专利名称：肝癌特异性基因-病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症的祀向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy,CTGVT)，特别涉及肝癌靶向基因-病毒治疗(CTGVT-LC)，具体涉及肝癌特异性基因-病毒及其应用。
背景技术：
1999-2001年，刘新垣创建了一种癌症治疗策略，叫癌症的靶向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro-Thearpy, CTGVT),它是将抗癌基因插入到溶瘤病毒(oncolytic virus, 0V)而成，故 CTGVT 策略即 OV-(gene)策略或 Gene Armed OncolyticVirus Therapy(GAOVT)策略，它也是OV-(gene)，它把基因治疗和溶瘤病毒治疗各自的优势结合起来了，因为溶瘤病毒本身就有抗癌作用，又可能特异性地在癌细胞中复制数百倍，插入其中的抗癌基因也可随之复制数百倍，故其抗癌效果大大地增加，既比相应单独基因治疗好很多，也比相应单独溶瘤病毒治疗好很多，故现在成为国际热点课题。基因治疗，虽然2009年被Science评为全球十大科学成果之一，但那都是对单基因缺乏的遗传病所获得的成果，对癌症这样复杂的基因突变疾病，基因治疗的抗癌效果，远不如CTGVT (GAOVT)的抗癌效果，基因治疗为Ad-(gene)，其中所用的载体Ad无靶向性，无复制能力(即非复制型Ad)。在CTGVT，即OV-(gene))的构建和应用中，OV(Oncolytic Virus)主要决定其靶向性，可用各式各样的方法加以修饰，使它只特异性靶向肝癌或其它癌症。Gene主要决定杀伤性，光OV的杀伤作用不强，故需加杀伤基因增强其杀伤性，故需构成OV-(gene)，即CTGVT (GAOVT)才能构成很强的抗癌药物，对CTGVT还可作更多改进，如将两个CTGVT合用，其抗癌作用更强，如专门靶向癌症干细胞，则有根除癌症，有彻底消灭癌症的可能性。溶瘤病毒(Oncolytic Virus，0V)，是指在肿瘤中特异表达和感染复制的病毒，有癌细胞靶向性，还能复制，但非肝癌特异性。任何病毒(Adenovirus (腺病毒)，SimplexHerpes Virus (HSV-1)(疱疹病毒)，Pox Virus (痘苗病毒))经改造后均可构成为OV。溶瘤病毒携带gene则变成0V-gene,但Ad-gene即基因治疗(其中Ad无祀向性,无复制倍增能力)。图I为腺病毒(Adenovirus, Ad)基因组图，简称Ad基因组图。腺病毒有早期基因E1、E2、E3、E4及晚期基因LI、L2、L3、L4、L5。控制了早期基因的表达，就控制了整个Ad的复制和感染。其中早期基因El又分为E1A、E1B，最重要的是E1A，其次是E1B，E1A的天然启动子被肝癌特异性的启动子替换，则此腺病毒只能在肝癌细胞中感染复制。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝癌特异性基因-病毒及其应用。本发明采用如下技术方案将Ad ElA中，用肝癌特异甲胎蛋白启动子(a -Feto pertein, AFP)等取代其天然启动子，即Ad .enAFP *E1A，控制腺病毒(Adenovirus，Ad)的表达，则此Ad AFP ElA只能在肝癌中感染复制，最后将肝癌消灭。本方法是用AFP启动子替换ElA本身的天然启动子，则此腺病毒变成了肝癌特异性溶瘤腺病毒，可简写为(LC) -OncoAd,构建Ad* AFP* ElA是本专利的根本要求，此外，ElA中的24bp也可删除，在ElB有两个基因，S卩19KD及55KD，或者缺失55KD，或者19KD及55KD双缺失均可，则构成A ElB, A为删除之意，即ElB全部被删了。只要根本要求Ad AFP ElA存在就行，我们所用AFP都为enAFP (即AFP用SV40的增强子强化(enhance)其启动子能力，写成enAFP)(当然AFP也可换成其它肝癌特异性启动子)。要构成CTGVT-LC，当然首先还要在(LC)OncoAd然后在其中加上肝癌特异性的抗癌基因(包括抑癌基因)。至于基因方面，对肝癌来说，或者加入肝癌特异性抗癌基因，包括肝癌特异性抑癌基因，如 S0CS3、HCCS-I、TSLC-I，构成 Ad enAFP ElA …E1B_(S0CS_3)。如上述Ad enAFP ElA…E1B_(S0CS_3)的抗癌能力还不够强，则可在上述同样(LC)OncoAd中加上抗癌作用很强的但非肝癌特异性抗癌基因，如IL-24、MnS0D、TRAIL等等与之合用，即 Ad enAFP ElA ⑴ E1B_(S0CS_3)与 Ad enAFP ElA ⑴ E1B-(IL_24)共同使用于肝癌治疗。此夕卜，还发现Ad enAFP ElA AElB-(IL-24)，也算 CTGVT-LC，这是因为 AElB与IL-24合用可能特异地全部消灭小鼠移植性肝癌，还可对未经瘤内注射的远端移植性肝癌也起到治疗作用，抗肝癌率达80%以上。本发明的肝癌特异性基因-病毒，将抗癌基因插入到溶瘤病毒而制成，所述溶瘤病毒为溶瘤腺病毒，在一优选例中，ElA的天然启动子被肝癌特异性启动子所取代(如肝癌特异甲胎蛋白启动子)。根据本发明，所抗癌基因选自S0CS3、HCCS-U TSLC-I等肝癌特异性抗癌能力很强的基因，如其抗癌能力还不够强，可用抗癌能力特别强的基因加入相同的(LC)OncoAd载体中与之共同使用，如 IL-24、MnSOD、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、Bax或TRAIL,如上述任何两个基因共同使用时,也可采用联接子(linker)将两个基因联接起来，成为一个基因使用，如TRAIL-linker-IL-24。本发明除ElA需 被AFP等肝癌特异性启动子所调控表达外，ElA及ElB均可进行各种改造，构成OV的双调控或三调控载体，虽然不改变其肝癌特异性靶向，但可增强其癌症靶向性和安全性(不过表达率可能有所降低)，如将ElB中55KD缺失则成为ElB ( A 55)，A表示缺失之意，如将ElB中的两个基因19KD及55KD全部缺失，则构成AE1B，ElA的24bp也可缺失构成ElB (A 24)，它靶向Rb缺失的肿瘤，可加强靶向Rb缺失的癌症，ElB也可被HIF(低氧诱导因子)，特异性决定于ElA被AFP控制其在肝癌中表达。
图I为腺病毒基因组图。图2为实施例I涉及的基因组图。图3为实施例2涉及的基因组图。图4为实施例3涉及的基因组图。图5A为pAd-ElA(ANat.p)_AElB构建过程示意图，图5B为Ad. enAFP-ElA-A ElB-(IL-24)构建过程示意图。图6为实施例4的体外抗癌效果图。图7为实施例5体内抗癌效果图。图8为实施例6体外抗癌效果图，其中QSG-7701为肝正常细胞，H印G2、H印3B、Huh-7为肝癌细胞。图9为实施例7体内抗癌效果图。
具体实施方案
·
癌症的革巴向基因-病毒治疗(CancerTargeting Gene-Viro-Therapy, CTGVT)是将抗癌基因加到溶瘤腺病毒中，即OV-gene，本申请的发明人经过广泛而深入的研究，发现只用溶瘤腺病毒(Oncolytic Adenovirus,简写OncoAd),因其有癌症祀向性,但非肝癌特异的革巴向性，要构建肝癌特异性的革巴向基因-病毒(Liver Cancer Specific CTGVT,简称CTGVT-LC)，则需要将肝癌特异性的抗癌基因(LC)-gene加到肝癌特异性的溶瘤腺病毒中(LC OncoAd),构成(LC) OncoAd-(LC)-gene。在此基础上，完成了本发明。肝癌特异性基因-病毒及其构建方法在本申请中，(LC) OncoAd是将Ad ElA的天然启动子换成肝癌特异性启动子AFPJP Ad AFP E1A，至于对Ad ElB如何改造无严格要求，其启动子可换成HIF (低氧诱导因子)，或删除其中55KD(Ad ElB (A 55)) (A为删除符号)或将ElB中19KD与55KD两个基因全部删除，则等于删除了全部ElB (即A ElB)，这就是Ad* AFP* ElA* AE1B，在LC OncoAd构建中，Ad ElA是关键性的。LC-gene则宜选用肝癌特异性抗癌基因如HCCS1、S0CS3、TSLC_1等，其总的结果为Ad AFP ElA E1B(A55)-(S0CS3)等，如抗癌还不理想，可选用抗癌作用较强的IL-24、TRAIL，构成 Ad AFP ElA ElB ( A 55) -(IL-24)，与上述带 S0CS3 的 CTGVT-LC 共用，也叫CTGVT-LC。其中 S0CS3 与 IL-24 两基因也可用联接子(Linker)连成(S0CS3-Linker-IL_24)作为一个基因加入(LC) OncoAd 中，则成为 Ad AFP ElA ElB (S0CS3-Linker-IL-24)。本发明构建的Ad AFP ElA A ElB-(IL-24)，虽只单独使用普通的抗癌基因，而未使用肝癌特异性抗癌基因，但是它由于使用了 AElB及IL-24，特异性抗肝癌效果极好，可全部消灭肝癌，故也能作为CTGVT-LC。此外，Ad AFP ElA E1B( A55)-(S0CS3)中，加上 microRNA 或 RNAi 与之联用，构成Ad (microRNA) AFP ElA ElB ( A 55) - (S0CS3)，也会大大提高其抗癌效果。Ad ElA中的ElA的天然启动子用肝癌特异性启动子如AFP所替换等，即Ad AFP E1A，这也是一种溶瘤腺病毒，但能特异性地在肝癌中表达并感染复制，Ad .AFP .ElA中的ElA可改为ElA ( A 24)，A为删除符号，即从Ad的923-946间的24bp删除掉，即Ad .AFP *E1A ( A 24)，它靶向Rb缺乏的肿瘤，但非肝癌特异性。Ad .AFP .ElA .ElB中的ElB可改为ElB ( A 55)，即ElB中55KD蛋白质的基因也被删除了，ElB也可改为A ElB (即ElB中的55KD及19KD两个蛋白质基因全部删除了)，则为Ad -AFP -ElA AElB JnElB的天然启动子，也可改HIF (低氧诱导因子)，则为Ad AFP ElA HIF ElB,上述其它(指除AFP -ElA外)这些构建都可使之更靶向癌细胞，但均无肝癌特异性。综上所述，ElB可任意改造，获得Ad AFP ElA M ElB ( M ElB表示ElB可任意改造)。
在Ad AFP ElA ^ ElB中加入肝癌特异性抗癌基因，如S0CS3、HCCS-UTSLC-I 等，构成如 Ad AFP ElA ElB ( A 55) (S0CS3)，S0CS3 在括号内表示为 S0CS3的表达框，如Ad AFP ElA ElB ( A 55) (S0CS3)的抗癌作用还不够强，则可构建Ad AFP ElA ElB ( A 55) (TRAIL)与之共用，可大大加强其抗肝癌的功能，即一个抗癌作用很强的普通抗癌基因构成的重组子与上述CTGVT-LC合用，上面所用TRAIL也可改用IL-24、MnSOD, CD、Smac, GM-CSF, IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、Bax 等。以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1CTGVT-LC 具体构建方法 I Ad enAFP ElA D55_(gene)的构建I.如图2所示，Ad5 (ffT)为野牛型(即正常)腺病毒5(Wild Type)腺病毒(Adenovirus, Ad，现在所用Ad大都为5型，故5字不特别标出)，其中ElA及ElB均正常，未经任何改造，市场有卖，本课题组有储备； 2. ZD55 为溶瘤病毒(Oncolytic Adenovirus, OncoAd),其 ElB 区的 55K 蛋白质的基因被删除(deletion 55K或称A 55K, D55)，Z为研究者的姓Zou,为一种0V,即能靶向癌细胞，并最后把它溶解掉，但无肝癌特异性，ZD55的构建为本实验室专利(ZL 02157662.9及ZL 200510026151. 5)，已经介绍得清清楚楚了，不用多叙述；3. ZD55~(gene)(即 Ad ElA ElB ( A 55) - (gene))ZD55为OncoAd载体，其中有限制酶切点Bgl II。(gene):括号中的gene，代表基因表达框，它的两端也有Bgl II切点，用此基因表达框Bgl II位点插入到ZD55的Bgl II切点中，则构成ZD55- (gene)，括号内加基因，代表一个基因的表达框。每一个基因表达框，均含三个元件(I)启动子(promoter)，其作用为启动子基因表达出蛋白质，本专利使用的CMV启动子,无专利,大家都可用，没有promoter,基因不会表达；(2)基因(gene)，任何基因均可；(3)终止讯号，即polyA讯号，体内有很多蛋白质要表达，但不能连成一片，而是一个一个蛋白质要分开表达，才能构成生命，这就要在基因表达
终止密码子UGA、UAA或UAG之后，加polyA终止讯号顺序，在翻译时生成以AAAAA......为
主的顺序，这样基因的表达才算告一个段落，由polyA讯号指导完成这个AAAA......加入
的步骤。4. Ad enAFP ElA D55~(gene) D55 即 ElB 中删除 55KD 蛋白基因，即ElB ( A 55) (A代表删除ElB中的55KD基因之意)，与ZD55意义同，ZD55_(gene)已是CTGVT 了，但为加强其肝癌特异性，故在Ad ElA ElB ( A 55) - (gene)的ElA之前的XhoI-SnaBI酶切位点与带有同样XhoI-SnaBI位点的肝癌特异性启动子enAFP结合，构成Ad enAFP ElA D55_(gene)，即其只靶向肝癌而不或极少靶向其它癌细胞，即CTGVT-LC。Ad enAFP ElA D55- (gene)中的gene,若为肝癌特异性的抗癌基因，则构成 Ad enAFP ElA ElB ( A 55) - (S0CS-3)，在 ElB ( A 55)后面有一个 Bgl II 切点，而(S0CS-3)表达的5’和3’两端也有Bgl II切点，利用(S0CS-3)的Bgl II切点装入Ad enAFP ElA D55 的 Bgl II 位点，则得到 Ad enAFP ElA D55_(S0CS_3)。实施例2 =CTGVT-LC具体构建方法2如上述Ad MnAFP ElA ^dSS-(SOCS-S),—个抗癌基因效果还不佳，可加一个抗癌作用特别强的，但非组织特异性的抗癌基因，如TRAIL加到上述同一个(LC)OncoAd中，而构成Ad .enAFP *E1A .DSS-(TRAIl),其方法是TRAIL表达框(两端均带Bgl II切点)装入D55的 Bgl II 位点中即可，将 Ad .enAFP .ElA .D55-(S0CS-3)与 Ad enAFP .ElA *D55-(TRAIL)两者共用如图3所示，则可取得极好的抗癌效果。两个基因前面为分别构建不同的重组子，然后合用使用，则可大大增强其抗癌作用，因为两个基因可能有互补性或协同效应。如将两个基因用Linker连起来装入Ad ^enAFP-ElA- D55- (TRAIL-Linker-S0CS-3)中亦可取得很好抗癌效果，也属于本专利范围。实施例3 =CTGVT-LC具体构建方法3用enAFP启动子控制E1A，所用基因为抗癌作用很强的普通基因IL-24，放入Ad enAFP *E1A AElB中，也取得意想不到的抗肝癌效果，其构建方法的柜架如图4所示。
I.如图4所示，Ad-Wt同实施例I中Ad5 (ffT)。2.构建Ad enAFP .ElA AElB :先用 PCR从D55 中切除 19KD 构成 Ad .ElA AE1B，然后与删除ElA的天然启动子的Ad *E1A (ANat. p)，构成Ad *E1A (ANat. p) AE1B，再在Ad ElA ( A Nat. p)中加上 enAFP 构成 Ad enAFP ElA A ElB ；3. Ad enAFP ElA AE1B-(IL~24) Ad enAFP ElA A ElB 已是一种溶瘤病毒了，有抗癌作用，但不强，如加一个抗癌作用很强的IL-24基因表达框，S卩(IL-24)，其抗癌作用更强，其方法是将IL-24表达框(两端都带Bgl II，装入D55的Bgl II中)，则可构成Ad enAFP ElA A ElB-(IL-24)，它可把肝癌全部消灭光(图7之C)。此CTGVT-LC 建构方案，只申请 Ad enAFP ElA A ElB-(X)(如 X 为 IL-24)，Ad enAFP ElA AE1B_(IL_24)取得极好的抗癌效果，可把肝癌全部消灭光，甚至远端肝癌也能抑制80%以上，故特此申请专利。X也可为抗癌作用极强的TRAIUMnSOD等等均可，也可用双基因如TRAIL-IETD-IL-24等，或用RNAi+IL-24也是一种双基因。具体的构建步骤如5A、图5B所示，用PCR方法除去ElB中的19KD，先合成一对引物上游引物-xbal(此序列在 ElA 序列中)cgacatcacctgtgtctagagaatgca ；下游引物-Bgl II :agatctgaggtcagatgtaaccaagatt。以p ZD55为模板，用上述合成引物PCR出390bp左右的片段a，连接到pMD18-T载体上，构成P MD18-T_a,经测序鉴定正确。进一步用xhaI,Bgl II双酶切p MD18-T_a,回收小片段a。用xhaI，Bgl II双酶切p ZD55，回收大片段b，连接a，b片段，即可得到pAd-AElB。用xbal，EcoR I 双酶切 pAd-AElB、pAd-ElA ( A Nat. p)，连接片段得到pAd-ElA( A Nat. p)- AE1B。用xhoI,SnaB I 双酶切 pAd-ElA ( A Nat. p) - A ElB,片段 Xho I-enAFP-SnaBI,连接得到 pAd enAFP-ElA-AE1B。采用Bgl II 酶切 pAd enAFP-ElA-AElB，片段 Bgl II-mCMV-IL-24-polyA-BglII，连接得至Ij pAd enAFP-ElA-AElB-(IL-24)。pAd enAFP-ElA-A ElB-(IL-24)与 pBHGE3 在 HEK293 细胞中重组，得到Ad enAFP-ElA-A ElB-(IL-24)。本领域技术人员在以上描述内容的基础上，采用常规的分子生物学等试验技术手段即可获得本发明的治疗肝癌特异性的基因-病毒。因此此处不再赘述。
实施例4 =CTGVT-LC具体构建方法1、2的体外(in vitro)抗癌效果。将癌细胞及正常细胞接种于96孔板(细胞数为6 X IO3)，当细胞生长至接近饱和时(如80%饱和)(饱和指细胞长满了全孔)。对不同细胞包括正常细胞(A)、宫颈癌细胞(B)、AFP阴性的BEL7404肝癌(C)、AFP阳性的肝癌细胞H印G2 (D)、AFP阳性的肝癌细胞Huh7 (E)、AFP 阳性的肝癌细胞 PLC (F)，分别用 PBS、AFD D55_(S0CS_3)、AFD D55-(TRAIL)及 AFD *D55-(SC0S-3)加 AFD *D55-(TRAIL)等不同 MOI 处理，然后对每一个孔加 MTT (5mg/ml) 20 u I再继续在37°C培养4小时，倒掉上清，沉淀用DMSO溶解，在370nm测光吸收(仪器为Multiskan MK-3微板阅读器,美国，麻省,Thermo Scientific公司生产)以测定细胞生存率(Cell Viability，杀伤力强，则生存率小)。
给药组OD57Q-培养液OD570
细胞生存率=-X 100%
未给药组OD57Q-培养液OD570结果如图6所示。所有药物对正常细胞组(A)、肠癌细胞组(非肝癌)(B)及AFP阴性(非阳性)的肝癌细胞组(C)均无抗癌作用，而对所有AFP阳性肝癌细胞组(D、E、F)均有抗癌作用，其抗癌强度为AFP D55-(S0CS3)+AFP D55-(TRAIL) > AFP D55-(TRAIL)；或AFP D55-(S0CS3) > AFP D55 > PBS。实施例5 =CTGVT-LC具体构建方法1、2的体内(in vivo)抗癌效果。选用4周龄的雌裸鼠(nude mice)，购自上海实验动物中心，所有的实验操作符合美国国家卫生研究院关于实验动物保护和使用的指导原则，使用6X IO3在150 u IDMEM培养中将Huh7ce 11 s皮下接种于每个小鼠的背侧，等候肿瘤生长到80-150mm3，将小鼠随机分成4组，对照组(打生理盐水，PBS)及不同药物组为Ad AFP ElA ElB ( A 55)(即 AFP D55 组)、Ad AFP ElA ElB ( A 55) (S0CS3) ( BP AFP D55_(S0CS3)组)、Ad AFP ElA ElB ( A 55) (TRAIL)(即 AFP D55- (TRAIL)组)及 AFP D55- (S0CS3)与AFP D55-(TRAIL)合用组，每天肿瘤内注射治疗一次，每次0. 5 X 108pfu连续4次，总共剂量各组均为2X 109pfu,然后每周用caliper尺测量肿瘤的长与宽,肿瘤的大小(volume, V)按下面公式计算，V = 1/2长X宽2，最后把小鼠杀死，切下肿瘤拍照，并将瘤块大小绘成柱状图。结果如图7所示，其中A为各种物质的抗癌作用，横坐标为时间，纵坐标为肿瘤体积的大小。瘤体积越小，抗癌作用越强，其抗癌强弱次序AFP D55-(TRAIL)+AFP D55-(SC0S_3) > AFP D55-(SC0S_3)或 AFP D55-(TRAIL) >AFP D55 >> PBS。B 为小鼠存活率曲线图，在 AFP D55-(SC0S-3)+AFP D55-(TRAIL)联合使用组，无一小鼠死亡。C为试验结束后，切下瘤子，拍照的图片，根据测量获得的瘤块大小，绘成柱状图D，柱状图中最矮最小者，抗癌作用最好，故两个CTGVT共用时，抗癌作用最好，最差的是单用的溶瘤病毒，当然PBS最最差，无抗癌作用。实施例6 =CTGVT-LC的具体构建方法3的体外(in vitro)抗癌效果方法同实施例4。结果如图8所示。结果为Ad enAFP ElA A ElB-(IL-24)在正常细胞QSG-7701中抗癌作用其抗癌效果与Ad AFP ElA AElB同，即对正常细胞无伤害作用，但在肝癌细胞H印G2、Hep3B、Huh 7等的抗癌作用，均比Ad AFP ElA AElB强。实施例7 =CTGVT-LC的具体构建方法3的体内(in vivo)抗癌效果方法同实施例5。结果如图9所示。做动物抗癌实验，起始时瘤子的体积大小很重要，与药物的抗癌效果成反比，起始瘤块太大，则抗癌药物很难抑制肿瘤生长，抗癌效果差。故一般规定它在80-130mm3之间，最大不能超过200mm3。如图8A所示，结果肿瘤长到了 390mm3才开始给药，其抗癌结果较差，但仍可观察到不同药物的其抗癌效果不同，在图8中的抗癌效果强弱，依次为Ad enAFP .ElA AE1B-(IL_24) > Ad enAFP .ElA AElB >> Ad .Wt > PBS。图8B表示小鼠死亡曲线，注射Ad enAFP AE1B_IL_24组，全部小鼠均存活无死 亡，表示实际上它有很好的抗癌作用。如果在肿瘤长至90mm3时就开始给药，结果如图8C所示，效果极好。Ad enAFP ElA AE1B-(IL_24)可很快将瘤块全部消灭掉。图8D表明Ad enAFP ElA AE1B-(IL_24)对远端肿瘤也产生很好的杀伤作用，即在nude mice两处都接种肿瘤，一处注射抗肿瘤药物，全部瘤块消灭了，另一远端处不给药，但对肿瘤生长也有80-90%的抑制作用。说明我们的CTGV-LC抗癌效果好极了，故申请专利。本发明通过上述实验，证实本发明的肝癌靶向基因-病毒可以用于制备治疗肝癌的药物。肝癌靶向基因-病毒组合物也可以用于制备治疗肝癌的药物，所述肝癌靶向基因-病毒组合物含有肝癌靶向基因-病毒以及药学上可接受的载体或赋形剂、如溶剂、稀释剂等，肝癌靶向基因-病毒与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合、如溶剂、稀释剂等，从而形成肝癌靶向基因-病毒组合物，这些对于本领域的技术人员来说都是显而易见的。
权利要求
1.一种肝癌特异性基因-病毒，其特征在于，所述基因-病毒是由肝癌特异性启动子替换腺病毒最关键的ElA基因的天然启动子，调控ElA表达，构成一种肝癌特异性溶瘤腺病毒，然后在其中插入肝癌特异性的抗癌基因而构成。
2.如权利要求I所述的肝癌特异性基因-病毒，其特征在于，所述肝癌特异性启动子为肝癌特异性的甲胎蛋白启动子AFP。
3.如权利要求I所述的肝癌特异性基因-病毒，其特征在于，所用肝癌特异性的抗癌基因选自S0CS3、HCCS-I 或 TSLC-I。
4.如权利要求I所述的肝癌特异性基因-病毒，其特征在于，所述基因-病毒还可加入抗癌作用很强的基因以加强其抗癌能力，所述抗癌作用很强的基因选自IL-24、MnS0D、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、Bax 或 TRAIL 中的一个或两个。
5.如权利要求4所述的肝癌特异性基因-病毒，其特征在于，加入两个抗癌作用很强的基因的，两个基因采用联接子联接，如TRAIL-linker-IL-24。
6.一种肝癌特异性基因-病毒，其特征在于，所述基因-病毒是在肝癌特异性启动子-甲胎蛋白启动子AFP的调控下，将腺病毒的AElB与IL-24相配合，构建而成的基因-病毒 Ad AFP ElA A ElB IL-24。
7.如权利要求I所述的肝癌特异性基因-病毒，其特征在于，腺病毒还可以被进行如下改造 1)3认删除2仙？，或 2)、ElB删除55KD或同时删除19KD和55KD 3)启动子被HIF所取代。
8.—种药物组合物，其特征在于，包含权利要求I 7中任一项所述的肝癌特异性基因-病毒。
全文摘要
本发明公开了一种肝癌特异性基因-病毒及其应用。该病毒为溶瘤腺病毒，其早期基因E1分为E1A、E1B，所述E1A的启动子被肝癌特异性启动子取代，优选为被肝癌特异甲胎蛋白启动子取代，且该病毒携带抗癌基因。所抗癌基因为SOCS3、HCCS-1、TSLC-1、IL-24、MnSOD、或TRAIL。优选为所抗癌基因为IL-24。本发明的肝癌特异性基因-病毒，用于肝癌的特异性治疗药物，具有很高的靶向抗肝癌作用，对正常细胞基本无影响，对多数其它癌症细胞作用也很小。
文档编号A61K48/00GK102796709SQ20111014210
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者刘新垣, 韦睿成, 章康健, 曹欣 申请人:中国科学院上海生命科学研究院