专利名称：一种靶向复合型纳米粒子的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米药物载体领域，具体涉及ー种靶向的脂质-高分子复合纳米粒子的制备エ艺及其载羟基喜树碱靶向纳米粒子的研究。
背景技术：
恶性肿瘤是目前对人类健康威胁最为严重的疾病，已成为人类死亡的第一原因。目前针对恶性肿瘤的治疗手段主要有手术治疗，化学治疗，放射治疗等，其中化学治疗是临床中除手术之外最为适用的治疗方法，应用非常普遍。而绝大部分化疗药物不仅会杀死肿瘤细胞，还会破坏正常组织与细胞，产生较为严重的副作用。因此，利用纳米粒子作为药物载体，是降低化疗药物毒副作用，提高药物疗效的最为有效的手段之一。近几十年来，已研究开发了多种类型的药物载体，包括脂质体、高分子纳米粒子、 胶束、微囊微泡等，其中以脂质体和高分子纳米粒子为载体的抗癌药物制剂应用最广。脂质体作为药物载体具有良好的生物相容性，易在细胞表面吸附，融合，内呑，从而释放出药物；而高分子纳米粒子作为药物载体具有稳定性好、对疏水性药物包封率高等特点。但脂质体与高分子纳米粒子作为药物载体都具有各自的缺陷，例如，脂质体药物制剂对疏水性药物的载药量不高，且在体内循环过程中易发生药物渗漏，不能实现有效的缓控释；而高分子纳米粒子由于其疏水性表面在体内容易吸附调理素和脂蛋白等易被巨噬细胞识别并吞噬，从而被人体免疫系统清除，细胞膜融合性较脂质体差。这些都降低了该两类药物载体的化疗疗效。因此，近年来将脂质体和高分子纳米粒子相复合的新型的药物载体的概念已有涉及，通过制备脂质-高分子复合纳米粒子，不仅可以提高疏水性药物的包封率及载药量，还可以使微粒具有更好的生物相容性和体内循环性。目前，制备复合型纳米粒子主要有两种方法。其一是模板法先将高分子材料制备成纳米粒子，再将高分子纳米粒子与磷脂及聚こニ醇(PEG)化的磷脂共孵育，通过磷脂自组 装的过程，在高分子纳米粒子上形成磷脂双分子壳层。此方法操作エ艺复杂，复合纳米粒子与未包覆磷脂壳层的高分子纳米粒子不易分离收集，无法实现エ业放大。而且由于制备过程中，需要较长的孵育时间及较高的孵育温度，药物易从中渗漏，造成载药量及包封率进ー步下降；其ニ是纳米沉积法将高分子聚合物溶解在易于水互溶的溶剂中，如こ腈，丙酮等，将其滴加入含有磷脂的水溶液中并高速搅拌。专利CN 101708162A公开了ー种用上述方法，制备了ー种由聚丙交酯-已交酯共聚物(PLGA)，磷脂和PEG化的磷脂组成的核壳式纳米粒子。其粒径分布在8(T250nm。该法制备核壳式纳米粒子同样具有一定的局限性。首先，制备过程中溶剂需要加热至65摄氏度，已高出了 PLGA的玻璃化转变温度，其对载体材料的分子链会产生影响，如果用于载药纳米粒制备，有可能会对药物的稳定性、包封率产生影响；其次，如果要通过该法制备载药纳米颗粒，其只能针对可以溶解在こ腈中的药物，这大大限制了其实际使用范围，因为目前所发现的疗效较好的抗癌药大部分都是强疏水的，如喜树碱，羟基喜树碱，阿霉素等，这些药物在こ腈等极性较大的溶剂中基本不溶；同吋，使用该类与水可互溶的溶剤，药物也会随溶剂扩散至水相中，所得产物的载药量及包封率较低。因此，开发新的靶向复合型纳米粒子及其制备方法是非常有必要的，将会对靶向纳米药物制剂的开发及其应用产生巨大的推动作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单易行，可エ业化扩大生产的靶向复合型纳米粒子的制备方法。所得靶向复合型纳米粒子无需加热，对羟基喜树碱，多西他赛，阿霉素或紫杉醇等疏水性药物载药量及包封率高，磷脂表面覆盖率高，体外稳定性好且不易吸附血清蛋白，靶向性较好。本发明将磷脂，聚こニ醇化磷脂以及连有RGD的聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺作为乳化剤，采用ニ氯甲烷和こ醇的ニ元混合溶剂体系，利用一歩乳化法，制备以PLGA为核，磷脂及聚こニ醇化磷脂为壳层制备靶向复合型纳米粒子，具体包括如下步骤
(1)以ニ氯甲烷和こ醇为混合溶剂，ニ氯甲烷和こ醇的体积比为3、I ;配制PLGA浓度 为l(T50mg/mL的有机溶液；
(2)根据步骤(I)中PLGA的质量，按质量比PLGA:磷脂=5 15:1，称取蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺，并溶于步骤I中配制好的PLGA有机溶液中，蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺的摩尔比为9:1 3:7；
(3)将步骤(2)中配制的混合有机溶液按油水相体积比I:2飞滴加入一定体积的超纯水中并闻速润旋振荡；
(4)通过超声波破碎仪，将步骤(3)中涡旋振荡后的乳液，进行探头超声，超声功率为7 14W，超声时间30-180秒；
(5)将步骤(4)中超声后的乳液滴按体积比I:2飞滴加入超纯水中，连续搅拌3h左右，使有机溶剂完全挥发；
(6)将步骤(5)进行完后的物料取出，通过低温高速离心收集已固化的可降解聚合物納米粒子，并用蒸馏水清洗2-4次后冷冻干燥，即得靶向复合型纳米粒子。在上述制备方法中，步骤(2)中所述聚こニ醇化的磷脂-聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺中掺连有RGD的聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺。在上述制备方法中，步骤(I)中所述ニ氯甲烷和こ醇的最佳体积比为4: I。本发明制备的靶向复合型纳米粒子可以用于包载各种类型的药物，尤其是强疏水性药物，如羟基喜树碱，喜树碱，多西他赛，阿霉素，紫杉醇等药物。本发明以羟基喜树碱为例，制备ー种羟基喜树碱复合型纳米粒子，载药量可达18. 9%，包封率可达94. 5%。包括如下步骤
(1)以ニ氯甲烷和こ醇为混合溶剂，ニ氯甲烷和こ醇的体积比为3、I ;配制PLGA浓度为l(T50mg/mL的有机溶液；
(2)根据步骤(I)中PLGA的质量，按质量比PLGA:磷脂=5 15:1，称取蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺，并溶于步骤I中配制好的PLGA有机溶液中，蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺的摩尔比为9:1 3:7；
(3)按照质量比PLGA:羟基喜树碱=5 20:1来称取羟基喜树碱，并溶于步骤2所得有机溶液中；
(4)将步骤(3)中配制的混合有机溶液按油水相体积比I:2飞滴加入超纯水中并高速润旋振荡；
(5)通过超声波破碎仪，将步骤4中涡旋振荡后的乳液，进行探头超声，超声功率为7 14W ；
(6)将步骤5中超声后的乳液按体积比I:2飞滴加入超纯水中，连续搅拌3h左右，使有机溶剂完全挥发；
(7)将步骤6进行完后的物料取出，通过4°C下10，000-13,OOOrpm离心收集固化的可降解聚合物納米粒子，并用蒸馏水清洗2-4次后冷冻干燥，即获得了以PLGA为核，磷脂及聚こニ醇化的磷脂为壳层并包覆有羟基喜树碱的复合型纳米粒子。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明利用磷脂，聚こニ醇化磷脂的两亲性，利用一歩乳化法，制备ー种以可降解的高 分子聚合物PLGA为核，蛋黄卵磷脂，聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺以及连有RGD的聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺为壳的靶向复合型纳米粒子，中心粒径分布在20(T300nm之间。一方面，聚こニ醇化磷脂可在复合型纳米粒子表面形成水化层，阻碍体内调理素及脂蛋白的吸附，提高纳米粒子在体内外的稳定性，延长其体内的循环时间；另一方面，复合型纳米粒子壳层中连有RGD的聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺能有效促进纳米粒子与ー些整合素高表达的肿瘤细胞或者肿瘤新生血管特异性的结合，提高局部药物浓度，从而使其具有更好的抗肿瘤效果。本发明制备的羟基喜树碱靶向复合型纳米粒子，不仅载药量大，包封率高，而且延长了羟基喜树碱在体内的有效作用时间，并通过主动靶向作用有效的促进了纳米粒子与肿瘤细胞的结合，降低了药物对正常细胞的毒副作用，从而提高药物的治疗效果。
图I为实施例I制备的复合型纳米粒子的扫描电镜照片；
图2为实施例2是复合型纳米粒子的氢核磁共振谱图，可根据特征吸 收峰的面积计算聚こニ醇化磷脂在复合型纳米粒子表面的覆盖率；
图3为实施例3不同纳米粒子的体外模拟缓冲溶液中的血清蛋白吸附程度；
图4为实施例4含有血清蛋白的体外模拟缓冲溶液中的粒径变化情况；
图5为实施例6制备的羟基喜树碱复合型载药纳米粒子的透射电镜照片。
具体实施例方式实施例I
将PLGA用体积比为ニ氯甲烷こ醇=3:1的有机溶剂溶解配成浓度为50mg/mL的有机溶液，卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比9 :1溶解在上述有机溶液中，并将其滴加入2倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为7W，超声30秒，之后将乳液加入2倍体积的超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以357纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0. 268。扫描电镜下观察该纳米粒子具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。如图I所
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实施例2
将PLGA用体积比为ニ氯甲烷こ醇=4:1的有机溶剂溶解配成浓度为40mg/mL的有机溶液，卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比7 :3溶解在上述有机溶液中，将其滴加入2倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为9W，超声60秒，之后将乳液加入2倍体积超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以337纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0. 228。扫描电镜下观察该纳米微球具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。称取一定量的复合微球，用氘代ニ甲亚砜溶解，通过氢核磁共振，计算复合微球表面的PEG化磷脂质量，并计算其表面覆盖率为34. 56%。如图2所示。实施例3 将PLGA用体积比为ニ氯甲烷こ醇=5:1的有机溶剂溶解配成浓度为30mg/mL的有机溶液，卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比5 5溶解在上述有机溶液中，将其滴加入4倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为11W，超声120秒，之后将乳液加入4倍体积超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以305纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0. 186。扫描电镜下观察该纳米微球具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。取一定质量复合微球，将其分散在含有血清蛋白的模拟缓冲溶液中，孵育24小时及48小吋，测其模拟液中血清蛋白的残留量。与未经表面修饰的PLGA微球相比，复合微球在体外蛋白吸附量少，并具有较好的稳定性。如图3所示。
实施例4
将PLGA用体积比为ニ氯甲烷こ醇=3:1的有机溶剂溶解配成浓度为50mg/mL的有机溶液，卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比3 7溶解在上述有机溶液中，将其滴加入4倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为14W，超声180秒，之后将乳液加入4倍体积超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以272纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0. 116。扫描电镜下观察该纳米微球具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。并且该复合纳米粒子在含有血清蛋白的模拟缓冲溶液中粒径未发生变化，具有较好的稳定性。如图4所示。
实施例5
将PLGA和羟基喜树碱按质量15:1溶解在体积比为ニ氯甲烷こ醇=3:1的有机溶剂中，将卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比3 7同时溶解在上述有机溶液中，将其滴加入5倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为14W，超声60秒，之后将乳液加入5倍体积超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。
激光粒度分析表明，所得纳米粒子以278纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0.126。扫描电镜下观察该纳米微球具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。测试结果载羟基喜树碱量为5. 38%，包封率为80. 7%。实施例6
将PLGA和羟基喜树碱按质量10:1溶解在体积比为ニ氯甲烷こ醇=4:1的有机溶剂中，将卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比5 5同时溶解在上述有机溶液中，将其滴加入2倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为14W，超声60秒，之后将乳液加入2倍体积超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒 子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以298纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0.154。扫描电镜下观察该纳米微球具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。测试结果载羟基喜树碱量为8. 11%，包封率为81. 1%。如图5所示。实施例7
将PLGA和羟基喜树碱按质量5:1溶解在体积比为ニ氯甲烷こ醇=5:1的有机溶剂中，将卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比7:3同时溶解在上述有机溶液中，将其滴加入2倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为14W，超声60秒，之后将乳液加入2倍体积超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以311纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0.174。扫描电镜下观察该纳米微球具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。测试结果载羟基喜树碱量为18. 9%，包封率为94. 5%。实施例8
将PLGA和羟基喜树碱按质量10:1溶解在体积比为ニ氯甲烷こ醇=3:1的有机溶剂中，将卵磷脂，聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺以及连有RGD聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺按质量比3:6:1溶解在上述有机溶液中，将其滴加入2倍体积的超纯水中，用超声波细胞破碎仪，功率为14W，超声60秒，之后将乳液加入2倍体积超纯水中，连续搅拌3h去除有机溶剤，使复合型纳米粒子固化成型，最后离心收集并用超纯水清洗三次，并冷冻干燥获得复合型纳米粒子的产品。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以301纳米为有效直径呈正态分布，多分散性为0.162。扫描电镜下观察该纳米微球具有规整的球形外观，在乳液中分散良好。测试结果载羟基喜树碱量为8. 33%，包封率为83. 3%。以乳腺导管癌细胞为细胞模型，所制备的羟基喜树碱靶向复合型纳米粒子的IC5tl较之于羟基喜树碱原料药降低一半，说明其药物治疗效果有明显提高。
权利要求
1.ー种靶向复合型纳米粒子的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)以ニ氯甲烷和こ醇为混合溶剂，ニ氯甲烷和こ醇的体积比为3、I ;配制PLGA浓度为l(T50mg/mL的有机溶液； (2)根据步骤(I)中PLGA的质量，按质量比PLGA:磷脂=5 15:1，称取蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺，并溶于步骤I中配制好的PLGA有机溶液中，蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺的摩尔比为9:1 3:7； (3)将步骤(2)中配制的混合有机溶液按油水相体积比I:2飞滴加入超纯水中并高速祸旋振荡; (4)通过超声波破碎仪，将步骤(3)中涡旋振荡后的乳液，进行探头超声，超声功率为7 14W ； (5)将步骤(4)中超声后的乳液按体积比I:2飞滴加入超纯水中，连续搅拌3h左右， 使有机溶剂完全挥发； (6)将步骤(5)进行完后的物料取出，通过低温高速离心收集已固化的可降解聚合物納米粒子，并用蒸馏水清洗2-4次后冷冻干燥，即得靶向复合型纳米粒子。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述聚こニ醇化的磷脂-聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺中掺连有RGD的聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺。
3.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述ニ氯甲烷和こ醇的体积比为4:1。
4.利用权利要求I所述方法制备羟基喜树碱复合型纳米粒子，其特征在于包括如下步骤 (1)以ニ氯甲烷和こ醇为混合溶剂，ニ氯甲烷和こ醇的体积比为3、I ;配制PLGA浓度为l(T50mg/mL的有机溶液； (2)根据步骤(I)中PLGA的质量，按质量比PLGA:磷脂=5 15:1，称取蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺，并溶于步骤I中配制好的PLGA有机溶液中，蛋黄卵磷脂与聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺的摩尔比为9:1 3:7； (3)按照质量比PLGA:羟基喜树碱=5 20:1来称取羟基喜树碱，并溶于步骤2所得有机溶液中； (4)将步骤(3)中配制的混合有机溶液按油水相体积比I:2飞滴加入超纯水中并高速祸旋振荡; (5)通过超声波破碎仪，将步骤4中涡旋振荡后的乳液，进行探头超声，超声功率为7 14W ； (6)将步骤5中超声后的乳液按体积比I:2飞滴加入超纯水中，连续搅拌3h左右，使有机溶剂完全挥发； (7)将步骤6进行完后的物料取出，4°C下10，000-13,OOOrpm离心收集固化的可降解聚合物納米粒子，并用蒸馏水清洗2-4次后冷冻干燥，即获得了以PLGA为核，磷脂及聚こニ醇化的磷脂为壳层并包覆有羟基喜树碱的复合型纳米粒子。
全文摘要
本发明公开了一种靶向复合型纳米粒子的制备方法，本发明将磷脂，聚乙二醇化磷脂以及连有RGD的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺作为乳化剂，采用二氯甲烷和乙醇的二元混合溶剂体系，利用一步乳化法，制备以PLGA为核，磷脂及聚乙二醇化磷脂为壳层的靶向复合型纳米粒子。并以羟基喜树碱为模型药物，制备了高载药量(18.9%)，高包封率(94.5%)的RGD靶向磷脂-聚合物复合纳米粒子。本发明所制备的靶向复合型纳米粒子表面的磷脂单层和聚乙二醇水化层能够大幅降低蛋白吸附，延长体内作用时间；复合型纳米粒子壳层中连有的RGD能有效促进纳米粒子与整合素高表达的肿瘤细胞或者肿瘤新生血管特异性的结合，提高局部药物浓度，从而使其具有更好的抗肿瘤效果。
文档编号A61K31/4745GK102772367SQ20121025969
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者刘杰, 杨哲, 蒋庆 申请人:中山大学