系。实施例3证明了黄芪甲苷作用的皮肤成纤维细胞分泌TGF-β 1蛋白明显减少。结合前面的实验结果，一方面黄芪甲苷对成纤维细胞的增殖和迁移具有显著的促进作用，另一方面成纤维细胞对TGF-β 1的合成具有明显的抑制作用，而这种抑制作用与细胞毒性无关(MTT实验结果证明黄芪甲苷在0 200 μ mol/L对成纤维细胞的生长有一定的促进作用，无细胞毒性)。实施例4 动物创面皮肤新生试验(1)清洁级8周龄SD雌性大鼠6只，体重180g左右。分成黄芪甲苷溶液组和空白对照组两组，每组3只，其中，黄芪甲苷溶液组是每天给雌性大鼠给予黄芪甲苷药剂，给药量相对于大鼠体重的0.5%，空白对照组不给药。将动物用异戊巴比妥钠麻醉(6毫克/100 克)，剪去背部毛发，用电动游标卡尺量出2cmX2cm的面积，用记号笔标记好该面积。用剪刀剪出2cmX2cm的面积，用碘酒进行消毒。(2)在创伤的半个小时后进行第一次给药，黄芪甲苷X组以后每天给一次药，空白对照组不做处理。观察创伤的愈合情况和疤痕的形成情况，每3天进行一次拍照，实验周期为30天。采用游标卡尺定期测量新生皮肤的面积。图5为第30天的黄芪甲苷溶液组和空白对照组的伤口愈合效果图(左边三只为黄芪甲苷溶液组，右边三只空白对照组)，图6为 30天内黄芪甲苷溶液组和空白对照组的大鼠创面皮肤新生(再生)率的变化图，其中，和空白对照组相比，**P < 0. 01，*P < 0. 05。如图5和图6所示，黄芪甲苷溶液组中大鼠的创伤的愈合率明显要高于空白对照组，新生皮肤的面积明显增加(两组的差异极显著)。实施例5 创面皮肤生物力学强度试验采用张力测定仪，对实施例4中的空白对照组和黄芪甲苷溶液组的大鼠 (100 μ mol/L)，测定第30天新生皮肤的生物力学强度，张力测定仪上测试新生皮肤的张力，取健康的皮肤作为阳性对照，作为正常皮肤组，牵拉皮肤组织的速度为25mm/min。具体力学数据详见图7 (其中，和空白对照组相比，**P < 0. 01)。
如图7所示，黄芪甲苷可以增加创伤部位的皮肤张力，使皮肤的力学强度趋于正常的组织。实施例6 动物创面血管新生试验于第30天，取健康的皮肤作为阳性对照，作为正常皮肤组，于解剖镜下观察正常皮肤组、实施例4中的空白对照组和实施例4中的黄芪甲苷溶液组(ΙΟΟμπιοΙ/L)的血管情况，正常皮肤组的血管情况和创面新生皮肤所含新生血管情况如图8所示，其中，图8a为正常皮肤组，图8b为黄芪甲苷溶液组，图8c为空白对照皮肤组。如图8所示，SD大鼠背部正常皮肤中拥有较多的血管，空白对照组的创伤部位几乎无血管生成，黄芪甲苷溶液组(ΙΟΟμπιοΙ/L)的创伤部位有少量的血管生成，相比于自然愈合的创伤口，使用黄芪甲苷能使创伤口局部微血管再生，表明黄芪甲苷不仅能促进皮肤的增生、抑制疤痕的形成，还能促进皮肤缺损局部血管的新生，使新生的皮肤趋于正常的皮肤结构，证明了黄芪甲苷促进创伤局部血管新生的作用。实施例7 动物创面新生皮肤组织染色试验I于第30天，取实施例4中空白对照组和实施例4中黄芪甲苷溶液组(ΙΟΟμπιοΙ/L) 的创面新生皮肤及正常皮肤进行组织切片染色，具体实施内容包括(1)取材全皮摘除，面积2cmX2cm，去除皮下脂肪，得到空白对照组、黄芪甲苷溶液组和正常皮肤组的皮肤组织。(2)固定将步骤(1)中空白对照组、黄芪甲苷溶液组、正常皮肤组的皮肤组织于质量百分数为4%的多聚甲醛溶液中固定Mh，固定液的体积是皮肤体积的15倍，固定过程在4摄氏度冰箱中进行。(3)水洗将固定后的空白对照组、黄芪甲苷溶液组、正常皮肤组的皮肤组织投入 PBS缓冲液(pH=7.3)中，每10分钟更新洗涤液一次，累计1小时。(4)脱水(质量百分数为0-95%乙醇脱水1-10小时)具体值如下70%乙醇，6 8小时，85%乙醇，3小时，95%乙醇，1小时，95%乙醇，1小时，100% 乙醇，1 小时，100% 乙醇，1 小时；(5)透明化把乙醇脱水后的空白对照组、黄芪甲苷溶液组、正常皮肤组的皮肤组织用吸水纸吸干表面水分后投入到由无水乙醇和二甲苯1 1(体积比)混合组成的混合液中透明2min，然后放置到二甲苯中浸泡两次，每次1小时。(6)浸腊、包埋液体石蜡(55°C )中浸渍1个小时，再放入液体石蜡(60°C )中浸渍3个小时，包埋；(7)切片切片厚度为5μπι，得到石蜡切片；(8)染色(步骤如下)a.石蜡切片置于二甲苯中浸泡两次，每次5分钟。再置于无水乙醇中浸泡2次，每次3分钟。再置于95%、85%、75%乙醇各；31^11;自来水洗，蒸馏水洗，然后转移到质量百分数为0. 的甲苯胺蓝溶液(阿拉丁公司)；b.在苏木精-三氯化铁混合液(苏木精lg，溶于IOOml 95%乙醇，记为储备液A ； 三氯化铁溶液細1，双蒸水95ml，盐酸lml，记为储备液B ;A和B各一半混合)(苏木精
购自Sigma公司，三氯化铁购自国药集团)中染色IOmin ；c.双蒸水冲洗IOmin ；d.质量百分数为的比布列西猩红-质量百分数为的酸性品红混合液(体积比9 1)(上海杰星生物科技有限公司)中染色15min;e.蒸馏水洗；f.在磷钼酸磷钨酸混合液(质量百分数为5%的磷钼酸和质量百分数为的5%磷钨酸以体积比为1 1混合)(磷钨酸和磷钼酸购自阿拉丁公司)中区分15min或者直至胶原不再显红色；g.直接转移到质量百分数为2. 5%的苯胺蓝溶液中，染色8min，在水中简单水洗， 在质量百分数为冰醋酸溶液中区分5min ；h.水洗，吸干水分；i.依次脱水(95%乙醇，100%乙醇，二甲苯各两次脱水，每次2min)，中性树脂封片；1.拍照，结果如图9所示，其中，空白对照组，I :10X，黄芪甲苷溶液组，II :10X;正常皮肤组，III :10X(10X代表10倍目镜)。如图9所示，组织切片马森三色染色图可以看出图9中黄芪甲苷溶液组II相比于空白对照组I，更接近于正常皮肤组III，表明黄芪甲苷溶液组的皮肤恢复的状况较好， 再生皮肤的结构趋于正常组织，表皮真皮层分界明显，真皮层内含有较多的血管开口，证明了黄芪甲苷能够有效地促进皮肤新生。而空白对照组I的皮肤表皮显著增厚，没有明显的血管生成。实施例7再次证明了黄芪甲苷能够有效地促进具有完整组织结构的皮肤的新生。实施例8 黄芪甲苷对动物创面疤痕形成的影响于第30天，观察实施例4中空白对照组和实施例4中黄芪甲苷溶液组(ΙΟΟμπιοΙ/ L)的创面疤痕形成情况，如图10所示(左空白对照组；右黄芪甲苷溶液组)。如图10所示，结合前面的实验结果，黄芪甲苷在显著促进皮肤新生的同时，具有抑制疤痕形成的作用。实施例9 动物创面新生皮肤组织染色试验II(1)石蜡切片步骤同实施例7中步骤(1) (7)；(2)染色苦味酸天狼星红溶液中染色lh(苦味酸-天狼星红染液购自北京中山生物技术有限公司)，自然水冲洗5min。再浸泡于Harris’ s苏木染色液(上海运势佳医疗器械有限公司)中染色5min;依次脱水(50%，75%，95%乙醇，100%乙醇脱水，每次 aiiin)，用二甲苯透明，中性树脂封片；BH-2型偏光显微镜(日本OLYMPUS公司)下观察切片，切片如图U。如图11所示黄芪甲苷抑制疤痕形成的作用被证明与其抑制胶原蛋白I型/胶原蛋白III型的比例有关。其中，A、B、C分别对应空白对照组、黄芪甲苷溶液组和正常皮肤组。从图11中可以看出，空白对照组皮肤中的胶原几乎都是I型胶原蛋白，I型胶原蛋白/III型胶原蛋白的比例很高。黄芪甲苷溶液组的皮肤中有一定量的III型胶原蛋白，其I 型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例和正常组的皮肤接近，从而进一步说明了黄芪甲苷溶液对疤痕形成显著的抑制作用与其调节不同胶原蛋白亚型的分泌有关。实施例10黄芪甲苷凝胶促进大鼠创面皮肤新生的试验1.凝胶的制备分别用20mL蒸馏水溶胀0. 3g明胶和用30mL蒸馏水溶胀1. 5g海藻酸钠。放入 60°C水浴中，使明胶和海藻酸钠充分溶胀后，用玻棒搅拌使充分溶解，将明胶溶液和海藻酸钠溶液充分混溶，水浴2小时，得到凝胶基质。取凝胶基质25g，载入黄芪甲苷12. 5mg，得黄芪甲苷凝胶。2.动物实验清洁级6周龄SD雌性大鼠16只，体重150 170克之间。分成2组。4个组分别是黄芪甲苷凝胶组(给药量相对于大鼠体重的0.5%) 10只和空白对照组6只。将动物用异戊巴比妥钠麻醉(6mg/BW)，剪去背部毛发，制备IcmX Icm的全层皮肤缺损创面，用碘酒进行消毒。在创伤的半个小时后进行第一次给药，以后每天给一次药，空白组给予生理盐水。观察创伤的愈合情况和疤痕的形成情况。3.创面皮肤新生率的测定，实验步骤同实施例4采用游标卡尺每天对空白对照组和黄芪甲苷凝胶组的大鼠创面测量新生皮肤的面积，测得的结果如图12所示，创面愈合率即创面皮肤新生率(和空白对照组相比，*P < 0. 05，< 0. 01)。如图12所示，黄芪甲苷凝胶组与空白对照组相比，存在显著性差异，黄芪甲苷凝胶组中的创面愈合率要远高于空白对照组，表明黄芪甲苷凝胶制剂可以显著促进大鼠的伤口愈合。4.创面皮肤生物力学强度试验，实验步骤同实施例5对空白对照组、黄氏甲苷凝胶组和正常皮肤组，测定第14天新生皮肤的生物力学强度，张力测定仪上测试新生皮肤的张力，取健康的皮肤作为阳性对照，牵拉皮肤组织的速度为25mm/min。具体力学数据详见图13 (其中，和空白对照组相比，**P < 0.01)。如图13所示，黄芪甲苷凝胶组相比于空白对照组，创伤皮肤生物力学强度有了明显地提高，更加接近于正常皮肤组，可见，黄芪甲苷凝胶具有加强创伤皮肤生物力学强度的趋势，使新生皮肤的生物力学强度趋于正常皮肤。5.马森三色染色，实验步骤参照实施例7在创伤7天时，伤口没有完全愈合，修复最好的黄芪甲苷凝胶制剂组的修复率约为80 %，对空白对照组、黄芪甲苷凝胶组和正常皮肤组的皮肤组织进行马森三色染色试验 (实验步骤参照实施例7)，结果如图14所示，其中，1 为空白对照组，14b为黄氏甲苷凝胶组，14c为正常皮肤组。如图14所示，除正常皮肤组以外的各组皮肤只有很少的胶原生成，呈现了明显的创伤皮肤特征。但是，黄芪甲苷凝胶组皮肤的真皮部位有少量胶原和皮肤附属器生成，胶原排列整齐，表明其具有促进完整皮肤新生的作用，新生皮肤的结构趋于正常皮肤组织。综上实施例1 14所述，本发明通过利用体外皮肤角朊细胞、皮肤成纤维细胞增殖和迁移实验模型、TGF-β 1分泌实验、大鼠全层皮肤缺损模型，利用创伤愈合试验试剂盒、 细胞划伤试验、显微观察、组织染色等多种试验测定方法，首次发现并系统地证明了黄芪甲苷溶液，黄芪甲苷凝胶制剂体内外促进表皮新生、真皮新生、血管新生和抑制疤痕形成的双重功效。皮肤创伤与皮肤美容是临床探索的热点问题，本发明将具有重要的临床治疗价值和广阔的市场开发前景。
权利要求
1.一种黄芪甲苷在制备加速皮肤再生和/或抑制疤痕形成的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的黄芪甲苷在制备加速皮肤再生的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的黄芪甲苷在促进表皮层再生、促进真皮层再生和/或促进血管再生的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的黄芪甲苷在制备抑制疤痕形成的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的黄芪甲苷在制备抑制皮肤成纤维细胞分泌转化生长因子β1 的药物中的应用。
6.根据权利要求4所述的黄芪甲苷在制备抑制皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的黄芪甲苷在制备抑制皮肤成纤维细胞分泌I型胶原蛋白与 III型胶原蛋白的比例的药物中的应用。
8.一种黄芪甲苷在制备增强再生皮肤力学强度的药物中的应用。
9.根据权利要求1 8任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物为以黄芪甲苷为活性成分，加入药用辅料制成的制剂。
全文摘要
本发明公开了一种黄芪甲苷在制备加速皮肤再生和/或抑制疤痕形成的药物中的应用。黄芪甲苷为中药黄芪的主要活性成分之一，为无色结晶，具有在促进皮肤再生和/或抑制疤痕形成方面的双重功效。经本发明实验证明，黄芪甲苷及其制剂对体内外皮肤的新生均具有明显的促进作用、同时能够抑制疤痕的形成。因此，黄芪甲苷可作为加速皮肤再生并减少疤痕形成的药物的活性成分，并可与药物载体共同制备成各种药物制剂。本发明的优点在于不仅发现和证明了黄芪甲苷及其制剂加速皮肤再生与抑制疤痕形成的作用，并从全新的角度解析了相关作用机理。在此基础上可开发新型皮肤再生促进剂，对于临床皮肤再生与疤痕形成的治疗、预防与基础研究具有指导意义。
文档编号A61K31/7048GK102247397SQ201110142429
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者彭丽华, 李平, 李齐梅, 高建青 申请人:常州市南方卫生器材厂有限公司, 浙江大学