可吸入药物组合物的制作方法

可吸入药物组合物的制作方法
【专利摘要】可吸入药物组合物可以包括包含适于连续雾化的疏水性生物活性剂(例如CoQ10)的颗粒的水性分散体。由于其化学组成和制备方法，所述药物组合物显示出提供有利的气溶胶传输和输出的特殊物理化学性质。
【专利说明】可吸入药物组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月17日提交的美国临时申请号N0.61/498，505的优先权的权益，将其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
[0003]本发明一般地涉及可吸入药物组合物，包括其制备方法及其用途。本发明在各种实施方案中更特别地涉及具有包含疏水性生物活性剂(例如CoQlO)的颗粒的水性分散体且适于连续雾化的可吸入药物组合物。由于其化学组成和制备方法，所述药物组合物显示出提供有利的气溶胶传输和输出的特殊物理化学性质。
[0004]发明背景
[0005]癌症目前是发达国家中死亡的首要原因之一。肺癌是具有高死亡率及低长期存活率的癌症的一个实例。虽然研究已经极大地增加了对许多肿瘤发生的分子机制的理解，并且已提供了许多用于治疗包括肺癌的癌症的新途径，但是对于大多数恶性肿瘤的标准疗法仍然是全切除术(gross resection)、化疗和放射疗法。虽然不断获得成功,但是这些疗法的每一种都可以引起许多不期望的副作用。例如，外科手术可导致疼痛、对健康组织的外伤性损伤和瘢痕。放疗和化疗可引起恶心、免疫抑制、胃溃疡和继发性肿瘤发生。而且，出现这些极端副作用并不伴随相应 的高存活率。
[0006]向呼吸道递送治疗剂是治疗多种局部和/或全身疾病(包括肺癌)的一个途径。然而，将药剂递送至肺部的常规技术可能无效、低效和/或效力不足。例如，许多已知的方法产生具有液滴的气溶胶，所述液滴太大而不能将药物递送至肺和/或其太不一致而不能可靠地递送特定剂量。被开发出来以解决这些问题比如粒径的的颗粒形成技术，例如机械微粉化方法和基于溶液的相分离方法，可具有另外的局限。机械微粉化方法比如研磨可引起药物热降解和/或机械降解。喷雾干燥，用于微粉化药物物质的另一种方法，可导致收集小颗粒的困难。
[0007]发明简述
[0008]本发明提供可吸入药物组合物，其具有包括疏水性生物活性剂的颗粒的水性分散体。由于其化学组成和制备方法，所述药物组合物显示出提供有利的气溶胶传输和输出(包括连续雾化)的特殊物理化学性质。因此，本发明提供治疗包括癌症的疾病的改善的方法，及能够递送(包括吸入至肺)生物活性剂以帮助治疗疾病及其它病症的组合物。
[0009]由于肺的大量有效表面积位于深肺部，通过气雾剂递送颗粒至深肺部的周围肺泡有助于药物递送。相反，沉积在上呼吸道中的颗粒可以被粘膜纤毛活动梯(mucociliaryescalator)快速去除，接着转运至咽喉，并吞咽或通过咳嗽除去。本发明在各个方面和实施方案中提供递送通常难以被充分雾化的疏水性生物活性剂(例如包括完全疏水性、亲脂性和/或水溶性差的药物)至深肺部(以及，呼吸道的其它区域)。特别地，本发明可以提供疏水性药物的纳米分散体的连续雾化以用于治疗应用。
[0010]本发明的各个方面和实施方案的其它优点包括，但不限于高的气溶胶输出(例如，通过总气溶胶输出TAO测量的)；高的气溶胶传输(例如，如通过平均百分传输率APT测定的)；高的总喷射剂量(TED)，连续和稳定的气溶胶(例如，经历预定给药事件，非间断的)；一致的递送(例如，不同事件间可再现的)；递送高剂量的能力(例如，高沉积质量分数和/或连续递送)；计量剂量(例如，从小到大)的能力；区域(topically)、局部(locally)和/或系统递送药物的能力；高可呼吸部分；及其组合。显著地，本发明可以采用疏水性药物的水性纳米分散体(例如，与涉及单一、均相、药物溶液的现有技术方法相比较)实现这些优点。
[0011]在一个方面，本发明特征在于可吸入药物组合物，其包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体。所述组合物包括具有约30至于至500nm的平均直径的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质。疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1: 5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w，所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w，并且所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内。并且，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化。
[0012]在另一个方面，本发明特征在于可吸入药物组合物，其包含适用于连续雾化的脂质体颗粒分散体。所述组合物包含具有约30至500nm的平均直径的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质。疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1: 5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w，所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w，并且所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内。并且，当连续雾化时，所述组合物能够获得至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度。
[0013]在另一个方面，本发明特征在于可吸入药物组合物，其包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体。所述组合物包含具有约30至500nm的平均直径的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质。疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1: 5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w，所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w，并且所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内。并且，当连续雾化时，所述组合物经15秒能够获得至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED)。
[0014]在仍另一个方面，本发明特征在于可吸入药物组合物，其包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体。所述组合物包含具有约30至300nm的平均直径的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含CoQIO、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和水性分散介质。CoQ10:DPPC的比率为约5:1至约1:5，CoQlO占组合物的约0.1至6%w/w，且所述脂质体颗粒分散在水性分散介质内。并且，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化(或可选地，所述组合物特征可在于另一药代动力学性质，比如能够获得至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED))。
[0015] 在仍另一个方面，本发明特征在于可吸入药物组合物，其包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体。所述组合物包含具有约30至300nm的平均直径的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含CoQIO、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和水性分散介质。CoQ10:DSPC的比率为约5:1至约1:5，CoQlO占组合物的约0.1至6%w/w，且所述脂质体颗粒分散在水性分散介质内。并且，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化(或可选地，所述组合物特征可在于另一药代动力学性质，比如能够获得至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED))。
[0016]在仍另一方面，本发明特征在于可吸入药物组合物，其包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体。所述组合物包含具有约30至300nm的平均直径的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含CoQ1O、二肉豆蘧酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和水性分散介质。CoQ10:DMPC的比率为约5:1至约1:5，CoQlO占组合物的约0.1至6%w/w，且所述脂质体颗粒分散在水性分散介质内。并且，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化(或可选地，所述组合物特征可在于另一药代动力学性质，比如能够获得至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED))。
[0017]在仍另一个方面，本发明特征在于制备可吸入药物组合物的方法。所述方法包括步骤:(I)水化磷脂，从而形成水化的磷脂；(ii)混合所述水化的磷脂、疏水性生物活性剂和水性分散介质，从而得到混合物；和(iii)均质化该混合物，从而得到脂质体颗粒的分散体，其包含分散在水性分散介质内的磷脂和疏水性生物活性剂，且具有约30至500nm的平均直径。疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w,且所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w。并且，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化(或可选地，所述组合物特征可在于另一药代动力学性质，比如能够获得至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED))。
[0018]在仍另一个方面，本发明特征在于施用可吸入药物组合物的方法。所述方法包括步骤:(i)雾化脂质体颗粒的分散体，从而形成包括多个液滴的可呼吸气溶胶，所述液滴具有约I至5μπι的质量中值空气动力学直径(MMAD)，和(ii)向需要治疗的受试者的肺递送治疗有效量的疏水性生物活性剂。所述脂质体颗粒的分散体具有约30至500nm的平均直径，各个脂质体颗粒包含分散在水性分散介质内的疏水性生物活性剂和磷脂，疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1: 5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w，且所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w。并且，当向受试者施用时，所述组合物特征足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化(或可选地，所述组合物特征可在于另一药代动力学性质，比如能够获得至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED))。
[0019]在仍另一个方面，本发明特征在于通过包括下述步骤的方法制备的可吸入药物组合物:(i)水化磷脂，从而形成水化的磷脂；(ii)混合所述水化的磷脂、疏水性生物活性剂和水性分散介质，从而得到混合物；和均质化该混合物，从而得到脂质体颗粒的分散体，其包含分散在水性分散介质内的磷脂和疏水性生物活性剂，且具有约30至500nm的平均直径，其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w,且所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w。并且，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化(或可选地，所述组合物特征可在于另一药代动力学性质，比如能够获得至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED))。[0020]在仍另一个方面，本发明特征在于用于调整激光衍射粒径系统(laserdiffraction particle size system)以适应于连续测量连续气溶胶的方法。所述方法包括步骤:(i)提供一种激光衍射粒径系统，其包括:喷雾器储库、膜、激光束、透镜和吸气源；(?)将喷雾器储库定位以使得膜位于激光束的上缘上方且位于透镜和气溶胶去雾室中心之间的距离处；和(iii)将吸气源定位于激光束之下。调整的系统避免了在连续地测量连续雾化期间气溶胶的传输时由连续地排空气溶胶云室引起的透镜雾化。
[0021]在仍另一个方面，本发明特征在于用于连续地测量连续气溶胶的激光衍射粒径系统。所述系统包括(i)喷雾器储库，其定位使得膜位于激光束的上缘上方且位于透镜和气溶胶云室中心之间的距离处；和(ii)定位于激光束之下的吸气源。该系统避免了在连续地测量连续雾化期间的气溶胶传输时由连续地排空气溶胶云室引起的透镜雾化。
[0022]在仍另一个方面，本发明特征在于用于连续地测量连续气溶胶的方法。所述方法包括步骤:(i)向激光衍射粒径系统提供连续气溶胶，所述系统包括喷雾器储库，其定位以使得膜位于激光束的上缘上方且位于透镜和气溶胶云室中心之间的距离处，和位于激光束之下的吸气源；和(ii)在该系统避免由于连续地排空气溶胶云室引起的透镜雾化的同时连续地测量气溶胶的传输。
[0023]在仍另一个方面，本发明特征在于制备可吸入药物组合物且验证其平均百分传输率(APT)的方法。所述方法包括步骤:(i)水化磷脂，从而形成水化的磷脂；(ii)混合该水化的磷脂、疏水性生物活性剂和水性分散介质，从而得到混合物；(iii)均质化该混合物，从而得到脂质体颗粒的分散体，其包含分散在水性分散介质内的磷脂和疏水性生物活性剂，且具有约30至500nm的平均直径，其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w，且所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w ； (iv)雾化脂质体颗粒的分散体，从而形成包含多个液滴的可呼吸气溶胶，各个液滴包含脂质体颗粒的分散体且具有约I至5 μ m的质量中值空气动力学直径(MMAD) ； (v)向激光衍射粒径系统提供可呼吸气溶胶，所述系统包括喷雾器储库(其定位以使得膜位于激光束的上缘上方且位于透镜和气溶胶云室的中心之间的距离处)，和位于激光束之下的吸气源；和(vi)采用所述激光衍射粒径系统连续地测量气溶胶的传输，从而确定所述组合物是否具有预定的APT值的特征。
[0024]在不同的实施方案中，上述方面的任一个都可以与下述的任一个或多个特征、以及在详细说明和实施例中描述的任一个或多个特征组合。
[0025]在各个实施方案中，水性分散介质包括水或水性盐溶液。水性分散介质可以是缓冲液比如磷酸盐缓冲盐水。
[0026]在某些实施方案中，脂质体颗粒的分散体为包括多个水性液滴的连续可呼吸气溶胶的形式，该水性液滴包含脂质体颗粒的分散体且具有约I至5 μ m的质量中值空气动力学直径(MMAD)。
[0027]在某些实施方案中，所述组合物的特征在于经至少15分钟的连续雾化，APT为约50至100%。所述组合物的特征在于APT可以为约50至100%、约60至100%、约70至100%、约80至100%、约90至100%、约50至95%、约60至95%、约70至95%、约80至95%、约90至95%、约50至90%、约60至90%、约70至90%、约80至90%、小于约50%、小于约55%、小于约65%、小于约70%、小于约75%、小于约80%、小于约85%、小于约90%、小于约95%、小于约100%或其中的任何子范围或值。连续雾化的持续时间可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、20、25、30、35、40、50或60分钟。经至少15分钟的连续雾化，所述多个液滴可以具有约I至5 μ m的MMAD0
[0028]在各个实施方案中，所述组合物特征在于在贮存至少七天之后，APT为约50至100%。在贮存至少七天之后，所述脂质体颗粒具有约30至500nm的平均直径。贮存可以在环境条件或其它受控条件(例如，冰箱中)进行。
[0029]在某些实施方案中，所述组合物的特征可以在于一种或多种物理化学性质。所述组合物可以具有约0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2或1.3的流动指数(flowindex)。所述组合物可以具有约0.1、0.15、0.2、1、100或IlOcP的粘度。所述组合物可以具有约2.5、1.5、-2.5、-10、-50、-55或-60mV的ζ电势。所述组合物可以具有约25、30、
35、40、45或50mN/m的表面张力。所述组合物可以具有约11、12、13、14、15、16、17或18mPa的屈服应力。脂质体颗粒的分散体可以具有约30至100nm、50至150nm、30至300nm、100至400nm或200至300nm的平均直径。所述组合物可以具有约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7的多分散性指数(PDI)。所述组合物可以具有至少约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%的ΤΑ0。所述组合物可以具有经15秒至少约3，600,3, 900,4, 300或4，600 μ g的TED (例如，如通过DUSA测量的，参见实施例2)。所述组合物特征可以在于非牛顿流体特性。
[0030]在各个实施方案中，所述多个液滴可以具有约1、2、3、4或5μπι的质量中值空气动力学直径(MMAD)。所述多个液滴可以具有小于约2.5,2.4,2.3,2.2,2.1,2.0,1.9,1.8、
1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0,0.9,0.8,0.7,0.6 或 0.5 的几何标准偏差(GSD)。
[0031]在某些实施方案中，疏水性生物活性剂包括下述的一种或多种:镇痛剂、抗炎剂、驱肠虫药、抗心律不齐剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗凝剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、抗真菌剂、抗痛风剂、抗-高血压剂、抗疟疾剂、抗偏头痛药、抗毒蕈碱剂、抗肿瘤剂、勃起功能障碍改善剂、免疫抑制剂、抗原生动物剂、抗甲状腺剂、抗焦虑剂、镇静剂、催眠药、神经安定药、β -阻滞剂、心肌收缩药、皮质类固醇类、利尿剂、抗帕金森氏病剂、胃肠剂、组胺受体拮抗剂、角质层分离药、脂质调节剂、抗心绞痛剂、cox-2抑制剂、白细胞三烯抑制剂、大环内酯类、肌肉松弛剂、营养剂、阿片类镇痛药、蛋白酶抑制剂、性激素、刺激剂、肌肉松弛剂、抗骨质疏松剂、抗肥胖剂、认知增强剂、抗尿失禁剂、营养油、抗-良性前列腺肥大剂、必需脂肪酸、非必需脂肪酸及其组合。疏水性生物活性剂可以包括一种或多种疏水性抗炎类固醇、NSAID剂、抗菌剂、抗真菌剂、化疗剂、血管舒张剂(vasoldilator)或其组合。
[0032]在某些实施方案中，疏水性生物活性剂包括下述的一种或多种:acutretin、阿苯达唑、沙丁胺醇、氨鲁米特(aminogluthemide)、胺碘酮、氨氯地平、苯丙胺、两性霉素B、阿托伐他汀、阿托伐醌、阿奇毒素、巴氯芬、倍氯米松、benezepril、苯佐那酯、倍他米松、bicalutanide、布地奈德、安非他酮、白消安、布替萘芬、骨化二醇、卡泊三烯(calciprotiene)、骨化三醇、喜树碱(camptothecan)、坎地沙坦、辣椒素、卡马西平(carbamezepine)、胡萝卜素、塞来昔布、西立伐他汀(cerivistatin)、西替利嗪、氯苯那敏、胆钙化醇、西洛他唑、西咪替丁、桂利嗪、环丙沙星、西沙必利、克拉霉素、氯马斯汀、氯米芬、氯米帕明、氯吡格雷(clopidrogel)、可待因、辅酶Q10、环苯扎林、环胞菌素、达那唑、丹曲洛林、右氯苯那敏、双氯芬酸、双香豆素、地高辛、二氢表雄酮(dihydroepiandrosterone)、二氢麦角胺、二氢速留醇、地红霉素、多奈哌齐、依法韦仑、eposartan、麦角|丐化醇、麦角胺、必需脂肪酸源、依托度酸、依托泊苷、法莫替丁、非诺贝特、芬太尼、非索非那定、非那雄胺、氟康唑、氟比洛芬、氟伐他汀、磷苯妥英(fosphenytion)、夫罗曲普坦、呋喃唑酮、加巴喷丁、吉非罗齐、格列本脲、格列吡嗪、格列苯脲、格列美脲(glymepride)、灰黄霉素、卤泛群、布洛芬、厄贝沙坦、依立替康、二硝酸异山梨醇酯、异维A酸(isotreinoin)、伊曲康唑、伊维菌素、酮康唑、酮咯酸、拉莫三嗪、兰索拉唑、来氟米特、赖诺普利、洛哌丁胺、氯雷他定、洛伐他汀、L-甲状腺素(L-thryiOxine)、叶黄素、番茄红素、甲羟孕酮、米非司酮、甲氟喹、醋酸甲地孕酮、美沙酮、甲氧沙林、甲硝唑、咪康唑、咪达唑仑、米格列醇、米诺地尔、米托蒽醌、孟鲁司特、萘丁美酮、纳布啡、那拉曲坦(naratiptan)、奈非那韦、硝苯地平、尼索地平、尼鲁地平(nilutanide)、呋喃妥因、尼扎替丁、奥美拉唑、奥普瑞白介素(oprevelkin)、甾二醇(osteradiol)、奥沙普秦、紫杉醇、帕立骨化醇、帕罗西汀、喷他佐辛、吡格列酮、pizofetin、普伐他汀、泼尼松龙、普罗布考、黄体酮、假麻黄碱、吡斯的明、雷贝拉唑、雷洛昔芬、罗非考昔(refocoxib)、瑞格列奈、利福布汀(rifabutine)、利福喷汀(rifapentine)、利美索龙、利托那韦(ritanovir)、利扎曲普坦、罗格列酮(rosigiltazone)、沙奎那韦、舍曲林、西布曲明、柠檬酸西地那非、辛伐他汀、西罗莫司、螺内酯、舒马普坦、他克林、他克莫司、他莫昔芬、坦洛新、塔革雷汀(targretin)、他佐罗汀、替米沙坦、替尼泊苷、特比萘芬、特拉唑嗪(terzosin)、四氢大麻酹、噻加宾、噻氯匹唳、tirofibran、替扎尼定、托吡酯、托泊替康、托瑞米芬、曲马多、维A酸、曲格列酮、曲伐沙星、缴沙坦、文拉法辛、vertoporfin、氨己烯酸、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、扎鲁司特、齐留通、佐米曲坦、唑吡坦、吡嗪哌酯(zopiclone)及其组合。
[0033]在各个实施方案中，疏水性生物活性剂还包括选自下述的添加物:脱氧葡萄糖、脱氧葡萄糖盐、二羟基丙酮、琥珀酸盐、丙酮酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、乳酸盐、戊二酸盐及其组合。所述添加物可以是2-脱氧葡萄糖、2-脱氧葡萄糖磷酸盐、6-脱氧葡萄糖、6-脱氧葡萄糖磷酸盐、二羟基丙酮及其组合。
[0034]在某些实施方案中，疏水性生物活性剂包括CoQ1O。CoQlO可以在1位、4位或其组合处被添加物(additive)取代。
[0035]在某些实施方案中，疏水性的生物活性剂占组合物的约4%w/w或以下。疏水性生物活性剂可以占组合物的约6、5、4、3、2或l%w/w或以下。
[0036]在各个实施方案中，磷脂包括下述的一种或多种:卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺及其组合。磷脂可以包括DPPC、DSPC、DMPC或其组合。磷脂可以为基本上纯的磷脂。磷脂可以占组合物的约3%w/w或以下。
[0037]在某些实施方案中，疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约1:1、4:3或4:2.5。疏水性生物活性剂:磷脂的比例可以为约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或其之间
的任何值。
[0038]在某些实施方案中，磷脂与下述的一种或多种组合:吸附剂、消泡剂、酸化剂、碱化齐?、缓冲剂、抗微生物剂、抗氧化剂、粘合剂、增溶剂、溶剂、粘度调节剂、保湿剂、增稠剂及其组合。可选地，所述组合物可以基本上由疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质组成。[0039]在各个实施方案中，所述组合物包括小于组合物的约1.0%w/v的量的氯化钠。所述组合物可以包括使该组合物与人肺基本上等渗的量的盐。
[0040]在某些实施方案中，所述分散体为悬浮液、纳米悬浮液、乳液或微乳液。
[0041]在某些实施方案中，所述方法还包括雾化脂质体颗粒的分散体，从而形成包括多个液滴的可呼吸气雾剂，各个液滴包含脂质体颗粒的分散体且具有约I至5 μ m的质量中值空气动力学直径(MMAD)。
[0042]在各个实施方案中，混合包括以约10，000至20，OOOrpm且在50至65°C下高剪切混合至多约5分钟。混合可以持续至多约1、2、3、4或5分钟。混合可以在约10，000、11，000、12，000、13，000、14，000、15，000、16，000、17，000、18，000、19，000 或 20，OOOrpm 下进行。混合可以在约50、55、60或65°C下进行。温度可以根据使用的疏水性生物活性剂的熔点变化。
[0043]在某些实施方案中，均质化包括微流化。均质化可以包括超声均质化。均质化可以包括在约30，OOOpsi和约50至65°C下高压均质化约1_50轮。均质化可以进行约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 轮。压力可以为约 25，000,26, 000,27, 000,28, 000、29，000,30, 000,31, 000,32, 000,33, 000,34, 000 或 35，OOOpsi0 温度可以为约 50、55、60 或650C。温度可以根据使用的疏水性生物活性剂的熔点变化。
[0044]在某些实施方案中，雾化包括振动筛网喷雾。用于连续喷雾的任何合适的方法都可以用于本发明。
[0045]在各个实施方案中，递送实现至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%的沉积质量分数(mass fraction deposited)。
[0046]在某些实施方案中，递送实现向肺的局部递送而基本上没有全身递送。
[0047]在某些实施方案中，递送获得在施用后至少48小时肺中疏水性生物活性剂升高的量。
[0048]在各个实施方案中，当连续雾化时，所述组合物能够实现至少约900、800、700、600、500、400、300、200或100 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度。应当理解所记载的湿肺组织浓度特别地受到受试者、施用方法和制剂等的影响。因此，在各个实施方案中，生物活性剂的浓度可以为治疗足够或治疗期望量的所使用具体生物活性剂。
[0049]在某些实施方案中，递送治疗有效量的疏水性生物活性剂包括计量生物活性剂的剂量。
[0050]在某些实施方案中，受试者患有癌症。所述癌症可以为肺癌。更通常地，所述受试者可以患有任一种或多种影响呼吸道的疾患，包括，但不限于下述的一种或多种:哮喘、变态反应、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、急性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、肺炎、结核病、肺水肿、急性呼吸窘迫综合征、肺尘埃沉着病、间质性肺病、肺水肿、肺栓塞、肺动脉高血压、胸腔积液、气胸、间皮瘤、肌萎缩性侧索硬化、重症肌无力和肺病。
[0051]在 各个实施方案中，组合物不包括调理作用缩减剂(opsonization reducer)(例如，干扰雾化的调理作用缩减剂)。例如，所述组合物可以特别地排除聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物，比如泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188 (po1xymer188))、普流尼克、Lutrol和Superonic ο在另一个实例中，所述组合物可以特别地排除各种链长的聚乙二醇(PEG)、多糖、其他含PEG的共聚物、泊洛沙姆(poloxamine)等。可选地,根据本发明的制剂可以包括基本上不会影响雾化的量的一种或多种调理作用增强剂，例如，如果该调理作用增强剂的量赋予所述制剂另外期望的性质。在一个实施方案中，所述组合物包括总组合物的0.001-5%重量的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物。
[0052]通过下述附图和实施例进一步详细描述本发明，所述附图和实施例仅用于阐述的目的而不是限制性的。
【专利附图】

【附图说明】
[0053]图1A显示使用振动筛网喷雾器雾化药物分散体的示意图。图1B显示几种制造方法的示意图。
[0054]图2显示原料粉末CoQlO的X射线衍射图。
[0055]图3显示原料粉末CoQlO的差示扫描量热温谱图。
[0056]图4显示原料粉末CoQlO的扫描电子显微(SEM)图像。
[0057]图5显示使用不同的制备方法制备的CoQlO分散体的粒径分布。
[0058]图6显示在微流化器(microfluidizer)中制备后和在7天之后，通过激光衍射(LD)获得的CoQlO水性分散体的粒径分布(制剂A，表1)。
[0059]图7显示在微流化器中制备后和在7天之后，CoQlO水性分散体的Z均值和PdI值(制剂A，表1)。在采用不同的微流化轮次制备且在制备后分析的制剂中，和在第O和7天比较同一制剂时，都没有发现 了药物粒径分布特征(Z-均值和PdI)的统计学差异。
[0060]图8显示使用卵磷脂(上面)或DPPC (下面)在微流化器中制备之后，CoQlO的水性分散体(制剂B，表1)的流体动力学直径和多分散性。(*当与10轮比较时P≤0.05 ;§当与采用相同微流化轮次制备的卵磷脂分散体比较时没有统计学差异)。
[0061]图9A显示与吸入池偶联的Malvern Spraytec⑧。图9B显示具有水平位置的吸入池的Malvern Spraytec ?的示意图。图9c显示结合下述实施例讨论的“开放台(openbench)”方法的示意图(距离:膜和激光束的上缘之间:25mm;透镜和气溶胶云中心之间:25mm ;在激光束下方的空气抽吸:IOcm)。
[0062]图10显示CoQlO的卵磷脂分散体(制剂C,表1)的传输图(transmittogram)。结果表示为相对于CoQlO分散体喷雾15分钟的百分传输率的平均值(n=3)。所述曲线的线性回归分析的斜率值作为气溶胶产生的稳定性的量度评价。
[0063]图11显示在15分钟喷雾过程中CoQlO的卵磷脂分散体(制剂C，表1)喷雾的传输图的斜率(上面)和总气溶胶输出(ΤΑ0-下面)。(*与其它制剂相比，P≤0.05)
[0064]图12显示在微流化器中制备之后，使用激光衍射(左面)和动态光散射(右面)进行的CoQlO水性分散体(制剂C，表1)的粒径分布分析。C与制备后分析的制剂相比，P ≤ 0.05 ； §与第7天的其它制剂相比，P≤0.05)
[0065]图13显示以不同微流化轮次处理的CoQlO制剂(制剂C，表1)有关的ζ电势和表面张力值。柱和误差条分别表示平均值和标准误差(对于?电势，η=10，和对于表面张力，η=5)。表面张力测量期间的温度为25°C （与10轮相比时，P≤0.05，§没有统计学差异)。
[0066]图14显示以不同微流化轮次处理的CoQlO水性分散体(制剂C，表1)的Herschel-Bulkley模型的元素。没有发现统计学差异。
[0067]图15显示用于适应于喷雾器的用于干粉吸入器(DPI)的剂量均匀取样装置(DUSA)的示意图。
[0068]图16显示在微流化器中50轮之后，来自CoQlO的水性分散体的激光衍射技术的粒径分布。结果表示为平均值土标准差(n=3)。一些标准差太小而在图中不可见。
[0069]图17显示在微流化器中50轮之后的CoQlO水性分散体的Z-均值和PdI值。结果表示为平均值土标准差(n=3)。一些标准差太小而在图中不可见(n=3)。§没有统计学差异。
[0070]图18显示CoQlO分散体的ζ电势。结果表示为平均值土标准差(η=3)。*与合成磷脂相比，Ρ〈0.05。
[0071]图19显不CoQlO分散体的表面张力。结果表不为平均值土标准误差(η≥5)。测量期间的温度值分别为25°C、25°C、19°C和17°C。§没有统计学差异。
[0072]图20显示用于CoQlO的水性分散体的Herschel-Bulkley模型的元素，表示为平均值土标准差(n=3)。DSPC制剂的屈服应力不呈现，因为其遵循幂定律(Power Law)模型。一些标准差太小而在图中不可见。*P〈0.05.§没有统计学差异。
[0073]图21显示水性分散体的一般流动曲线的示例示意图。
[0074]图22显示CoQlO分散体的流变行为。以不同标度呈现的图表表示为平均值土标准差(η=3) ο
[0075]图23显示盐水(对照)及CoQlO的卵磷脂、DMPC、DPPC和DSPC分散体的传输图。结果表示为相对于CoQlO分散体喷雾15分钟的百分传输率的平均值(n=3)。所述曲线的线性回归分析的斜率值作为气溶胶产生的稳定性的量度评价。
[0076]图24显不相对于CoQlO分散体喷雾15分钟的传输图的斜率(上面)和总气雾剂输出，TAO (下面)，表示为平均值土标准差(n=3)。§没有统计学差异。
[0077]图25显示了 CoQlO分散体的来自NGI的TED (上面)和来自适应于喷雾器的DPI的DUSA的TED (下面)。结果表示为在15分钟喷雾事件的初始和最终阶段的15秒时间内沉积的总药物的平均值土标准差(n=3)。TED:总喷射剂量；DUSA:剂量均匀取样装置；DP1:干粉吸入器。*当与合成磷脂相比时P〈0.05。t在喷雾事件内P〈0.05。§彼此比较没有统
计学差异。$与其它合成磷脂相比没有统计学差异。
[0078]图26显示使用Aeroneb Pro ?喷雾器,在15L/min的流速下，CoQlO的卵磷脂、DMPC、DPPC和DSPC分散体的体外沉积分布。结果表示为在15分钟喷雾事件的初始和最终阶段的15秒时间内沉积的总药物百分数的平均值土标准差(n=3)。
[0079]图27显示使用Aeroneb Pro ?喷雾器,在15L/min的流速下，CoQlO的卵磷脂、DMPC、DPPC和DSPC分散体的体外沉积分布。结果表示为在15分钟喷雾事件的初始和最终阶段的15秒时间内沉积的药物量的平均值土标准差(n=3)。
[0080]图28显示使用Aeroneb Pro ?喷雾器,在15L/min的流速下，CoQlO的卵磷脂、DMPC、DPPC和DSPC分散体的空气动力学性质。结果表示为在15分钟喷雾事件初始和最终阶段的15秒时间内MMAD或GSD的平均值土标准差(n=3)。*在喷雾事件内P〈0.05。§彼此相比时P〈0.05。
[0081]图29A显示所研究制剂的TED NGI和TED DUSA值。图29B显示使用Aeroneb Pro?喷雾器，在15L/min的流速下，来自CoQlO的卵磷脂DMPC、DPPC和DSPC分散体的雾化细颗粒的估计总剂量(FPDet)和分数(FPF)。结果表示为与在15分钟喷雾事件初始和最终阶段的15秒期间相关的平均值土标准差(n=3)。*当与合成磷脂相比时P〈0.05。t在喷雾事件内P〈0.05。§彼此比较没有统计学差异。；[:当彼此相比时P〈0.05。
[0082]图30显示使用Aeroneb Pro ?喷雾器雾化15分钟的CoQlO分散体的平均Dv (50)(n=3)。
[0083]图31显示用于向老鼠喷雾CoQlO的示例仅鼻(nose-only)给药装置。将六只小鼠单独地限制在管中，使它们的鼻子暴露于腔室。喷雾器位于腔室和风扇之间，所述风扇提供足够的气流以向腔室填充药物气溶胶。该管道系统开环以避免药物再循环。
[0084]图32显示仅鼻吸入腔室内CoQlO的估计的药物浓度-时间曲线。
[0085]图33显示在15分钟期间喷雾至仅鼻吸入腔室内的小鼠的来自合成磷脂制剂的CoQlO的累计估计剂量。
[0086]图34显示在15分钟期间喷雾至仅鼻吸入腔室中的小鼠后，相对于湿肺组织标准化的来自合成磷脂分散体的CoQlO的平均肺浓度。误差条指示标准差(n=6)。
[0087]图35显示在15分钟期间喷雾至仅鼻吸入腔室内的小鼠后，相对于动物体重标准化的来自合成磷脂分散体的至CoQlO平均肺浓度。误差条指示标准差(n=6)。
[0088]图36显示在15分钟喷雾给药后0.5和I小时，小鼠鼻腔中CoQlO的沉积。结果
表示为平均值土标准差(n=6)。*与对照组相比P〈0.05。t同一组内比较时P〈0.05。
[0089]图37显示含有不同浓度的CoQlO的DMPC-稳定分散体雾化的传输图。
[0090]图38显示与包括特定调理作用缩减剂的静脉内制剂相比，DMPC-和DSPC-稳定的分散体雾化的传输图。图39-41显示与图38相关地研究的制剂的其它特征。根据下述详细说明、实施例和权利要求书，本发明的其它特征和优点会是很明显的。
[0091]发明详述
[0092]如以上讨论的，本发明提供可吸入药物组合物，其具有包括疏水性生物活性剂的颗粒的水性分散体。由于其化学组成和制备方法，所述药物组合物显示出提供有利的气溶胶传输和输出——(包括稳定的连续雾化)——的特殊物理化学性质。
[0093]CoQlO用作一种示例性的疏水性生物活性剂。辅酶QlO，也称为CoQIO、泛醌或癸烯醌，天然存在于体内。CoQlO参与线粒体呼吸中的电子传递和质子传递。因此，改变该抗氧化剂的水平可对生物学活动比如衰老、神经退行性疾病和心血管疾病及癌症具有作用。
[0094]CoQlO是一种水溶性差的化合物，以黄色或橙色结晶粉末形式存在。文献中报道的CoQlO的最高血浆浓度为10.7 μ mol/L (约9 μ g/ml)，其是通过施用溶解的口服剂型(例如，市售可获得的食品补充剂或“营养物”)获得的。然而，最大耐受剂量(MTD)仍未确定。本发明提供用于以改善药效学反应的有利药代动力学特性肺部递送的CoQlO剂型，用于治疗呼吸系统恶性肿瘤。通过将高的药物量递送至疾病部位，可以使用较低剂量(与静脉内施用或口服施用相比较)。 [0095]下述说明书提供关于本发明组合物(包括疏水性生物活性剂、磷脂、水性分散介质及其它组分)、制备方法(包括混合、均质化和雾化)和治疗方法(包括药代动力学、药效学和适应症)的进一步详细内容。最后，详细说明提供了本发明的示例性实施例，包括实施例1:适应于连续喷雾的磷脂稳定的CoQlO亚微米水性分散体的开发和表征；实施例2:基于CoQlO水性分散体的流变行为预测体外雾化特性；实施例3: CoQlO可吸入制剂在小鼠中的肺部沉积和系统分布；实施例4:使用HPLC的疏水性药物的低浓度范围测定；实施例5:在适于连续喷雾的磷脂纳米分散体中合适的疏水性药物浓度的确定；和实施例6:测定对于肺施用磷脂包封的疏水性生物活性剂的分散体的炎性反应。
[0096]组合物
[0097]在各个实施方案中，根据本发明的可吸入药物组合物包括适于连续雾化的颗粒的水性分散体。所述颗粒各自包括疏水性生物活性剂和磷脂，且分散在水性分散介质内。在某些实施方案中，颗粒为脂质体颗粒，或包括一小部分脂质体颗粒。在某些实施方案中，所述组合物可以基本上由疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质组成。然而，包括一种或多种另外的组分的其它实施方案是可能的。以下依次讨论包括在本发明组合物中的各种组分。
[0098]疏水性生物活性剂
[0099]在多个实施方案中，一种或多种疏水性生物活性剂(也称为亲脂性生物活性剂)可以在可吸入药物组合物中制备。疏水性生物活性剂相对不溶于水。例如，疏水性生物活性剂可以具有约1000份的水中小于约1份生物活性剂的水中溶解度。
[0100]合适的亲脂性生物活性剂可以包括，但不限于镇痛剂、抗炎剂、驱肠虫药、抗心律不齐剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗凝剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、抗真菌剂、抗痛风剂、抗高血压剂、抗疟疾剂、抗偏头痛药、抗毒蕈碱剂、抗肿瘤剂、勃起功能障碍改善剂、免疫抑制剂、抗原生动物剂、抗甲状腺剂、抗焦虑剂、镇静剂、镇静剂、催眠药、神经安定药、β -阻滞剂、心肌收缩药、皮质类固醇类、利尿剂、抗帕金森氏病剂、胃肠剂、组胺受体拮抗剂、角质层分离药、脂质调节剂、抗心绞痛剂、COX-2抑制剂、白细胞三烯抑制剂、大环内酯类、肌肉松弛剂、营养剂、阿片类镇痛药、蛋白酶抑制剂、性激素、刺激剂、肌肉松弛剂、抗骨质疏松剂、抗肥胖剂、认知增强剂、抗尿失禁剂、营养油、抗-良性前列腺肥大剂、必需脂肪酸、非必需脂肪酸、其组合等等。
[0101]合适的疏水性活性剂的非限制性实例包括，但不限于acutretin、阿苯达唑、沙丁胺醇、氨鲁米特、胺碘酮、氨氯地平、苯丙胺、两性霉素B、阿托伐他汀、阿托伐醌、阿奇毒素、巴氯芬、倍氯米松、benezepril、苯佐那酯、倍他米松、bicalutanide、布地奈德、安非他酮、白消安、布替萘芬、骨化二醇、卡泊三烯、骨化三醇、喜树碱(camptothecan)、坎地沙坦、辣椒素、卡马西平、胡萝卜素、塞来昔布、西立伐他汀(、西替利嗪、氯苯那敏、胆钙化醇、西洛他唑、西咪替丁、桂利嗪、环丙沙星、西沙必利、克拉霉素、氯马斯汀、氯米芬、氯米帕明、氯吡格雷、可待因、辅酶Q10、环苯扎林、环胞菌素、达那唑、丹曲洛林、右氯苯那敏、双氯芬酸、双香豆素、地高辛、二氢表雄酮、二氢麦角胺、二氢速留醇、地红霉素、多奈哌齐、依法韦仑、eposartan、麦角|丐化醇、麦角胺、必需脂肪酸源、依托度酸、依托泊苷、法莫替丁、非诺贝特、芬太尼、非索非那定、非那雄胺、氟康唑、氟比洛芬、氟伐他汀、磷苯妥英、夫罗曲普坦、呋喃唑酮、加巴喷丁、吉非罗齐、格列本脲、格列吡嗪、格列苯脲、格列美脲、灰黄霉素、齒泛群、布洛芬、厄贝沙坦、依立替康、二硝酸异山梨醇酯、异维A酸、伊曲康唑、伊维菌素、酮康唑、酮咯酸、拉莫三嗪、兰索拉唑、来氟米特、赖诺普利、洛哌丁胺、氯雷他定、洛伐他汀、L-甲状腺素、叶黄素、番茄红素、甲羟孕酮、米非司酮、甲氟喹、醋酸甲地孕酮、美沙酮、甲氧沙林、甲硝唑、咪康唑、咪达唑仑、米格列醇、米诺地尔、米托蒽醌、孟鲁司特、萘丁美酮、纳布啡、那拉曲坦、奈非那韦、硝苯地平、尼索地平、尼鲁地平、呋喃妥因、尼扎替丁、奥美拉唑、奥普瑞白介素、甾二醇、奥沙普秦、紫杉醇、帕立骨化醇、帕罗西汀、喷他佐辛、吡格列酮、pizofetin、普伐他汀、泼尼松龙、普罗布考、黄体酮、假麻黄碱、吡斯的明、雷贝拉唑、雷洛昔芬、罗非考昔、瑞格列奈、利福布汀、利福喷汀、利美索龙、利托那韦、利扎曲普坦、罗格列酮、沙奎那韦、舍曲林、西布曲明、柠檬酸西地那非、辛伐他汀、西罗莫司、螺内酯、舒马普坦、他克林、他克莫司、他莫昔芬、坦洛新、塔革雷汀、他佐罗汀、替米沙坦、替尼泊苷、特比萘芬、特拉唑嗪、四氢大麻酹、噻加宾、噻氯匹唳、tirofibran、替扎尼定、托吡酯、托泊替康、托瑞米芬、曲马多、维A酸、曲格列酮、曲伐沙星、缬沙坦、文拉法辛、vertoporfin、氨己烯酸、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、扎鲁司特、齐留通、佐米曲坦、唑吡坦、吡嗪哌酯、其组合、等。也可以使用上列生物活性剂的盐、异构体和/或其它衍生物以及其组合。
[0102]在各个实施方案中，CoQlO可以是疏水性生物活性剂(例如，单独或与一种或多种另外的生物活性剂组合)。CoQIO，本文有时称为CoQlO或癸烯醌，是一种流行的营养补剂，且可以在营养品店、健康食品店、药房等作为维生素样补充剂以胶囊的形式找到，推测其有助于通过泛醇-CoQlO (泛醌)的还原形式-的抗氧化性质保护免疫系统。如本文使用的，CoQlO也可以包括其衍生物，包括例如泛醇。类似地，CoQlO也可以包括泛醌和泛醇的类似物和前体化合物，及其组合。
[0103]在各个实施方案中，亲脂性的生物活性剂比如辅酶QlO可以与其它生物活性剂或化合物联合用于体内施用。同样地，任何生物活性剂都可以与另外的添加物和/或赋形剂组合。所述其它生物活性剂、添加物和/或赋形剂可以是疏水性的或亲水性的。
[0104]可以根据本发明使用生物活性剂的组合治疗癌症，包括但不限于肺癌。例如，亲脂性生物活性剂比如CoQlO可以作为混合物或共混物与脱氧葡萄糖类组合，包括2-脱氧葡萄糖和/或2-脱氧葡萄糖盐、6-脱氧葡萄糖和/或6-脱氧葡萄糖盐，并体内施用于患者。合适的盐可以包括磷酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、羟基丁酸盐、其组合等。在某些实施方案中，所述盐可以是磷酸盐，比如2-脱氧葡萄糖磷酸盐、6-脱氧葡萄糖磷酸盐、其组合等。在其它实施方案中，泛醌或泛醇的苯醌或醌醇环可以在I位、4位或两个位置被脱氧葡萄糖或其盐取代，比如2-脱氧葡萄糖或6-脱氧葡萄糖或其盐，包括2-脱氧葡萄糖磷酸盐或6-脱氧葡萄糖磷酸盐，使得取代的泛醌或泛醇然后施用于患者。
[0105]类似地，二羟基丙酮可以作为混合物或共混物与CoQlO组合，并施用于患者体内。在这样的实施方案中，泛醌或泛醇的苯醌或醌醇环可以在I位、4位或两个位置被二羟基丙酮取代，使得取代的泛醌或泛醇然后施用于患者。在其它实施方案中，可以与亲脂性生物活性剂比如辅酶QlO —起施用的化合物包括琥珀酸盐、丙酮酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、乳酸盐、戊二酸盐、其组合等，具体实例包括但不限于琥珀酸钠、琥珀酸钾、其组合等。
[0106]磷脂
[0107]在各个实施方案中，生物活性剂包含在脂质体内和/或另外用磷脂一起稳定。月旨质体可以由一种或多种脂质体形成化合物如磷脂形成。类似地，生物活性剂和磷脂可以形成其它物理排列，比如混合物和分散体。根据本发明的组合物可以主要包括脂质体排列、一小部分脂质体与其它排列或者可以基本上不含脂质体。虽然各种化合物及其组合都是可能的，但最终组合物必须最后显示出本发明的特定物理化学性质，其提供有利的气溶胶传播和输出、药代动力学和/或药效学。[0108]用于形成脂质体的合适的磷脂和/或磷脂衍生物/类似物包括，但不限于卵磷月旨、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱(例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺、其组合等。
[0109]在一个实施方案中，所述磷脂为卵磷脂。卵磷脂可以衍生自蛋或大豆。这样的卵磷脂包括市售可获得的那些，如PH0SPH0LIP0N ? 8SG, PH0SPH0LIP0N ? 90G和PH0SPH0LIP0N ? 90H(PH0SPH0LIP0N ? 90G 的全氢化形式)，来自 American LecithinCompany, Oxford, CT(Lipo Chemicals, Inc.的部分-Lipo磷脂目录列出了其它可能合适的磷脂，例如适用于非肠道使用的那些)。其它合适的卵磷脂包括可获得的LECIN0LS-10 ? 卵憐脂，例如来自 Nikko Chemicals, NOF (Japan)，Lipo Chemicals, Inc.和 GenzymeCorporation,以及其它商业供应商。可选地，在某些实施方案中，可能有利地是选择比卵磷脂亲水性低的一种或多种磷脂。 [0110]可以选择赋予得到的脂质体囊泡负表面电荷的磷脂，其可以减少处理时间和加工能量，并且其可以帮助形成稳定的脂质体和雾化。例如，可以使用高磷脂酰胆碱含量的卵磷脂(例如，二棕榈酰磷脂酰胆碱或二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱)来形成脂质体。示例的高磷脂酰胆碱卵磷脂为PHOSPHOLIPON ? 85G，其包含最少85%的基于亚油酸的磷脂酰胆碱。该卵磷脂易于使用且能够在低加工温度(约20°C至约55°C )下产生亚微粒米脂质体而无需加入任何其它特殊添加剂。PHOSPHOLIPON? SdG除了磷脂酰胆碱之外，还包含约5_7%的磷脂酸。
[0111]水性分散介质
[0112]为了形成根据本发明的水性分散体，需要水介质例如水。水性分散介质的实例包括水、盐水(例如，等渗盐水、使最终制剂与患者的肺等渗的盐溶液)和水性缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)。其它合适的水性分散介质可以包括与期望的化学组成、制造方法和/或医学用途相容的其它水溶液。
[0113]另外的组分
[0114]根据本发明的药物组合物除了一种或多种生物活性剂、一种或多种磷脂和一种或多种水性分散介质之外，还可以包括一种或多种另外的组分。另外的组分可以用于，例如增强含有亲脂性生物活性剂的脂质体的制剂、改善脂质体的整体流变学和加工性质及确保得到的脂质体浓缩物在贮存期间的微生物完整性。这样的组分包括，但不限于吸附剂、消泡剂、酸化剂、碱化剂、缓冲剂、抗微生物剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、生育酚、丁基化羟基甲苯(BHT)、多酚、植酸)、粘合剂、生物学添加剂、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA) 二钠、EDTA四钠、偏硅酸钠等)、变性剂、外用镇痛药(例如阿司匹林、非甾体抗炎剂等)、甾体抗炎药物(比如氢化可的松等)、防腐剂(例如咪唑烷基脲、二偶氮烷基脲(diazolidinylurea)、苯氧基乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯等)、还原剂、增溶剂、溶剂、粘度调节剂、保湿剂、增稠剂、表面活性剂、填充剂、稳定剂、聚合物、蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、吸收促进剂及其组合。这样的另外的组分的存在量可以为分散体的0.001%重量至约10%重量。
[0115]本发明中可使用的且同时其自身潜在地具有一些活性(例如，作为抗氧化剂)的赋形剂和辅剂通常包括增强活性剂的效率和/或功效的化合物。给定的可呼吸聚集物中含有超过一种赋形剂、辅剂或者甚至活性剂也是可能的。
[0116]可以选择赋形剂，并在药物或生物活性剂颗粒形成之前或之后加入，以便使该药物或生物活性剂颗粒能够均匀地混合用于合适地施用。赋形剂可以包括上述描述为适用于形成脂质体的那些。其它合适的赋形剂包括聚合物、吸收增强剂、溶解增强剂、溶解速率增加剂、稳定性增强剂、生物粘性剂、控释剂、流动助剂和加工助剂。在某些实施方案中，合适的赋形剂包括纤维素醚、丙烯酸聚合物、胆盐及其组合。其它合适的赋形剂包括在由 American Pharmaceutical Association 和 The Pharmaceutical Society of GreatBritain, the Pharmaceutical Press, 1986 联合出版的 Handbook of PharmaceuticalExcipients中详细描述的那些，将其相关部分并入本文作为参考。这样的赋形剂为市售可获得的和/或可以通过本领域技术人员的能力之内的技术制备。
[0117]也可以单独或组合地选择赋形剂以通过改善流动性或生物利用度或者控制或延迟活性剂的释放来调整有效成份的预期功能。赋形剂的特定非限制性实例包括:SPAN80、TWEEN80、BRIJ35, BRIJ98, PLURONICS、SUCR0ESTER7、SUCR0ESTER I1、SUCR0ESTER15、十二烷基硫酸钠、油酸、laureth-9、laureth-8、月桂酸、维生素 E、TPGS, GELUCIRE50/13、GELUCIRE53/10、LABRAFIL、二棕榈酰磷脂酰胆碱、乙醇酸和盐、脱氧胆酸和盐、夫西地酸钠、环糊精、聚乙二醇、Iabrasol、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泰洛沙泊、纤维素衍生物、聚乙氧基化蓖麻油衍生物、其组合等。
[0118]合适的保湿剂的实例包括，但不限于多元醇和多元醇衍生物，包括甘油、双甘油、三甘油、乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇(本文中有时也称为1，2_戊烷二醇)、异戊二醇(I, 4-戊烷二醇)、1，5-戊烷二醇、己二醇、赤藓醇、1，2，6-己三醇、聚乙二醇(“PEG” )比如 PEG-4、PEG-6、PEG-7、PEG-8、PEG-9、PEG-10, PEG-12, PEG-14、PEG-16、PEG-18、PEG-20及其组合、糖和糖衍生物(特别地包括果糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖醇、甘露醇、肌醇、山梨醇、山梨醇硅烷二醇、蔗糖、海藻糖、木糖、木糖醇、葡糖醛酸及其盐)、乙氧基化山梨醇(Sorbeth-6、Sorbeth-20、Sorbeth-30、Sorbeth-40)、其组合等。在其它实施方案中，可以使用二醇类比如丁二醇、1，2-戊烷二醇、甘油、1，5-戊烷二醇、其组合等作为保湿剂。当使用时，任一种上述保湿剂，包括其组合，可以以第二分散体的约0.1%重量至约20%重量的量存在,在实施方案中,第二分散体的约1%重量到约5%重量。
[0119]在某些实施方案中，防腐剂比如苯氧基乙醇和保湿剂比如丙二醇都可以包括在制剂中。当与苯氧基乙醇组合时，丙二醇可以提供保湿活性并有助于浓缩物的防腐。苯氧基乙醇和丙二醇混合物可以为水溶性的和非挥发性的。该实施方案与使用脂质体分散体的供应商通常使用的乙醇防腐相反。当存在时，这类防腐剂的存在量可以为制剂的约0.01%重
量至约3%重量。
[0120]某些实施方案可以包括分散体稳定剂。分散体稳定剂的实例包括聚氧乙基化即，PEG化)蓖麻油(Cremophor⑧EL)、聚氧乙基化氢化蓖麻油(Cremophor ? RH40)、生育酹聚乙二醇琥珀酸酯(PEG化维生素E、维生素E TPGS)、聚山梨醇酯(Tweens ? )、脱水山梨醇脂肪酸酯(Spans (R))、胆汁酸和胆酸盐及DMPC。
[0121]某些实施方案可以排除调理作用缩减剂(例如，可能干扰雾化的调理作用缩减剂)。例如，所述组合物可以特别地排除聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物，比如泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)、普流尼克、Lutrol和Superonic。在另一个实施例中，所述组合物可以特别地排除各种链长的聚乙二醇(PEG)、多糖、其他含PEG的共聚物、泊洛沙姆等。可选地，根据本发明的制剂可以包括基本上不干扰雾化的量或种类(例如，合适的HLB)的一种或多种调理作用增强剂，例如，如果调理作用增强剂的量赋予所述制剂另外期望的性质。在一个实施方案中，所述组合物包括总组合物的0.001-5%重量的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物。在另一个实施方案中，所述制剂包括相对少量的一种或多种亲水性聚合物，以改善稳定性和增加TAO而同时保持有效连续的雾化。
[0122]制剂可以包括肺表面活性物质和/或粘液溶解剂。合适的肺表面活性物质包括，但不限于具有天然肺表面活性剂功能的肺表面活性剂制品。这些可以包括天然和合成的肺表面活性剂。在各个实施方案中，可以使用包含磷脂和/或肺表面活性剂蛋白的组合物。
[0123]可以用作肺表面活性剂的示例性的磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)和/或磷脂酰甘油(PG)。其它合适的磷脂包括各种磷脂的混合物，例如比例为约7至约3:约3至约7的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)的混合物。
[0124]可以作为肺表面活性剂使用的市售产品包括⑶ROSURF ? (INN: PORACTANTALFA) (Serono, Pharma GmbH, Unterschleipheim), 一种来自均质化猪科动物肺的天然表面活性剂 SURVANTA ⑧(INN:BERACTANT) (Abbott GmbH, Wiesbaden),牛肺的提取物；ALVE0FACT ? (INN:B0VACTANT) (Boehringer Ingelheim)，牛肺的提取物；EX0SURF ?(INN:C0LF0SCERIL PALMITATE) (GlaxoSmithKline)，包含合成磷脂的赋形剂；SURFACTEN?(INN: SURFACTANT-TA) (Mitsubishi Pharma Corporation),从牛肺提取的肺表面活性剂；INFASURF? (INN:CALFACTANT) (Forest Pharmaceuticals), 一种从小牛肺提取的表面活性剂；ALEC ? (INN:PUMACTANT) (Britannia Pharmaceuticals)，DPPC 和 PO 的人工表面活性剂;和BLES ? (BLES Biochemical Inc.)，一种牛脂质提取物表面活性剂。
[0125]合适的肺表面活性剂蛋白包括从天然来源获得的蛋白比如肺灌洗液或来自羊水的提取物，和通过遗传工程或化学合成制备的蛋白。在某些实施方案中，可以使用被命名为SP-B(表面活性剂蛋白-B)和SP-C(表面活性剂蛋白-C)及其修饰的衍生物(包括该蛋白质的重组形式)的肺表面活性剂蛋白。
[0126]合适的粘液溶解剂包括，但不限于愈创甘油醚、碘化甘油、愈创木酚甘油醚(glyceryl guaiacolate)、水合職二醇、氯化铵、N-乙酰半胱氨酸、溴己新、氨溴素、碘化物、其可药用盐及其组合。
[0127] 在某些实施方案中，在本发明的包括在脂质体中的亲脂性生物活性剂的组合物中使用的防腐剂的量也可以由于包含另外的添加物而减少。例如，本发明的组合物中可以通过加入多官能二醇和通过降低水分活度Aw减少防腐剂的量，所述多官能二醇包括，但不限于1，2-戊烷二醇、1，4-戊烷二醇、己二醇、丙二醇、1，3- 丁二醇、甘油或双甘油、其组合等，所述降低水分活度是经由加入上述保湿剂和通过加入可溶性组分来实现。其它实例包括可溶性组分，比如PH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。可以加入的其它缓冲剂包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二异丙醇胺、氨基甲基丙醇、氨基丁三醇、四羟基丙基乙二胺、柠檬酸、乙酸、乳酸，及乳酸的盐，包括乳酸钠、乳酸钾、乳酸锂、乳酸钙、乳酸镁、乳酸钡、乳酸铝、乳酸锌、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸银、乳酸铜、乳酸铁、乳酸锰、乳酸铵、其组合等。
[0128]在某些实施方案中，将亲脂性生物活性剂比如CoQlO溶解在同时具有亲脂和亲水性质的物质中可通过形成由高磷脂酰胆碱卵磷脂比如PH0SPH0LIP0N ? 85G包封的水可分散的CoQlO而有助于脂质体制剂。
[0129]用于亲脂性生物活性剂的合适的增溶剂包括，例如聚氧化烯葡聚糖、蔗糖的脂肪酸酯、寡葡糖苷的脂肪醇醚(例如，烷基多聚葡糖苷比如TRITON?)、甘油的脂肪酸酯(例如，单/二硬脂酸甘油酯或单月桂酸甘油酯)和聚氧乙烯型化合物(例如，聚氧乙烯、聚乙二醇、聚乙烯氧化物、S0LUT0L?CRE0M0PH0R?, MACR0G0L?、CARBOWAX?、P0LY0XYL?)。合适的增溶剂也包括脱水山梨醇的聚乙氧基化脂肪酸酯(例如，聚山梨酯，比如TWEEN?，SPAN?，包括聚山梨酯20和聚山梨酯80)、聚(氧化乙烯)的脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、聚(氧化乙烯)的脂肪醇醚(例如。聚氧乙基化月桂基醚、聚氧乙烯20油基醚(BRIJ98))、聚(氧化乙烯)的烷基酚醚(例如，聚氧乙基化辛基苯酚)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(也称为泊洛沙姆，比如“PLURONICS”，包括PLURONIC F-127，泊洛沙姆407稳定剂)和乙氧基化脂肪和油(例如，乙氧基化蓖麻油或聚氧乙基化蓖麻油，也称为聚乙二醇-甘油基三蓖麻酸酯)、及其组合。
[0130]在某些实施方案中，合适的增溶剂包括聚山梨酯，例如以商品名TWEEN?销售的那些。这样的聚山梨酯的实例包括聚山梨酯80 (TWEEN?80)、聚山梨酯20 (TWEEN?20)、聚山梨酯60 (TWEEN?60)、聚山梨酸酯65 (TWEEN?65)、聚山梨酯85 (TWEEN?85)等，及这些物质与其它类似表面活性剂(包括ARLACEL ?表面活性剂)的组合，只要表面活性剂和表面活性剂混合物的HLB (亲水亲油平衡)有利于形成0/W型乳液系统。
[0131]在某些实施方案中，活性剂可以处于一种或多种有机溶剂或其组合的溶液中。有机溶剂可以为水可溶混的或水不可混溶的。合适的有机溶剂包括，但不限于乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙腈、丙酮、叔丁醇、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、甲苯、己烷、庚烷、戊烷、1，3-二氧戊环、异丙醇、正丙醇、丙醛、其组合等。
[0132]制备方法
[0133]用于制备根据本发明的可吸入药物组合物的方法包括:(i)水化磷脂，从而形成水化的磷脂；(?)混合该水化的磷脂、疏水性生物活性剂和水性分散介质，从而得到混合物；和(iii)均质化该混合物，从而得到脂质体颗粒的分散体，其包含分散在水性分散介质内的磷脂和疏水性生物活性剂且具有约30至500nm的平均直径。疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1 : 5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w，且所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w。由于特定制剂和制备方法，所述组合物的特征在于有利的性质，例如当连续雾化时约50至100%的平均百分传输率(APT)。可选地，所述组合物特征可以在于其它药代动力学性质，比如当连续雾化时，所述组合物能够获得至少约500μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED)。
[0134]尽管本文讨论了具体实施方案，但是可以使用在本领域技术人员的能力之内的各种技术制备本发明的分散体和气雾剂。这类方法包括快速冷冻法、沉淀法、乳液法和高压均质法，例如如在PCT/US2008/085669中描述的，将其全部内容并入本文作为参考。根据本发明的水性分散体可以使用任何合适的方法(例如，微流化)制备，所述方法比如描述在美国专利申请 U.S.61/313，605、U.S.61/313，632、U.S.61/385，194 和 U.S.61/385，107 中的那些，将其全部内容在此并入本文作为参考。
[0135]在混合和均质化之前，使用增溶剂和/或加热帮助溶解亲脂性生物活性剂可能是有利的。加热温度和加热时间可以取决于具体的亲脂性生物活性剂、生物活性剂的固有热稳定性及使用的增溶剂。例如，在某些实施方案中，亲脂性生物活性剂和增溶剂可以加热至约40°C至约65°C，或约50°C至约60°C，或约50°C至约55°C，加热时间为约I分钟至约60分钟，或约15分钟至约45分钟，或约20分钟至约30分钟。亲脂性生物活性剂与增溶剂的重量比可以为约1:1，在一些实施方案中，约1:1至约4:2，在其它实施方案中，约1:2至约3:2。 [0136]例如，增溶剂如聚山梨酯80可能能够溶解亲脂性生物活性剂，在CoQlO的实施方案中，当加热至约50°C至约55°C的温度(高于CoQlO熔点(其为约47°C至约48°C )的温度)时，亲脂性生物活性剂以高水平完全溶于约1:2至约3:2比率的增溶剂中。
[0137]如上所述，加入到亲脂性生物活性剂中的增溶剂的量可以取决于用于形成脂质体的增溶剂、亲脂性生物活性剂和磷脂。在某些实施方案中，增溶剂的存在量可以为约0.2%至12%重量，或约1.5%到6.5%重量。
[0138]然后，亲脂性生物活性剂和增溶剂的溶液可以与磷脂混合(例如，形成脂质体)，其随之与水性分散介质形成分散体。为了制备分散体，磷脂和水性分散介质可以混合在一起，并加热至约50。。至60°C，例如55°C，加热约1-24小时或约1-8小时，例如约I小时。
[0139]用于形成雾化颗粒的合适的快速冷冻方法包括本文提及的那些，如喷雾冷冻成液体(SFL)，如在美国专利号N0.6，862，890中描述的，将其全部内容引入本文作为参考，和超快速冷冻(URF)，如在美国专利申请公开N0.2004/0137070中描述的，将其全部内容并入本文作为参考。在某些实施方案中，合适的SFL方法可以包括混合活性剂与溶液剂，并且通过处于低温液体水平处或低于该水平的绝缘喷嘴喷雾有效成份-溶液剂混合物，从而使喷雾产生冷冻颗粒。在某些实施方案中，合适的URF方法可以包括包括活性剂和至少一种可冷冻有机溶剂的溶液与冷表面接触以便冷冻该溶液，并除去有机溶剂。
[0140]用于形成雾化颗粒的合适的沉淀方法包括本文提及的那些，如蒸发沉淀成水性溶液(EPAS)，如在美国专利号N0.6，756，062中描述的，将其全部内容引入本文作为参考，和控制沉淀(CP)，如在美国专利申请公开N0.2003/0049323中描述的，将其全部内容并入本文作为参考。在某些实施方案中，合适的EPAS方法可以包括将药物或其它活性剂溶解在至少一种有机溶剂中以形成药物/有机混合物，将该药物/有机混合物喷雾到水性溶液中，与此同时在所述水性溶液的存在下蒸发有机溶剂以形成药物颗粒的水性分散体。在某些实施方案中，合适的CP方法可以包括再循环抗溶剂(ant1-solvent)通过混合区,将药物或其它活性剂溶于溶剂中以形成溶液，将该溶液加入到混合区中以形成在抗溶剂中的颗粒浆液，并再循环至少一部分颗粒浆液回流过所述混合区。
[0141]用于形成雾化颗粒的合适的乳液法包括本文提及的那些，如HIPE (高内相乳液)，如在美国专利号N0.5，539，021和5，688，842中描述的，将其全部内容并入本文作为参考。在某些实施方案中，合适的HIPE方法可以包括在乳化和稳定量的表面活性剂、具有流速Rl的连续相液流和具有流速R2的分散相液流的存在下，连续地合并到分散器中，并利用足够恒定的R2:R1以足量剪切力混合合并的液流，以形成高内相比乳液而不需要相转化或内相分布到外相中逐步分布。
[0142]用于形成雾化颗粒的合适的高压均质化法包括使用均质器和微流化器的那些，例如如在美国专利申请 U.S.61/313，605、U.S.61/313，632、U.S.61/385，194 和U.S.61/385，107 中描述的。
[0143]上述方法可以产生颗粒和雾化颗粒，其形态上为晶体或无定形的。有利地，这些方法中没有一个需要机械性研磨或其它类似的单元操作，这些操作可引起活性剂热降解。
[0144]可以利用均质器、搅拌器、混合器和本领域技术人员知道的类似装置，通过以高剪切混合以形成脂质体浓缩物而均质化一种或多种制剂组分(例如，疏水性生物活性剂、磷脂和/或水性分散介质)。在某些实施方案中，可以使用市售可获得的均质器制备亲脂性生物活性剂的亚微米脂质体分散体，所述均质器包括由Gifford-Wood, Frain, IKA和其它制造商制造的Ultra-Turrax TP18/10均质器或类似类型的定子/转子均质器，以及多阶段均质器、胶体磨、高压匀化器(sonolator)或其它类型的均质器。上述定子/转子类型的均质器具有约IOO rpm至约15，OOOrpm的操作范围，并且可以装有低剪切、标准剪切和高剪切范围的头筛(head screen)。
[0145]均质化可以通过以合适的速率混合两个相来进行，所述合适的速率为例如约5，OOOrpm至约 15，OOOrpm,在某些实施方案中约 5，000,7, 500、10，000、12，500 或 15，OOOrpm或其间的值或范围。均质器的剪切速率也可以通过增加或减小围绕均质器头的处理筛的尺寸而提高或降低而与均质化轴的速率无关。
[0146]在某些实施方案中，脂质体可以由提供给Silverson L4RT均质器的标准乳化筛和高剪切筛产生。混合可以进行少于约90分钟的合适时间段，在一些实施方案中，约2分钟至约60分钟，在一些实施方案中，约5分钟到约45分钟。在一个实施方案中，混合可以进行至多接近5分钟。得到的脂质体的粒径可以为约30nm至约500nm、50nm至约200nm、约50nm 至约 150nm、约 50nm 至约 100nm、约 50nm 至约 75nm、约 75nm 至约 100nm、约 IOOnm 至约150nmo
[0147]在一些实施方案中，可以将混合的组分加热至约45°C至约65°C的温度，在一些实施方案中，约50°C至约55°C，并以上述速率和时间采用高剪切均质化混合以形成CoQlO的亚微米脂质体。当亲脂性生物活性剂为CoQlO时，CoQlO相、水/磷脂相和混合相的处理温度都不应超过约65°C以避免CoQlO的氧化退化。然而，在约50°C至约60°C的温度下处理该混合物可能是希望的以获得约5，OOOcP至约100，OOOcP的期望浓缩物粘度，在一些实施方案中在约35°C至约45°C下约15，OOOcP至约40，OOOcP的粘度。在某些实施方案中，在该温度范围之内以上述速率处理延长的时期例如至多约60分钟，应当不会不利地影响得到的脂质体的完整性。
[0148]通过利用机械装置，比如例如研磨、应用超声能、在喷雾系统中形成胶态尺寸的小滴或在限制通道内以高速率剪切在液体流中的颗粒，可以减小亲脂性生物活性剂分散体的颗粒尺寸。可能需要大量的能量来裂解大颗粒。较小颗粒会增加活性剂的界面面积。在某些实施方案中，使用表面活性剂减小界面能，从而稳定分散体。粒径决定了总界面面积，并因此界面能必须适应于获得稳定的系统。随着粒径降低，需要增加的能量以产生颗粒，并且因为总表面积增加，表面活性剂必须适应更大的界面能。
[0149]在优选的实施方案中，通过使用微流化器减小生物活性剂分散体的颗粒尺寸。在某些实施方案中，在减小分散体颗粒尺寸时，可能希望CoQlO混合物在微流化器进行几次循环以获得期望粒径。例如，本发明的生物活性剂(例如CoQlO)的磷脂分散体可以在微流化器中进行至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100次循环或更多循环。优选地，生物活性剂(例如CoQlO)的磷脂分散体在微流化器中进行足够次数的循环以获得优选的粒径，例如，适用于例如经由喷雾器鼻内递送的粒径。
[0150]用于本发明的合适的微流化器包括例如M110P,其可从Microfluidics, Inc.(MFI)可获得。MllOP具有75-μ m的通道和F12Y相互作用腔。在操作M3中，微流化器具有25，OOOpsi的进口压力。许多其它微流化器是本领域通常已知的，且预期适用于本发明的方法。本发明中使用的微流化器的进口压力可以为至少约20，000?81，至少约25，000?81，优选至少约30，OOOpsi。
[0151]在本文提供的实施例中，在具有F12Y相互作用腔与75-μ m通道的MllOP微流化器中最少10次循环之后，用卵磷脂产生小于160nm平均直径的颗粒并用DPPC产生约IlOnm的颗粒。本领域普通技术人员应当理解，亲脂性生物活性剂(例如CoQIO)、磷脂(例如卵磷月旨、DPPC或DMPC)和水性分散介质的相对量可以基于期望的性质来调节，比如期望的治疗用途、雾化、药代动力学和/或药效学。在本文提供的实施例中，微流化器在约30，000PSI的压力下操作，虽然在其它实施方案中可以使用其它压力。
[0152]雾化
[0153]根据本发明的方法可以包括雾化脂质体颗粒的分散体，从而形成包含多个液滴的可呼吸气溶胶，各个液滴包含脂质体颗粒的分散体且具有约I至5 μ m的质量中值空气动力学直径(MMAD)。但是，在某些实施方案中，颗粒具有小于I μ m和/或大于5 μ m的直径。
[0154]图1A显示肺部递送根据本发明的疏水性生物活性剂的水性脂质体分散体的示意图。将大块的药物配制成具有小(药物)颗粒尺寸的磷脂-稳定的水性分散体，其使用振动筛网喷雾器雾化成为包含小药物颗粒的液滴。为了定义的目的，“颗粒”指水性分散体的内相，“液滴”指变成所产生的气溶胶的结果。在各个实施方案中，各个液滴包含一定量的药物颗粒。图1B显示获得具有小药物颗粒尺寸的水性分散体的三种不同的试验制备方法。为了图1B的目的，在55°C下，将在水中包含6%w/w卵磷脂的磷脂分散体加入到熔融的CoQlO中(l%w/w)。然后，如下处理所述制剂:(1)高剪切混合(Ultra-Turrax ?TP18/10Homogenizer,具有 8mm 转子叶片，IKA-Werke, Staufen, Germany):将 10OmT,的制剂在300rpm下搅拌，并以10000-12000rpm进行高剪切混合45分钟；(2)微流化(M-110YHigh Pressure Pneumatic Microfluidizer ?, Microfluidics, Newton, MA USA):该过
程通过沿相反方向具有两个喷射流来实现。在该处理过程中，各轮次表示药物颗粒必须彼此碰撞的一次机会，从而破裂且变得更小。使用探头声处理2分钟使所述制剂预分散，接着以约13Kpsi进行30轮；或(3)超声处理(Ultrasonication) (Omni SonicRuptor-250 ? Ultrasonic Homogenizer,具有 5/32 " (3.9mm)Micro-Tip Probe, OmniInternational, Kennesaw, GA, USA):在125W下60分钟。这些不同制备方法的结果的比较显示在图5中，且在下面进 一步详细讨论。
[0155]制备和递送根据本发明的气溶胶可以通过用于水性脂质体分散体的连续喷雾的任何合适的递送方式获得，包括喷雾器。最合适的递送方式取决于要递送至肺的活性剂、制剂的其它组分、期望的活性剂有效量及对于给定患者特定的特征。对于本发明，这类装置的选择和操作详细信息都在本领域技术人员的能力范围之内。
[0156]在各个实施方案中，根据本发明的气溶胶可以通过超声波喷雾器、喷射喷雾器、软雾吸入器(soft mist inhaler)、超声振动筛网喷雾器或利用振动筛网技术的其它喷雾器来递送。例如，合适的超声波喷雾器包括从日本的Omron Corporation可获得的OmronNE-Ul7和从德国的Beurer GmbH可获得的Beurer Nebulizer IH30。合适的喷射喷雾器包括，例如从Oklahoma.的A&H Products, Inc.可获得的AquaTower。合适的软雾喷雾器包括例如从德国的Boehringer Ingelheim GmbH可获得的Respimat Soft Mist。合适的振动筛网喷雾器包括，例如从德国的Pari Pharma GmbH可获得的Pari eFlow,从Pittsburg, Pennsylvania 的 Respironics Inc.可获得的 Respironics 1-Neb,从日本的Omron Corporation 可获得的 Omron MicroAir,从德国的 Beurer GmbH 可获得的 BeurerNebulizer IH50,和从爱尔兰的Aerogen Ltd.可获得的Aerogen Aeroneb。对于本发明来说，针对吸入疗法，通过它们经由被动呼吸递送高药物量的能力在加压计量吸入器(PMDIs)和干粉吸入器(DPIs)中选择。因此，在施用药物期间，患有肺机能损伤的患者(例如肺癌患者)预期不会经历困难。
[0157]虽然本发明已经根据待治疗的具体病症、亲脂性生物活性剂相当详细地讨论了吸入制剂，但是上述制剂也可以配制且以其它全身和/或局部途径施用。例如，气溶胶可以选择性地递送至呼吸道、口、气管、肺、鼻、粘膜、鼻窦或其组合中的一个或多个区域。递送可以实现区域、局部或全身递送、或其组合的一种或多种。可选地，气溶胶也可以用于非吸入递送。本发明的组合物也可以将所述组合物简单地加入到其中包含细胞的流体中体外施用至细胞(例如，在体外培养中诱导癌细胞的细胞凋亡或用于科学、临床、或临床前实验)。
[0158]治疗方法
[0159]本发明的组合物也可以用于施用亲脂性生物活性剂以治疗可从应用该亲脂性生物活性剂受益的任何疾病或病症，包括在国际公布N0.WO 2005/069916中公开的那些，将其全部内容并入本文作为参考。
[0160]根据本发明施用可吸入药物组合物的方法可以包括步骤:(i)雾化脂质体颗粒的分散体，从而形成包含多个质量中值空气动力学直径(MMAD)为约I至5 μ m的液滴的可呼吸气溶胶，和(ii)将治疗有效量的疏水性生物活性剂递送至需要治疗的受试者的肺。进一步，脂质体颗粒的分散体具有约30至500nm的平均直径，各个脂质体颗粒包含分散在水性分散介质内的疏水性生物活性剂和磷脂。而且，疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w，所述磷脂占组合物的约0.1至 30%w/w ；.[0161]由于特定制剂和制备方法的结果，所述组合物特征在于有利的性质，例如当连续雾化时，约50至100%的平均百分传输率(APT)。可选地，所述组合物特征可以在于其它药代动力学性质，比如当连续雾化时，所述组合物能够获得至少约600 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度或经15秒至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED)。
[0162]其它药代动力学性质可以包括沉积质量分数、递送至靶标的药物和/或制剂的量及靶标处的保留时间。在某些实施方案中，本发明可用于沉积至少约1、5、10、15或20%的质量分数。本发明也可以用于帮助递送高于0.25 μ g/g的活性剂至深肺部。在某些实施方案中，递送至肺可以是在肺组织中至少约1、5、10、15、20、25、30、50、100、200、300、400或500 μ g/g的生物活性剂。而且，所述制剂可以保持在肺中(例如“保留时间”)至少约2、4、
6、8、10、12、24或48小时的时间。
[0163]如本文使用的术语“药用有效量”和“治疗有效量”包括当施用至包括人类的动物受试者时产生期望的药理或治疗效果的生物活性剂或药物的量或浓度。包括药用有效量或治疗有效量的活性剂或药物的量可以根据多种因素变化，比如使用的药物类型、具体药物的效能、制剂的施用途径、用于施用所述制剂的系统、其组合等。
[0164]本文的术语“治疗(treatment) ”或“处理(treating) ”包括哺乳动物中疾病的任何治疗，包括:(i)预防疾病，即，使疾病的临床症状不发生；(ii)抑制疾病，即，阻止临床症状的发展；和/或(iii)减轻疾病，即，引起临床症状的消退。
[0165]在某些实施方案中，本发明的组合物可以用于治疗癌症。如本文使用的“癌症”指哺乳动物中发现所有类型的癌症或赘生物(neoplasm)或恶性肿瘤，包括，但不限于:白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌瘤(carcinoma)和肉瘤。如本文使用的，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可互换地使用，且以其单数或复数形式使用时，指出现恶性转化使其对宿主生物体成为病态的细胞。
[0166] 原发性癌细胞(即，从恶性转化部位的附近获得的细胞)可容易地通过熟知的技术(包括组织学检查)与非癌细胞区分。如本文使用的癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括来源于癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移性癌细胞，及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。
[0167]当提及通常表示为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤为基于肿瘤团块可检测的肿瘤，例如通过如CAT扫描、MR成像、X射线、超声或触诊的方法，和/或因为在可从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达使其可检测的肿瘤。
[0168]癌症的实例包括脑癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。
[0169]术语“肉瘤”一般指由物质如胚性结缔组织构成且通常由埋入纤维状物质或均质物质中的密堆积的细胞组成的肿瘤。可以用本发明的包括雾化颗粒的组合物和任选的增效剂和/或化疗剂治疗的肉瘤的实例包括，但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤(melanosarcoma)、粘液肉瘤、骨肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡样软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤(ameloblastic sarcoma)、葡萄样肉瘤、绿色瘤肉瘤、chorine carcinoma、胚胎肉瘤、肾母细胞瘤肉瘤(Wilms’ tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’ ssarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma) >B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T-细胞的免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(Jensen’ ssarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi，s sarcoma)、枯氏细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤(reticulocyticsarcoma)、鲁斯氏肉瘤(Rous sarcoma)、衆液囊性肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)和毛细血管扩张性肉瘤。
[0170]术语“黑色素瘤”包括由皮肤及其它器官的黑色素细胞系统产生的肿瘤。可以用本发明的包括雾化颗粒的组合物治疗的黑色素瘤包括，但不限于肢端雀斑性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年I型黑色素瘤、Cloudman' s黑色素瘤、891黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、青年型黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤和浅表扩散性黑色素瘤。
[0171]术语“癌瘤”指由上皮细胞形成的倾向于浸润周围组织和导致转移的恶性新生物。可以用本发明的包括雾化颗粒的组合物治疗的癌瘤包括，但不限于腺泡癌、腺泡状癌、囊性腺癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡上皮癌(alveolar carcinoma)、肺泡细胞癌(alveolar cell carcinoma)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basoceIlulare)、基底样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、髓样癌(caebrifonncarcinoma)、肝小胆管癌(cholangiocellular carcinoma)、域毛膜癌、胶样癌、粉剌状癌、子宫体癌(corpus carcinoma)、筛状癌、错甲状癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬癌、胚胎癌、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌(epiermoid carcinoma)、腺样上皮癌(carcinomaepitheliale adenoides)、外植癌、溃痕性癌、纤维癌、胶状癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞性癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特莱氏细胞腺癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌、hypemephroid carcinoma、婴儿胚胎癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher ' s carcinoma、Kulchitzky-细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、lyrnphoepithelial carcinoma、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌、软癌(carcinoma moue)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麦细胞癌(oatcell carcinoma)、骨化性癌、类骨质癌、乳头状癌、门脉周癌、前侵袭癌、棘细胞癌(pricklecell carcinoma)、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾脏的肾细胞癌、备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、solenoid carcinoma、球形细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌(carcinoma spongiosum)、鳞癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、块状癌(carcinoma tuberosum)、结节性癌(tuberous carcinoma)、抚状癌等。
[0172]可以用本发明的包括雾化颗粒的组合物治疗的另外的癌症包括，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血病、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺insulanoma、恶性类癌瘤(malignant carcinoid)、尿道/膀胱癌、恶变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
[0173]尽管已经详细讨论了多种癌症，但是本发明的组合物和方法还应用于其它呼吸道、口腔、鼻腔、鼻窦和肺部病理，包括但不限于哮喘、变态反应、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、急性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、肺炎、结核病、肺水肿、急性呼吸窘迫综合征、肺尘埃沉着病、间质性肺病、肺水肿、肺栓塞、肺动脉高血压、胸腔积液、气胸、间皮瘤、肌萎缩性侧索硬化、重症肌无力和肺病。
实施例
[0174]下述实施例意欲仅示例说明，且不意味着以任何方式限制本发明的范围。
[0175]实施例1:适应于连续喷雾的磷脂-稳定的CoQlO亚微米水性分散体的开发和表征 [0176]该实施例提供开发用于肺部递送疏水性药物的合适制剂的方法，使用CoQlO作为个案研究。在初步研究(数据没有显示)之后，选择赋形剂(例如磷脂)和雾化装置(例如，Aeroneb Pro⑧振动筛网喷雾器)。使用X射线衍射(XRD)、差示扫描量热法(DSC)、激光衍射法(LD)和扫描电子显微术(SEM)进行大块药物的初始表征。然后，高剪切混合、高压均质化或超声处理被评估为获得CoQlO的小粒径分散体的可用制备方法。在选择合适的方法之后，研究影响药物粒径的参数。使用LD和重量定量分析，评估喷雾以评价药物-赋形剂-装置组合的性能。研究的CoQlO粉末为晶体，熔点约51°C，粒径为30μπι。因此，粒径减小被认为是肺部递送所必需的。据发现微流化是一种制备水性分散体中的亚微米药物颗粒的合适方法。处理的轮数和使用的磷脂类型(卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱-DPPC)影响分散体的最终药物粒径。卵磷脂-稳定的CoQlO分散体的喷雾性能根据微流化器中的轮数而变化。而且，这些分散体的流变学似乎在由使用的活性成分振动筛网喷雾器产生气溶胶中起作用。总之，使用具有适于用喷雾器肺部递送的特征的微流化器适当地制备CoQlO的水性分散体。
[0177]材料和方法
[0178]材料:辅酶QlO 由 Asahi Kasei Corp.(Tokyo, Japan)提供。卵磷脂(粒状，NF)购自 Spectrum Chemical Mfg.Corp.(Gardena, CA, USA)。Genzyme Pharmaceuticals(Liestal, Switzerland)提供1，2_ 二棕榈酰基_sn_甘油基_3_磷酸胆碱(DPPC)。氯化钠(晶体，ACS 认证)获自 Fisher Chemical (Fisher Scientific, Fair lawn, NJ, USA),去离子水获自研究实验室中常见的中心反渗透/软化器系统。分散剂1，3_丙二醇(98%)购自 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)。无水乙醇(ethanol200proof) USP 购自 DeconLaboratories(King of Prussia,PA,USA)。
[0179]CoQlO的大块特征
[0180]X 射线衍射(XRD):使用 Philips Modell710X 射线衍射仪(Philips ElectronicInstruments Inc., Mahwah, NJ, USA)进行试验，所述X射线衍射仪具有在40kV和30mA的加速电压下发射的初级单色福射(primary monochromated radiation)(CuKa I, λ =1.54056 A ) °将CoQlO粉末放置在台上，并扫描样品以获得0.05°间隔的从5°至50°的2Θ角的衍射图谱，停留时间3秒。
[0181]差不扫描量热法(DSC):使用2920Modulated DSC (TA Instruments, NewCastle, DE, USA)进行 DSC 试验，并使用 TA Universal Analysis2000 软件进行分析。将 CoQlO 粉末称重(10.5mg)到铝锅中(kit02190041, Perkin-ElmerInstruments, Norwalk, CT, USA),并压实。加热速率为10°C /min,从10至120°C分析样品的热行为。
[0182]激光衍射(LD):将大块CoQlO粉末分散在去离子水中的20% (v/v) 1，3_丙二醇中以进行粒径分布分析。然后，将该分散样品加入到装备有300mm透镜的MalvernMastersizer S ? instrument (Malvern Instruments, Worcestershire, UK)中的小室装置中直到获得5-10%的遮光度。内相和分散剂的折射率分别为1.45和1.33。
[0183]扫描电子显微术(SEM):使用SEM进行大块CoQlO的物理外观的分析和粒径的估算。具有粘合性碳带的招台容纳该粉末样品。在IS气氛下，使用Cressington SputterCoater208HR(Cressington Scientific Instruments, Watford, England)在具有钼-铱的旋转-行星式_倾斜台上进行涂布。在Carl Zeiss Supra ? 40VP Scanning ElectronMicroscope (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)中，在 19mm 的工作距离和 5kV 的电子高压(EHT)下操作，使用SmartSEM ?图形用户界面软件获取SEM图像。
[0184]制备方法的开发
[0185]在本实施例中测试三种不同的制备方法，以便获得具有小药物粒径的CoQlO水性分散体。类似的方法可以适用于进一步优化CoQlO制剂和提供用于其它疏水性药物的制剂。在55°C下，将在水中包含6%w/w的卵磷脂(作为实例的磷脂)的磷脂分散体加入到熔融的CoQlO (l%w/w)中。磷脂浓度高于临界胶束浓度(例如，对于卵磷脂，根据来源和加工方法，CMC从1.3至5.5mg/ mL变化)。然后，如下加工所述剂型。
[0186]高剪切混合:将100毫升的制剂在300rpm下搅拌，并使用具有8mm转子叶片的 Ultra-Turrax (K) TP18/10Homogenizer(IKA-fferke, Staufen,Germany)以10，000-12，OOOrpm 高剪切.二、45 分钟。
[0187]高压均质化:使用微流化方法实现高压均质化。各轮表示药物颗粒彼此碰撞的机会，从而分裂且变得更小。使用探头声处理2分钟来预分散所述制剂，接着使用M-1IOY HighPressure Pneumatic Microfluidizer? (Microfluidics, Newton, MA USA)以约 30，OOOpsi进行30轮。
[0188]超声处理:使用具有微-尖探针的5/32英寸(3.9mm)的Omni SonicRuptor-2o() ? Ultrasonic Homogenizer(Omni International, Kennesaw, GA, USA)在125W下超声处埋所述制剂60分钟。
[0189]制剂开发
[0190]在选择制备方法之后，使用高压均质化制备制剂来确定所选择的参数和磷脂类型对药物分散体的粒径分布的影响。在初步研究期间，观察到包含6%w/w的卵磷脂的高溶质浓度制剂不能由Aeixmeb Pro⑧振动筛网微泵喷雾器产生气溶胶。进一步的初步研究也表明包含降低浓度的卵磷脂(l%w/w，l:l的药物:脂质比率)的制剂呈现出用于评价配制后的喷雾性能的足够稳定性。因此，降低磷脂浓度是必需的，同时保持CoQlO的浓度恒定在适当的药物:脂质比率。
[0191]在水化之后，在55°C下，将在水中包含l%w/w的磷脂(卵磷脂或DPPC)的磷脂分散体加入到熔融的CoQ10(l%w/w)中。然后，使用高剪切混合(Ultra-Turrax ?TP18/10Homogenizer,具有 8mm 转子叶片，IKA-fferke, Staufen, Germany)以 20, OOOrpm预分散所述制剂至多5分钟。接着，使该制剂以约30，OOOpsi下通过M-110P Bench-topMicrofluidizer? (Microfluidics, Newton, MA USA)至多 100 次，同时保持温度在 50 至60°C之间。
[0192]在测试磷脂类型和轮次数对制剂粒径分布的影响时，在不搅拌的情况下使磷脂分散体水化约I小时(表1，制剂A和B)。然后，当比较不同磷脂时，使制剂通过微流化器10、
20、30、40和50次；当评价轮次数的影响时，使其通过20、50、70和100次。对于喷雾性能测试，将磷脂分散体在搅拌下水化过夜，并将0.9%w/v的氯化钠加入到最终制剂中(表1，制剂C)。
[0193]然后，使用激光衍射(LD)和/或动态光散射(DLS)分析制剂的粒径分布。还评价表面张力、?电势和流变学。对于喷雾性能，使用LD和重量定量分析进行气溶胶输出分析。
[0194]制剂的表征
[0195]粒径分布:使用与装备有300_透镜的Malvern Spraytec ? (MalvernInstruments, Worcestershire, UK)偶联的采用以1，OOOrpm搅拌的湿样品分散单元的LD进行分散制剂的粒径分布测试。将该分散制剂加入到蒸馏水(分散剂)中直到获得约5%的遮光度。内相和分散剂的折射率分别设定为1.45和1.33。采用I秒抽样周期进行定时测量45秒(总共45个测量值)。结果呈现为Dv(X)和跨度，其中X为在所指尺寸下颗粒的累积百分位数(例如Dv(50)对应于颗粒的中值体积)。跨度是计算为[Dv(90) -Dv(IO)]/Dv(50)]的粒径分布的量度。较高的跨度指示多分散性更高的粒径分布。
[0196]另外，使用 Malvern Zetasizer Nano S ? (MalvernInstruments, Worcestershire, UK),在25°C下采用DLS表征分散制剂的纳米颗粒流体动力学直径，并预平衡2分钟。相关函数的截距为0.5至1.0。用蒸馏水稀释分散体。
[0197]表面张力:如前述章节描述的，使用TA.XT.plus Texture Analyzer (TextureTechnologies, Scarsdale, NY, USA)从盘上的最大拉力进行表面张力测试。简而言之，对容器和玻璃盘探头彻底除油，用乙醇清洁，并使其干燥。将探头连接至物性分析仪(textureanalyzer)的臂,并降低直到探头的底面接触储库中包含的液体制剂的表面。测量并记录液体的温度。在测试开始时，使探头以恒速(0.05mm/s)从液体的表面上升10mm，同时物性分析仪以每秒5点记录随时间或距离变化而施加的力。使用最大(分离)力，利用下述等式I计算表面张力:
[0198]x/k=0.0408687+6.20312* (x~2/v) - 0.0240752 (x~2/v)~2 (等式 I)
[0199]其中X为探头半径，V为体积，k为弯液面系数。用于计算表面张力的密度值假定为与在测量温度下水的密度相同。
[0200]ζ 电势:米用 ZetaPlus ζ 电势分析仪(Brookhaven InstrumentsCorp.，Holtsville, NY, USA)，使用电泳光散射进行ζ电势测试。在25°C的恒温和恒定(中性)PH下分析样品。用蒸馏水稀释样品到300至550 μ S的电导值。每个样品各自进行10次，测量之间的间隔为5秒。
[0201]流变学:使用装备有锥-板几何结构(锥形直径:40mm ;截断:54 μ m)的AR-G2流变仪(TA Instruments, New Castle，DE，USA)测试分散制剂的流变行为。在测试之前，分别进行零间隙和旋转作图(zero-gap and rotational mapping)。所有的测量都采用在25°C的恒温下无预剪切的新样品分散体进行。除去探头边缘周围的过量样品，并将水加入到溶剂阱隔室中。在稳态流动步骤，在对数下降(每10单位10点)的剪切速率范围(300至IOs-1)内测量样品。通过流体动力学限制测量剪切速率的上限(高探头速率引起液体样品溢出测量区)。样品周期为10秒，且认为在在5%容差之内的2个连续分析之后的平衡，不超过2分钟的最大点时间。使用Rheology Advantage Data Analysis软件(TAInstruments, New Castle, DE, USA)评价结果。
[0202]喷雾性能:基于前述经验，振动筛网喷雾器的性能可受到筛孔堵塞的影响，引起可变的气溶胶喷射(例如，间断性薄雾)，因为该制剂是一种分散系统。为了分析这些制剂的喷雾性能，我们评价了来自LD技术测定结果的传输随时间的变化。采用装备有300mm透镜的 Malvern Spraytec ?仅器(Malvern Instruments, Worcestershire, UK),使用“开放台”方法评价分散体的喷雾性能。喷雾器储库定位使得膜位于激光束的上缘上25mm处且在透镜和气溶胶云室中心之间25mm距离处。空气抽吸是位于激光束之下10cm。在整个测量期间，所述装置和气抽吸装置位置保持不变。内相和分散剂的折射率分别为1.33(水)和1.00(空气)。将制剂(IOmL)加入到喷雾器储库中。在喷雾开始时，逐秒连续地测量气溶胶特征，共测量15分钟。当比较不同的磷脂制剂时，考虑传输-时间曲线(传输图)的斜率。
[0203]另外，对于每个研究的制剂，重量分析测量总气溶胶输出(TAO)。在雾化之前，将各个制剂分配到储库中之后对喷雾器称重。在进行15分钟喷雾之后，再称重喷雾器储库中剩余制剂。喷雾前后的重量差异得到计算的ΤΑ0。在测量期间，不考虑喷雾器吹口的重量。
[0204] 重要的是，传输图和TAO都不提供关于喷雾器的药物输出的信息。信息仅限于总物质输出(随时间喷射的液滴)。在雾化这些分散体时，可能产生不包含药物颗粒的液滴(空液滴)。然而，我们测试的目的是研究喷雾器比如Aeixmeb Pro ?喷雾器随时间连续且稳定地雾化辅酶QlO的水性分散体的能力。在传输图中可以鉴定间断性薄雾，而TAO说明喷雾总物质的量级。使用盐溶液(12mL的0.9%w/v NaCl水溶液)作为对照。
[0205]统计分析:数据表示为平均值土标准差，除了表面张力和ζ电势结果以外，其表示为平均值土标准误差。对于流变学研究，由用于分析结果与流变模型的最佳拟合的软件提供标准误差。至少一式三份地分析样品，使用NCSS/PASS软件Dawson版本采用单因素方差分析(One-Way AN0VA)评价统计学差异的当p < 0.05时的显著性。进行后验比较以使用Tukey-Kramer方法鉴定组之间统计学显著的差异。进行配对t检验以分析同一制剂内药物粒径的稳定性随时间的统计学差异(P < 0.05)和分析在相同微流化条件下加工的不同磷脂的影响。
[0206]结果和讨论
[0207]该实施例证实用于肺部递送的疏水性药物(例如CoQlO)的合适剂型的开发的可行性。特别地，该实施例证实药物分散体的不同物理化学性质可以如何影响喷雾性能。该实施例还证实来自LD的传输数据和喷雾器输出的重量定量分析可如何用于评价随时间变化的稳定雾化。
[0208]大块CoQlO的XRD图谱显示出在约18.65和22.80处的两个高强度峰(2 Θ )，指示CoQlO的晶体结构(图2)。DSC温谱图中约51°C处的吸热峰表明该化合物的熔点低(图3)。CoQlO药物颗粒不适合以大块物质肺部递送，其Dv (50)为29.87 μ m，跨度值为2.051。通过SEM图像也确认颗粒尺寸的量级(图4)。减小粒径的第一种方法是采用球磨研磨18小时，其未成功，因为CoQlO转变成药物团块的簇集。粒径增加(Dv (50) =29.87 μ m，跨度=2.282)证实了此目测观察。由于CoQlO的熔点低，在加工期间产生的热和机械冲击都可对该结果有贡献。当低温研磨大块粉末时，发现了类似的结果(数据没有显示)。
[0209]因此，需要一种加工用于肺部递送的CoQlO颗粒的可选的方法。测试了高剪切混合、高压均质化和超声处理。图5中显示的结果表明使用剪切力制备的制剂呈现出具有接近双模分布的在分散体中的药物颗粒，这通过较高的跨度值和约I μ m的Dv (50)(表2)得到证实。微流化和超声呈现单分散的单模分布，Dv(50)值在亚微米范围中，因此每种方法能够制备具有不同程度的小药物粒径和具有不同的粒度分布的制剂。
[0210]在方法的选择之后，处理制剂A以确定在微流化器中处理轮次对药物粒径稳定性相关的影响(表1)。LD结果表明，在制备之后，所有的制剂都呈现在亚微米范围的粒径分布(图6)。在7天之后，不考虑处理轮次，与制备后当时的尺寸相比，所述制剂呈现较大的颗粒。DLS结果表明增加处理轮次到高于50次并未显示提供较小流体动力学直径或更高的单分散系统(图7)。随处理轮次变化的粒径的低点(trough)之前已经进行了报道，并被归因于由于反复均质化期间融合或奥氏熟化(Ostwald ripening)引起的次级颗粒生长。然而，对于采用任何不同处理轮次的任何单个制剂，在第O天和第7天之间，药物粒径没有发现任何统计学差异。
[0211]使用制剂B研究处理轮次的减少和不同磷脂的评价(表1)。DLS分析表明对于CoQlO的卵磷脂和DPPC分散体二者而言，随着微流化轮次增加(例如，至多50轮)药物粒径减小。在相同的微流化条件下(例如，离散的轮次)，DPPC制剂呈现比CoQlO的卵磷脂分散体更小的粒径，Z-均值分别在50-120nm和120_170nm的范围内。虽然DPPC胶状分散体呈现比卵磷脂-稳定的制剂更小的PdI值，但是两者都呈现高多分散性(PdI > 0.2)。该结果表明为了获得具有小粒径的制剂，需要不超过50轮处理，最终的胶状系统将取决于使用的磷脂。
[0212]在已经表明可以制备CoQlO的小药物颗粒分散体之后，研究了稳定地喷雾这些制剂的能力以及影响喷雾性能的物理化学性质。当振动筛网喷雾器由悬浮的剂型产生气溶胶时，可能出现不希望的间断性薄雾。因此，制剂针对不存在间断性薄雾进行评价，表明在整个喷雾事件中的雾化连续性。
[0213]在该实施例中，使用Malvern Spraytec ?分析随时间变化的传输，以选择在Aeroneb Pro ?喷雾器中连续地喷雾的分散制剂。用于评价喷雾的液滴浓度随时间变化的可选方法被描述于美国药典(USP)中关于喷雾器产品的表征的总章〈1601〉中。
[0214]在用“开放台”方法设置Malvern Spraytec ?之前，进行了大量尝试以使用Malvern-提供的吸入单元配件进行测试(图9)。在该系统中，从仪器左侧朝着位于右侧的检测器投射激光束。激光束穿过偶联至Spraytec⑩的吸入单元。喷雾器位于吸入单元的前面，真空管连接在所述单元的后面。由所述单元中间的管所提供的空气护套(airsheath)有助于来自喷雾器的气溶胶液滴直接导向真空源。为了评价喷雾器输出，将该装置与吸入单元一起以水平位置(90°角度)排列以测量尽可能接近于振动筛网的气溶胶产生。抽吸空气流速设置为30L/分钟，且护套(sheath)空气流速设置为15L/min(30 - 15L/min=15L/min)以获得最终空气流速15L/min。为了比较的原因，选择该空气流速以匹配在Next Generation(NGI)中分析喷雾器制剂所要求的空气流速。
[0215]观察到由于在Malvern Spraytec ?中空气护套效率低引起试验性假象(artifact)，导致气溶胶云侵入检测器透镜室，引起遮光度持续递增并因之减少传输。在操作吸入单元期间，将0.45 μ m HEPA膜滤器与真空源串联定位以防止损害真空源和防止暴露于操作者。然而，制剂逐渐地阻塞过滤器孔，其产生了超过空气护套且引导液滴朝向检测透镜室的回压。在吸入单元窗口模糊之后，传输值不会恢复到100%，且不精确的数据提供不间断喷雾器操作的表象。因此，使用该设备不可能获得可用的测量结果。不希望受到任何特定理论的束缚，据信这归于在每15分钟喷雾事件期间产生的气溶胶量与吸入单元主要被设计用于的PMDI和DPI装置相比是巨大的事实。因此，虽然这类已知的配件用于表征来自那些其它装置的气溶胶产生，但是它们不能用于根据本发明的连续喷雾器。
[0216]为了克服该假象，开发了“开放台”方法。选择喷雾器储库的位置，以避免晕影(大角度散射光错失了检测器视野)，同时也通过合适地设置用于连续排空所产生液滴的气抽吸源避免了液滴再循环。图10中显示的传输图显示制剂C的15分钟喷雾事件(表1)。在该期间过程结束时，对于所有制剂传输值都返回直到100%，指示测量适当地进行而没有雾化检测器透镜。对于初始5分钟，三种制剂呈现稳定的喷雾。在此时间点之后，与运行10轮的制剂相关的传输以与运行30和50轮的制剂不同的速率增加。为了评价这些制剂的喷雾性能，将传输图拟合至线性回归以便分析速率曲线的斜率。通过比较它们的斜率，可以确定喷雾的稳定性。
[0217]在微流化器中采用不同处理轮次的制剂C(表1)的斜率值和TAO呈现在图11中。与30和50轮相比，观察到运行10轮的制剂的斜率值较低。该观察结果与相对TAO值一致。这些数据表明与采用增加的处理制备的相同制剂相比，制剂C(在微流化器中采用10轮处理)呈现随时间的更稳定喷雾。
[0218]接着，研究采用10、30和50轮处理制备的制剂C的物理化学性质以确定处理如何影响喷雾性能。通过分析分散体中的流体动力学尺寸(图12)，我们从LD结果观察到粒径表现为随时间稍微增加，其中大多数颗粒保持在纳米范围内。当在第O天比较所分析制剂的LD和DLS时，我们基于Fraunhofer理论得出结论，由于上述相同的原因LD不是一种合适的技术。DLS结果表明所有制剂都呈现约260nm的Z-均值。在7天之后，Dv (50)仍然低于LD技术的测量范围，而对于30和50轮处理，Z-均值没有显著变化。根据粒径分布的结果，我们可以得出结论，具有较高处理轮次的制剂稳定约I周。在配制之后，PdI为0.2至0.3，并且在7天之后显示出一定多分散性水平。
[0219]结果表明与采用上述分析的制剂(制剂B: 120_170nm)形成的相比，这些卵磷脂分散体形成的流体动力学直径更大(约260nm)。这些差异可以至少部分地解释为由于制剂的电解质浓度差异引起。向制剂C中加入0.9%w/v的氯化钠用于两个目的:提供正常生理渗透压和减小由该主动振动筛网喷雾器的气溶胶产生的变异性。具有这样的低离子含量的溶液具有减少的变异性因素、增加的气溶胶输出和较小的液滴尺寸。不希望受到任何特定理论的束缚，低电解质含量被认为由于改善的电导率(其抑制水的高静电电荷)而有助于克服振动筛网的液滴分离阻力(drop detachment resistance),其因子有利于气溶胶产生。
[0220]然而,根据电解质在磷脂表面上的相互作用的Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO)理论，加入氯化钠也可以引起胶体的不稳定性。在该情况下，仅仅基于静电力(没有化学相互作用)的非特异性吸附可以由一价阳离子(例如，Na+)引起。由这类阳离子引起的?电势的降低可增加絮凝速率(例如，如通过比浊法分析的)。观察到在微流化之后加入前述盐将分散体的颜色从暗橙色改变为亮黄色。尽管关于该胶体稳定性的机制进行了广泛的讨论，但是胶体科学的当前理论不能充分解释该现象。单独的水性分散体的药物粒径分布并未表现出控制喷雾性能，因为这些分散体具有类似的直径(制备后)，但是具有不同的雾化行为。
[0221]增加微流化处理轮次提高了表面张力和ζ电势(当与10或50轮处理的制剂比较时，具有统计学显著性，参见图13)。已经推测较高的处理轮次有助于包封。然而，在来自主动振动筛网喷雾器的气溶胶产生中，表面张力的作用未被透彻地了解。本发明的实施例没有鉴定制剂C的ζ电势和表面张力之间的相关性，表面张力与不同的微流化器处理轮次和相应的喷雾性能相关。
[0222]通过绘制剪切应力作为剪切速率函数的图来研究分散体的流变学。HerschelBulkley模型-等式2-最佳地表示这三种制剂的特性:
[0223]σ = σ y+K * Y ~η (等式 2)
[0224]其中σ为剪切应力，oy为屈服应力，K为稠度指数或粘度，Y为剪切速率，和η为流动指数(η=1:牛顿流体；η < 1:剪切稀化；η > 1:剪切稠化)。对于分别采用10、30和50轮微流化处理而制备的CoQlO的分散体，标准误差分别为32.74±3.58,31.62±2.04、35.92±3.57。Herschel-Bulkley模型的三个要素列呈现在图14中。尽管各个要素的值根据该度量指标没有统计学差异，但是流变学结果和喷雾性能的结果之间的相似性是明显的。30和50轮的制剂呈现类似的流变行为和喷雾性能，其与10轮的制剂不同。有趣地是，所有制剂都呈现剪切稠化行为(η > 1)。特性比如尺寸、粒径分布、形状、电荷以及颗粒和周围液体之间的相互作用在这些系统的流变行为中起重要作用。因此，不令人惊讶的是制剂的流变行为影响喷雾性能，其是所有物理化学特性的相互作用的函数。
[0225]本发明提供第一个已知的研究来研究振动筛网喷雾器稳定地喷雾其中分析流体流变学的分散体的能力，其与进行简单的动态粘度测量结果相反(例如，分散介质本身的粘度，而不考虑分散颗粒与周围流体之间的相互作用)。
[0226]实施例2:基于CoQlO水性分散体的流变行为的体外雾化特征的预测
[0227]由于剂型的非均质性质，分散制剂的雾化可以产生包含可变药物浓度的液滴。因此，可能重要的是表征制剂的体外药物沉积(其可以采用阶式碰撞取样器进行)。激光衍射(LD)也可以用于该目的，但是LD的用途通常限于溶液剂型。分散体的非均质性产生具有不均匀的药物颗粒浓度的液滴，导致LD不适合。美国药典(USP)推荐下一代碰撞取样器(Next Generation Impactor) (NGI)用于该测试。
[0228]人肺泡表面活性剂包括约90%的磷脂和10%的中性脂质。在磷脂中，磷脂酰胆碱(PC)是占优势的(76%)，DPPC是主要成分(PC的81%)且二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)各自占PC的3%。DPPC和DSPC也存在于包含赋形剂大豆磷脂的磷脂混合物中，但是它们的浓度根据卵磷脂的来源和提取方法在很大程度上变化。
[0229]本实施例提供用于选择根据本发明的磷脂制剂的方法和数据。更特别地，本实施例还提供使用合成磷脂制备具有改善的喷雾性能的CoQlO制剂的方法和数据，其具有递送期望的CoQlO细颗粒剂量(Fine Particle Dose) (FPD)的潜能。该实施例研究了三种合成磷脂:DMPC、DPPC和DSPC，其中它们的饱和脂肪酸链中分别具有14、16和18个碳，分子量分别为 678、734 和 790g/mol。[0230]除了有关实施例1所描述的测试，合成磷脂制剂被进一步表征，用于使用NGI和用于适应于喷雾器的干粉吸入器(DPI)的剂量均匀取样装置(DUSA)进一步采用NGI和总喷射剂量(TED)表征体外药物沉积。其结果与对于连续雾化和对于鉴定控制由微泵喷雾器产生CoQlO分散系统的气溶胶的机制的物理化学性质的喷雾性能测试结合进行分析。实施例1的结果也进一步通过阐明分散体的流变学在使用主动振动筛网喷雾器的气溶胶产生的流体动力学中的作用而得到证实。
[0231]材料和方法 [0232]材料:CoQlO由 Asahi Kasei Corp.(Tokyo, Japan)提供。卵磷脂(粒状，NF)购自 Spectrum Chemical Mfg.Corp.(Gardena, CA, USA)。Genzyme Pharmaceuticals (Liestal, Switzerland)提供1，2-二肉豆蘧酰基_sn_甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1，2- 二硬脂酰基-sn_甘油基-3-磷酸胆喊(DSPC) ο DMPC 也购自 Lipoid GmbH(Ludswighafen, Germany) ? 氯化钠(晶体，ACS认证的)获自 Fisher Chemical (Fisher Scientific, Fair lawn, NJ, USA),和去离子水获自中央反渗透/软化器系统。己烧和200proof无水乙醇购自Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA),甲醇购自 Fisher Chemical (Fisher Scientific, Fair lawn, NJ, USA),全部材料都是来自HPLC级。NGI测试的外部过滤器(玻璃纤维，GC50, 75mm)和用于DUSA测试的过滤器(玻璃纤维，AP40,47mm)分别购自Advantec MFS Inc.(Dublin, CA, USA)和 Millipore (Billerica, MA, USA)。注射器(ImL)和注射器式滤器(hyperclean, 17mm, 0.45 μ m, PTFE)分别获自 Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)和 Thermo Scientific(Bellefonte, PA, USA)。
[0233]制剂:使用热高压均质化制备制剂(IOOmL)以测定磷脂类型对于雾化特征-喷雾性能和肺部递送的体外药物颗粒沉积的影响。选择2.5%w/w作为最大磷脂浓度。在初步研究期间(参见实施例5)，发现对于CoQlO可以获得使用Aeroneb Pro⑧喷雾器在15分钟喷雾事件内使制剂不出现间断性薄雾的最大额定载药量为4%wM因此，以药物:脂质比率4:2.5制备具有合成磷脂的制剂。
[0234]在搅拌下水化过夜之后，在55°C下，将在水中包含2.5%w/w的磷脂(DMPC、DPPC或DSPC)的磷脂分散体加入到熔融的CoQlO (4%w/w)中。然后，使用具有8mm转子叶片的Ultra-Turrax? TP18/10 均质器(IKA-Werke GmbH, Staufen, Germany)以 20，OOOrpm 高剪切混合5分钟，从而预分散所述制剂。接着，使各种制剂在约30，OOOpsi下通过M-1lOPBench-top Microfluidizer? (Microfluidics, Newton, MA, USA)处理 50轮，同时保持温度在55°C至65°C。在微流化之后，出于上述实施例中概述的原因，将0.9%w/v的氯化钠加入到最终制剂中。
[0235]然后，使用激光衍射(LD)和/或动态光散射(DLS)分析制剂的粒径分布。也评价表面张力、ζ电势和流变学。对于喷雾性能，使用LD和重量定量分析分析由Aeixmeb Ρι--喷雾器(Aerogen, Galway, Ireland)产生的气溶胶输出。使用NGI评价体外药物沉积，同时由NGI结果和使用剂量均匀取样装置(DUSA)的测量分析TED。除了实施例1中给出的特征和喷雾性能之外，制备并分析通过Microfluidizer ?处理50轮的CoQlO的卵磷脂分散体(药物-脂质比率为1:1)的体外药物沉积。这是针对合成磷脂剂型(CoQlO的DMPC、DPPC或DSPC分散体)评价的。卵磷脂分散体的制备、表征和喷雾性能评价的详细内容在实施例I中给出。在制备之后立即进行测试，除了分散体中药物粒径的稳定性(其中在制备后7天样品进行测试)。
[0236]表征
[0237]粒径分布:使用偶联至装备有300mm透镜的Malvern Spraytec ? (MalvernInstruments, Worcestershire, UK)的采用以1，OOOrpm搅拌的湿样品分散单元的LD进行分散制剂的粒径分布测试。将该分散制剂加入到蒸馏水(分散剂)中直到获得约5%的遮光度。内相和分散剂的折射率分别设定为1.45和1.33。采用I秒抽样周期进行定时测量45秒(总共45个测量值)。结果呈现为Dv(X)和跨度，其中X为在指定尺寸下颗粒的累积百分位数(例如Dv(50)对应于颗粒的中值体积)。跨度是计算为[Dv(90) -Dv(10)]/Dv(50)]的粒径分布的量度。较高的跨度指示多分散性更高的粒径分布。
[0238]也米用DLS,使用 Malvern Zetasizer Nano ZS ? (MalvernInstruments, Worcestershire, UK)在25°C下表征分散制剂的纳米颗粒流体动力学直径，并预平衡2分钟。相关函数的截距为0.5至1.0。当需要时，用蒸馏水稀释分散体。
[0239]表面张力:使用TA.XT.plus Texture Analyzer (TextureTechnologies, Scarsdale, NY, USA)进行表面张力测试。对容器和玻璃盘探头彻底除油，用乙醇清洁，并使其干燥。将探头连接至物性分析仪的臂，并降低直到探头的底面接触储库中包含的液体制剂的表面。测量并记录液体的温度。在测试开始时，使探头以恒速(0.05mm/s)从液体的表面上升10mm，同时物性理分析仪以每秒5点记录随时间或距离施加的力。使用最大(分离)力，利用下述等式3计算表面张力:
[0240]X/k=0.0408687+6.20312* (X~2/V) -0.0240752* (X~2/V) ~2 (等式 3)
[0241]其中X为探头半径，V为体积，k为弯液面系数。用于计算表面张力的密度值假定为与在测量温度下水的密度相同。
[0242]ζ 电势:米用 Malvern Zetasizer Nano ZS ⑧(MalvernInstruments, Worcestershire, UK),使用电泳光散射进行ζ电势测试。在C的恒温和恒定(中性)ρΗ下分析样品。用蒸馏水稀释样品，得到从400至1400 μ S/cm的电导值。一式三份地分析每种样品，每次测量进行10至100次，自动最佳化衰减和电压选择。
[0243]流变学:使用装备有锥-板几何结构(锥直径:40mm ;截断:54 μ m)的AR-G2流变仪(TA Instruments, New Castle, DE, USA)测试分散制剂的流变行为。在测试之前，分别进行零间隙和旋转作图。所有的测量都在25°C的恒温下采用无预剪切的新样品分散体进行。除去探头边缘周围的过量样品，并将水加入到溶剂阱隔室中。在稳态流动步骤下在对数降低(每10单位5点)的剪切速率(1000至低至0.01s-1)的范围内测量样品。分别通过仪表灵敏度和流 体动力学限制(高探头速率速率引起液体样品溢出测定区)测定每种制剂的剪切速率的下限和上限。样品周期为20秒，并认为在5%容差之内的2个连续分析之后平衡，不超过2分钟的最大测量时间。使用Rheology Advantage Data Analysis软件(TA Instruments, New Castle, DE, USA)评价结果。
[0244]喷雾性能:具有分散制剂的振动筛网喷雾器的性能可受到筛孔堵塞的影响，引起可变的气溶胶喷射(例如，间断性薄雾)。为了分析合成磷脂制剂的喷雾性能，评价了来自LD技术测量的传输随时间的变化。采用装备有300mm透镜的Malvern Spraytec ?仪器(Malvern Instruments, Worcestershire, UK),使用“开放台”方法评价分散体的喷雾性能。喷雾器储库定位以使得振动筛网位于激光束的上缘上25mm处且在透镜和气溶胶云室中心之间25mm距离处。气抽吸是位于激光束之下10cm。在整个测量期间，所述装置和抽吸装置位置不受干扰。内相和分散剂的折射率分别为1.33 (水)和1.00 (空气)。将制剂(IOmL)加入到喷雾器储库中。在喷雾开始时，逐秒地连续测量气溶胶特征，共测量15分钟。当比较不同的磷脂制剂时，考虑传输-时间曲线(传输图)的斜率。
[0245]另外，对于每个研究的制剂，通过重量分析测量总气溶胶输出(TAO)。在雾化之前，将各个制剂分配到储库中后对喷雾器称重。在进行15分钟喷雾之后再称重喷雾器储库中的剩余制剂。喷雾前后的重量差异得到计算的ΤΑ0。在测量期间，不考虑喷雾器吹口的重量。
[0246]重要的是，传输图和TAO单独都不提供关于来自喷雾器的药物输出的完整信息。信息仅限于总物质输出(随时间喷射的液滴)。在雾化这些分散体时，可能产生不包含药物颗粒的液滴(空液滴)。可以在传输图中鉴定间断性薄雾，同时TAO说明喷雾总物质的量级。使用盐溶液(12mL的水中的0.9%w/v NaCl)作为对照。
[0247]体外空气动力学沉积:为了评价体外气溶胶沉积，在15分钟的喷雾事件内，使用用于DPI的NGI或DUSA (两者都来自Copley Scientific, Nottingham, UK)收集气溶胶产生的前面和最后15秒(本文称为初始和最终分段或阶段)。该设计帮助确定之前对于卵磷脂制剂观察的和与TAO (第4章，第4.3部分)相关的传输的斜率是否转化为类似的药物物质输出。
[0248]为了测量制剂的空气动力学性质，NGI设置为具有15L/min的气流，并使用高效液相色谱法(HPLC)分析由进气口、阶式碰撞取样器的七个阶段、微孔收集器(MOC)和外部过滤器收集的药物。在NGI硬件设备的各个提及的隔室中物质的总量提供从NGI测量的TED。各个阶段沉积的物质也用于测定沉积模式和用于计算质量中值空气动力学直径(MMAD)，如在USP的总章〈601〉中描述的。该参数是等效液滴尺寸，其中基于NGI的不同阶段中沉积的药物量，一半(50%)液滴小于指定截止直径，和另一半液滴大于指定截止直径。可以使用几何标准偏差(GSD)指示MMAD周围的液滴尺寸分布。从在碰撞阶段3至7、MOC和外部过滤器(空气动力学截止直径低于5.39 μ m)沉积的药物物质的总和计算FPD。
[0249]在NGI分析期间，可能由于阶式碰撞取样器阶段之间喷雾器吹口和/或内隔室中的沉积出现药物收集的损失。可以进行质量平衡以确定这种损失的程度。在初步研究期间，观察到用合成磷脂制备的分散体的15-分钟气溶胶产生引起大量的制剂累积在喷雾器吹口中。由适应的DUSA评价TED以证实在分析期间获得可接受的质量回收(图15)。在DUSA测试期间，气溶胶直接沉积在连接于真空泵的定位于DUSA —端的玻璃纤维过滤器上。喷雾器吹口位于相反端，并使用硅树脂适配器直接连接到DUSA。由在玻璃纤维过滤器中和DUSA的内壁收集的药物量测定TED，其在定时喷雾之后使用HPLC产生的数据进行分析。
[0250]为了进一步分析剂量，根据等式4，将FPD结果从15-秒测量外推以计算在15分钟内的估计总递送药物(估计的总FPD或FPDet):
[0251]FPD打=Σι, FPP1-, +(等式 4)
[0252]其中i为表示15秒间隔的整数(NGI和TED分析的持续时间)。j值为小于i的后续整数，且η为在15分钟喷雾期间内的15秒片段的数目(η=60)。也基于FPDet计算细颗粒剂量(FPDr)。
[0253]CoQlO的HPLC分析:该方法改编自实施例4中给出的之前研究的方法。与UV检测器连接的 Waters HPLC 和柱系统(Waters C0.,Milford, MA, USA)使用 1525 二元泵、717自动采样器、设定在275nm的2487双重λ吸光度检测器以及连接Symmetry? C8保护柱(3.9 X 20mm, 5 μ m)的 Symmetry ? RP-C8 柱(3.9 X 150mm, 5 μ m)。甲醇:己烧流动相为97:3 (v/v)，并以1.0mL/min的流速洗脱。将CoQlO的储备溶液最初溶于比率为2:1 (v/v)的己烷:乙醇中，然后用流动相稀释以获得期望浓度。通过在40°C的受控温度下注入50 μ I的样品测定线性度范围。在9分钟的运行时间内获得色谱峰，并使用峰面积测定曲线线性度。
[0254]所有样品用乙醇由NGI和DUSA测试收集，除了从NGI板(阶段I至7和M0C)的药物收集进行卵磷脂分散体的分析之外。由于所述制剂在乙醇中的低溶解度，使用己烷:乙醇2: lv/v的混合物。在用0.45 μ m注射器过滤器过滤之前，将在玻璃纤维过滤器(NGI中的外部过滤器和来自DUSA的过滤器)中收集的样品涡旋30秒。使用流动相进行样品稀释。
[0255]统计分析:数据表示为平均值土标准差，除了表面张力，其表示为平均值土标准误差。对于流变学研究，由用于分析结果与流变模型的最佳拟合的软件提供标准误差。至少一式三份地分析样品，并使用NCSS/PASS软件Dawson版本采用单因素方差分析(One-WayAN0VA)评价统计学差异P < 0.05时的显著性。进行后验比较以使用Tukey-Kramer方法鉴定组之间的统计学显著性差异。进行配对t检验以分析不同制剂的相同喷雾事件内的统计学差异(P < 0.05)，并比较TED方法。
[0256]结果和讨论
[0257]使用合成磷脂(DMPC、DPPC和DSPC)制备CoQlO制剂，并比较在实施例1中分析的卵磷脂制剂的结果。因为CoQlO递送是经由分散体获得的，雾化可以产生包含不同量药物的液滴。因此，基于在NGI装置的各个阶段沉积的药物量，使用阶式碰撞取样器分析制剂的空气动力学性质。而且，基于在直接从喷雾器吹口递送的过滤器中收集的药物分析TED。分散体的喷雾性能与空气动力学性质结合可以提供比较制剂的可吸入潜能的基础。这些特征也用于鉴定有利于来自喷雾器的药物分散体的有效药物喷射的物理化学性质。
[0258]分散体的流体动力学尺寸(图16和表3)表明卵磷脂制剂药物颗粒尺寸主要地处于亚微米范围内。合成磷脂制剂存在一些较大颗粒，尽管制剂之间的Dv(X)和跨度的分析并不存在统计学差异(除了 DMPC和DSPC分散体的Dv (10))。使用DLS对药物粒径分布的进一步分析表明卵磷脂分散体存在具有比合成磷脂制剂更高的多分散性的较大纳米颗粒(图17)。在合成磷脂中，DSPC分散体呈现最大的药物纳米颗粒，而DMPC制剂呈现最高单分散性和特性。在加工之后，合成磷脂呈现一些微粒，尽管纳米级尺度的颗粒群体主要小于由CoQlO的卵磷脂分散体产生的药物颗粒。
[0259]卵磷脂分散体的ζ电势显著地高于合成磷脂分散体(图18)的ζ电势。不希望受到任何特定理论的束缚，根据卵磷脂的来源和提取方法，各种浓度不同磷脂的混合物可以导致可变的?电势值。合成磷脂的?电势值可归因于制剂中氯化钠的存在，因为在中性PH下离子强度的增加可提高带负电荷的磷脂如DMPC、DPPC和DSPC的ζ电势。
[0260]增加微流化器处理轮次可引起表面张力的下降(例如，可能是由于更有效地包封)。对于合成磷脂组合物`，观察到表面张力随着磷脂的酰基链中碳数目的增加而增加。制剂被设计为具有相同量的2.5%w/w的DMPC、DPPC和DSPC。然而，由于各相应酰基链中碳的数量不同，分子量稍有变化。因此，分散体中磷脂的摩尔浓度分别为36.9,34.1和31.6mM。磷脂在水分散体中的结构直接依赖于磷脂分子的数量。因此，不希望受到任何特定理论的束缚，据信在恒温下引起表面张力下降的"溶液"中可用的磷脂分子的数量可以解释表面张力的差异。值得注意的是，用卵磷脂——其是磷脂的混合物一一制备的CoQlO分散体的表面张力落入DMPC和DSPC的值之间(图19)。
[0261]颗粒特征比如尺寸、粒径分布、形状、电荷、可变形性以及颗粒与周围液体之间的相互作用可在分散系统的流变行为中起作用。为了评价分散体的流变学，将剪切应力作为剪切速率的函数绘图，并且结果与最佳流变模型拟合。Herschel-Bulkley模型(参见等式2和上述相应文字部分)最佳地代表大部分制剂。
[0262]幂定律(Power Law)模型与Herschel-Bulkley类似,不同在于其不提供屈服应力值。对于卵磷脂、DMPC, DPPC和DSPC分散体，标准误差分别为35.92±3.57,9.83±0.17、
10.27±0.35、21.15±8.17。Herschel-Bulkley 模型的三个要素都呈现在图 20 中。CoQlO的DSPC分散体服从幂定律，因此不存在屈服应力。有趣地是，制剂的屈服应力显示为统计学差异的，但是没有确定趋势。DSPC制剂具有比其它分析的样品显著更高的非牛顿粘度，可能是由于其明显的剪切稀化行为(η < I)。有趣地是，流动指数结果表明DPPC、DMPC和卵磷脂分散体分别呈现增加的剪切稠化行为(η > I)。
[0263]通过保持剪切速率和粘度分别作为自变量和因变量进一步分析流变学，以便将结果与水性分 散体的一般流动曲线拟合(图21)。图形表示呈现在图22中，其清楚地显示出所增强的DSPC制剂剪切稀化事件。涉及这些模型的相关等式显示在表4中。通过将这些曲线与流变模型拟合，据发现制剂呈现不同的行为(表5)。对于卵磷脂、DMPC、DPPC和DSPC分散体，标准误差分别为 93.49±8.60,43.27±10.55,41.34±8.57、16.00±4.74。
[0264]CoQlO的卵磷脂制剂与Sisko模型拟合，表明该研究的剪切速率范围落入与分散体的一般流动曲线相关的中-至-高剪切速率范围内。这通过表5中可见的小的特征时间和显示在图22中的较高剪切速率下的曲线形状得到证实。该结果也证实由Herschel-Bulkley模型的评价给出的剪切稠化行为(图20)。在研究的制剂中，仅仅卵磷脂分散体出现触变行为。这表明在所研究剪切速率范围中该分散体呈现的剪切稠化行为的结构恢复期间，剪切应力(例如剪切稀化事件)中止后的时间依赖性变化。因此，在剪切应力停止时，合成磷脂制剂快速恢复至其初始状态。
[0265]DMPC和DPPC分散体遵循Cross模型，因此都给出零_速率和无限速率粘度。然而，制剂的特征时间极大地不同，DMPC制剂显示最低值。这表明，与卵磷脂分散体类似，DMPC制剂落向与分散体的一般流动曲线相关的剪切速率上部范围(表5)，从而解释了第二牛顿平台期(3.66cP)大于第一牛顿区(1.13cP)。因此，DMPC分散体的流变行为与Cross模型相比更接近Sisko。为此,卵磷脂和DMPC分散体都呈现高于一(unity)的速率指数(或Cross速率常数)值，反映出在所研究的剪切速率范围中不存在幂定律区域。当在该特定范围内的粘度适当地从第一牛顿区延伸至第二牛顿区时，则Ι-m接近速率指数(rate index)η。在较高的剪切速率下，剪切稠化行为明显地从曲线形状证明(图22) APPC制剂的较大特征时间表明曲线更加朝向低剪切速率范围，并因此支持无限速率粘度小于零速率粘度。Cross速率常数接近于一，其表明在幂定律区域中一定程度的剪切稀化行为。图22中DPPC分散体的曲线形状的观察支持这些发现，并且相对低水平的剪切稠化行为存在于Herschel-Bulkley模型中(图20)。当与卵磷脂DMPC制剂相比时，该相对低水平的剪切稠化行为可归因于在较高剪切速率下流变学的差异。
[0266]DSPC的流变行为遵循Williamson模型。该分散体的统计学显著更高的特征时间结合流动曲线形状表明所研究的剪切速率范围落入分散体的一般流动曲线的低-中等剪切速率范围内(图22)。速率指数值反映在幂定律区域的剪切稀化行为(表5)。
[0267]如结合实施例1讨论的，研究振动筛网喷雾器连续和稳定地雾化分散体的能力并同时分析流体流变学而不是更简单的动态粘度测量可能是重要的。前述工作集中于分散介质本身的粘度而与周围液体内分散颗粒之间的相互作用无关。因为喷雾器的高频机械应力直接地转移到制剂，在较高剪切速率下流变学参数的分析可较好地转化为在振动膜附近实际发生什么。
[0268]将结果与流变模型拟合获得的一些标准误差值可能被认为比较高。不希望受到任何特定理论的束缚，据信这些值可以归因于使用目前的实施例的试验设计研究的有限剪切速率范围。虽然可以进行进一步和/或另外的实验来降低标准误差，但是，关于制剂对所施加应力的反应的了解提供了关于可从所述分散体的主动膜喷雾预见到什么的有价值信息。
[0269]为了比较制剂的喷雾性能，用实施例1中描述的开放台方法设置MalvernSpraytec⑧。图23中呈现的传输图显示15分钟持续时间的喷雾事件。在该持续时间结束时，传输值恢复至100%，表明测量合适地进行且没有检测器透镜雾化。为了评价这些制剂的喷雾性能，将传输图拟合线性回归以分析曲线的斜率。由所述斜率可以推断给定喷雾事件的稳定性。斜率和TAO结果呈现在图24中。如通过基本上零的斜率和最高的TAO表明的，对照(即，盐水)的雾化是随时间最稳定的。初始5分钟(300秒)，卵磷脂制剂显示出稳定的喷雾，接着传输增加。DMPC分散体显示出具有与卵磷脂相反的模式的传输分布。在喷雾开始时，观察到微小斜率至多约8分钟(480秒)，接着出现稳定的喷雾。DPPC和DSPC分散体在整个喷雾期间都呈现非常浅的斜率。
[0270]卵磷脂分散体显示出最高的斜率和低TAO(其与DMPC制剂相比不具有统计学差异)。尽管DPPC和DSPC制剂呈现类似的斜率(例如，非统计学差异的)，但是来自DSPC的TAO显示比来自DPPC的TAO更高的物质输出，尽管两种制剂都是稳定喷雾的。这些结果显示与物质输出(或ΤΑ0)结合分析传输图的斜率的重要性。在CoQlO的水性分散体之间，DSPC制剂呈现最佳结果，显示低斜率值和磷脂分散体之间最高的ΤΑ0。简而言之，所研究制剂中喷雾性能提高的顺序为:卵磷脂<DMPC<DPPC<DSPC。
[0271]这些发现可以与较高剪切速率下制剂的相应流变行为同时评价。在检查曲线(图22)时，在高剪切速率下，卵磷脂和DMPC分散体呈现第二牛顿平台后的特征剪切稠化行为，这得到其相应的低特征时间的证实。在剪切稀化事件之后，剪切稠化的发生可以归因于流体的二维分层后的排列不稳定性。高于临界剪切应力可引起分散颗粒的随机排列，导致粘度增加。随机排列可限制稳定的喷雾性能，如这两种制剂所示的。另一方面，DSPC呈现的幂定律区域的高特征时间和剪切稀化行为，以及在较小程度上的DPPC，在高剪切速率下的分散体可以解释它们的相对优良的喷雾性能。这些结果表明对应于在高剪切速率下的剪切稀化行为的高特征时间可以有利于喷雾性能，而剪切稠化(低特征时间)可以具有相反的影响。因此，这些结果表明在高剪切速率下的流变行为可以直接地与分散体的喷雾性能相关。
[0272]然而，这些数据表明在本文描述分散体的喷雾的情形中，物质输出可能与药物喷射不相关(例如，不直接相关)。因此，为了测量药物雾化和为了获得对制剂的空气动力学性质的了解，使用NGI和适应的DUSA分析CoQlO的磷脂制剂的体外沉积。对15分钟喷雾周期的初始和最终时间部分的药物沉积的分析允许与喷雾性能结合用于评价这些数据。
[0273]卵磷脂、DMPC、DPPC和DSPC制剂的TED呈现在图25中。经NGI和DUSA分析比较喷雾周期的初始阶段和最终阶段，CoQlO的卵磷脂分散体在药物雾化方面呈现统计学显著的降低。在喷雾开始和结束时喷射的药物量的这一差异证实使用LD从喷雾性能的结果观察到的斜率(25.99x10_3±2.80x10_3%/s)不仅与降低的物质输出有关，而且与雾化的药物量有关。总的来说，当与合成磷脂制剂相比时，卵磷脂分散体在初始和最终阶段也呈现显著更小的TED。
[0274]在NGI分析下，对于用合成磷脂制备的分散体，相同的喷雾事件内没有发现统计学差异。然而，使用DUSA方法，在相同喷雾事件内，DMPC分散体显示出较小的TED。然而，TED/DUSA结果可以与本分析更相关，因为包含药物的液滴直接沉积在过滤器中，而TED/NGI结果具有与NGI装置相关的潜在损失。与潜在损失无关，获得令人满意地质量平衡，因为在比较两种TED测定方法时没有确认统计学差异。在15分钟的喷雾周期内，来自DMPC分散体的喷雾性能测试的斜率(16.06x10_3±2.88x10_3%/s)与雾化药物量的差异一致。CoQlO的DPPC和DSPC分散体以近似相等地雾化。这些结果表明这些制剂都显示出稳定的喷雾(例如，如以相对小的线性回归斜率值定量的)。
[0275]可以影响肺部药物递送的空气动力学性质显示在图26和27中。与最终阶段相t匕，在喷雾的初始阶段卵磷脂制剂显示出如与沉积的药物质量分数相关的较高的液滴尺寸(图26)。DMPC制剂在较小的程度上显示出与卵磷脂制剂类似的模式。在整个15分钟喷雾事件中，DPPC和DSPC制剂具`有更平衡的液滴尺寸。关于沉积的药物量(与药物分数相反)，图27显示卵磷脂制剂的总体沉积在初始和最终阶段都低(例如，当与其它制剂相比时)。该结果与TED结果一致。在所研究的三种合成磷脂中，DMPC制剂呈现最低的沉积，其与TAO和TED结果一致。DPPC和DSPC制剂具有高药物沉积量，并在整个15分钟的喷雾事件中保持一致的空气动力学性质。
[0276]为了进一步比较雾化的分散体的空气动力学性质，将MMAD和GSD呈现在图28中。对于所有四种制剂，MMAD和GSD值最初相似。然而，到喷雾事件完成，所述值不同。这一行为表明包含药物纳米颗粒的喷射液滴的尺寸是磷脂依赖性的。明显地，对于卵磷脂和DMPC分散体，在相同的喷雾事件内观察到的传输图斜率的变化(图24)不仅反映在雾化的药物量上(TED结果，25)，而且反映在它们的体外NGI沉积曲线中显示的空气动力学性质上(图26和27)。随着喷雾的进展，雾化的液滴变得更小且更少。
[0277]可以通过分析细颗粒(例如，空气动力学尺寸低于5.39 μ m)获得对于肺沉积的喷雾输出潜能的进一步了解。图29A显示所研究制剂的TED NGI和TED DUSA值。TED NGI数据表明当比较15-分钟喷雾内的初始阶段和最终阶段时，仅仅卵磷脂制剂显示出雾化药物量的显著差异。TED DUSA值表明当比较15-分钟喷雾内的初始阶段和最终阶段时，卵磷脂和DMPC制剂都显示出雾化药物量的差异。TED DUSA结果可被认为更有意义，因为包含药物的液滴直接沉积在用于测量的过滤器中，而TED NGI结果可以具有在整个NGI设备气溶胶通道中的损失。图29B显示所研究制剂的FPDet和FPF值。对于在本实验条件下用AeronebPro?喷雾器雾化的所有分散体，FPF随时间提高，证实液滴尺寸在喷雾过程中减小。卵磷脂制剂的FPD在喷雾期间显著变化。雾化的DMPC分散体的MMAD值在喷雾期间降低，而FPD并没有统计学变化。DPPC制剂显示出稳定的喷雾性能，且因此在整个喷雾中显示出一致的TED值。虽然MMAD值不是统计学不同的，但是FPD结果表明到喷雾结束时DPPC制剂显示出较高的雾化药物量。对于DSPC制剂观察到类似的特性，但是仅基于该实施例，结果不是统计学显著的(P=0.08)。
[0278]图30显示含CoQlO颗粒的液滴的几何尺寸也随时间减小，特别是在卵磷脂和DMPC制剂中。在15分钟喷雾期间，DPPC和DSPC制剂的气溶胶显示出相对一致的(例如，类似于盐水对照的)液滴尺寸。空气动力学和几何学尺寸的相异性可归因于不同的实验设置(参见实施例1中讨论的 )。
[0279]表6表明本发明所显示出的具有到达肺的潜能(基于FPD)的空前高剂量，DPPC和DSPC剂型呈现最高的值。这些剂量大于之前使用相同类型的喷雾器(振动筛网装置，数据没有显亍)雾化的伊曲康唑纳米分散体的约10倍至40倍，并且大于之前使用Sidestream ? PortaNeb ?喷射喷雾器(Medic-Aid Ltd., UK)的布地奈德悬浮液(Pulmicort Respule ?, AstraZeneca, UK)雾化高达280倍。或许同等重要的，本发明允许验证喷雾的数量和质量(例如，浓注(bolus) vs.喷雾事件期间稳定的气溶胶)。
[0280]在某些情况下，精制可能是有效地药物负载所必需的。例如，在热高压均质化期间可发生水蒸发。类似地，所制备的小体积制剂(例如，IOOmL)可导致通过制造设备上沉积的药物损失。
[0281]最后，在喷雾事件期间观察到的喷雾性能的变化已经显示为对应于不同制剂之间空气动力学性质的差异。然而，这些制剂的流变行为显示为与用于连续地喷雾磷脂稳定的疏水性生物活性剂的纳米分散体的主动振动筛网喷雾器相容。分散体的各种成分(例如疏水性生物活性剂)的浓度在决定第二牛顿平台期后剪切稠化事件开始的临界剪切速率方面具有重要作用。因此，分散体的流变学的认识可用于鉴定在仍保持期望喷雾性能的同时最大的药物负载。喷雾器气溶胶产生通过将应力(例如，空气喷射流、超声力、振动筛网)应用到大块(bulk)液体制剂中或其上发生的。因此，本文提供的方法，包括使用LD技术分析喷雾性能和分散体的流变学研究的组合，提供了基于疏水性药物连续喷雾器的吸入疗法的制剂开发。
[0282]实施例3: CoQlO的可吸入制剂在小鼠中的肺部沉积和系统分布
[0283]实施例3呈现在肺部递送用合成磷脂制备的CoQlO制剂之后，在小鼠中体内全身分布、肺和鼻腔沉积的评价。基于上面给出的试验结果并且由于在肺中的磷脂生理出现，选择三种合成磷脂以稳定这些分散体:DMPC、DPPC和DSPC。不选择卵磷脂是因为其低体外沉积。给药装置包括接收来自Aeroneb Pro ?振动筛网喷雾器产生的气溶胶的仅鼻吸入室。结果显示小鼠肺部获得高以及持续剂量的CoQIO，其在理论暴露值的1.8至3.0%间变化。
[0284]材料和方法
[0285]材料:CoQlO由 Asahi Kasei Corp.(Tokyo, Japan)提供。Genzyme Pharmaceuticals (Liestal, Switzerland)提供1，2_ 二肉豆蘧酰基-sn-甘油基_3_磷酸胆碱(DMPC)U, 2- 二棕榈酰基-sn-甘油基_3_磷酸胆碱(DPPC)和1，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-憐酸胆喊(DSPC)。DMPC 也得自 Lipoid GmbH (Ludswighafen, Germany)。氯化钠(晶体，ACS 认证的)获自 Fisher Chemical (Fisher Scientific, Fair lawn, NJ, USA),和去离子水获自中央反渗透/软化器系统。小鼠约束管(restraint tubes)(项目E2QY-PC)、前鼻插入物(项目E2TE-)和后部夹持器(项目E2TA-N)均购自BattelleToxicology Northwest(Richland, WA, USA)? 风扇(12V, 0.10A,型号 0D4020-12HB)购自 Knight Electronics (Dallas, TX, USA)。HPLC 级己烧和 200proof 无水乙醇购自Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)。注射器(ImL)和针(规格 21G1 和 23G1)获自 BectonDickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)。肝素化管(1.3mL 微管肝素锂(LH)，具有螺帽密封，产品编号:41.1393.105)购自 Sarstedt AG&C0.(Numbrecht, Germany)。微量离心管(1.5mL，透明，不含 RNase/DNase，BL3152)获自 Bio-Link Scientific, LLC(ffimberley, TX,USA)。
[0286]制剂:如实施例2描述的，使用高压均质化制备制剂。简而言之，在搅拌下水化过夜后，在55°C下，将在水中包含2.5%w/w的磷脂(DMPC、DPPC或DSPC)的磷脂分散体加入到熔融的CoQlO (4%w/w)中。使用具有8mm转子叶片的Ultra-Turrax ? TP18/10均质器，通过以20，OOOrpm高剪切混合(IKA-Werke GmbH, Staufen, Germany) 5分钟预分散所述制剂。接着，使制剂在约30，OOOpsi下通过M-1lOP Bench-top Microfluidizer ?(Microfluidics, Newton, MA, USA)处理50轮，同时保持温度在55°C至65°C。在微流化之后，将0.9%w/v的氯化钠加入到最终制剂中。在不存在药物(未加入CoQlO)的情况下，使用DPPC类似地制备用于对照组的制剂。
[0287] 向小鼠的肺部递送:将动物4只一组笼养，并保持正常啮齿类动物食物饮食与自由饮水。如图31所示，组装每次能够给药六只小鼠的仅鼻室装置。在给药之前，使⑶-1?IGS ICR 小鼠(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA, USA)持续3天每天单独地适应约束管约10分钟，受前鼻插入物和后部夹持器限制。将给药装置放置在通风橱内以收集脱逸的包含药物的气溶胶。为了避免通风橱提供的气流的影响，在管系统的末端放置锥形(erlenmeyer)容器作为缓冲。空气流率设置为lL/min以确保使用Aeroneb Pro?振动筛网喷雾器(Aerogen, Galway, Ireland)适当地将药物雾化到仅鼻室(内体积:230mL ;直径:3.8cm ;长度:20.3cm)中。在制备之后，所有制剂(盐水对照、DMPC、DPPC和DSPC)在给药时都向每只重量在23至33g的小鼠给药15分钟。各单剂量研究组由36只雄性动物组成。在各个时间点(雾化事件结束后0.5、1、3、8、24和48小时)，将随机地选自相同制剂的不同给药事件的六只动物通过用二氧化碳麻醉处死。作为收集方法的部分，通过心脏穿刺抽血，获取肺，并进行鼻腔洗涤。提取样品用于与串联质谱偶联的液相色谱(LC/MS/MS)分析。
[0288]估计剂量:为了估计在该研究期间小鼠暴露的剂量，假定仅鼻室逐渐地填充含CoQlO的气溶胶。因此，药物浓度稳定地增加直至其达到平台期。在稳态时，也假定药物进入小室的速率等于药物离开小室的速率(dC/dt=0)。因此，可使用等式5测量在任何给定时间下小室内部的药物浓度:
[0289]C=FPDr/F* (1- e'- λ t)(等式 5)
[0290]其中C为药物浓度，FPDr为如在上述章节确定的细颗粒剂量(空气动力学截止直径低于5.39 μ m/分钟的颗粒的量)递送的速率，F为气流速率，λ为室空气-变化率，t为在喷雾期间内的任何给定时间。室空气-变化率λ可以根据等式6，基于气流速率和室内体积V确定:
[0291]X=F/V (等式 6)
[0292]基于这些假定，下述等式7描述递送至小鼠的估计剂量:
【权利要求】
1.包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体的可吸入药物组合物，所述组合物包含: 平均直径为约30至500nm的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质， 其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占所述组合物的约0.1至30%w/w，所述磷脂占所述组合物的约0.1至30%w/w，并且所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内，和 其中，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的疏水性生物活性剂的连续雾化。
2.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述水性分散介质包括水或水性盐溶液。
3.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述脂质体颗粒的分散体为连续可呼吸气溶胶的形式，其包含含有脂质体颗粒的分散体且具有约I至5 μ m的质量中值空气动力学直径(MMAD)的多个水性液滴。
4.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物特征在于经至少15分钟的连续雾化，平均百分传输率(APT)为约50至100%。
5.权利要求1的可吸入药物组合物，其中经至少15分钟的连续雾化，所述多个液滴具有约I至5 μ m的MMAD。
6.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物特征在于在贮存至少七天之后，APT 为约 50 至 100%。
7.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物特征在于APT为约50至100%、约60 至 100%、约 70 至 100%、约 80 至 100%、约 90 至 100%、约 50 至 95%、约 60 至 95%、约 70 至95%、约80至95%、约90至95%、约50至90%、约60至90%、约70至90%、约80至90%、小于约50%、小于约55%、小于约65%、小于约70%、小于约75%、小于约80%、小于约85%、小于约90%、小于约95%、小于约100%或其中的任何子范围或值。
8.权利要求1的可吸入药物组合物，其中在贮存至少七天之后，所述脂质体颗粒具有约30至500nm的平均直径。
9.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物特征在于非牛顿流体特性。
10.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物具有约0.4,0.5,0.6,0.7,0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 或 1.3 的流动指数(η)。
11.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物具有约0.1,0.15,0.2、1、100或IlOcP的粘度U)。
12.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物具有约2.5、1.5、-2.5、-10、-50、-55 或-60mV 的 ζ 电势。
13.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物具有约25、30、35、40、45或50mN/m的表面张力。
14.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物具有约11、12、13、14、15、16、17或18mPa的屈服应力(σ )。
15.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述脂质体颗粒的分散体具有约30至100nm、50 至 150nm、30 至 300nm、100 至 400nm 或 200 至 300nm 的平均直径。
16.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物具有约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5、.0.6 或 0.7 的 PDI。
17.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物不包括调理作用缩减剂。
18.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述组合物具有至少约40、45、50、55、60、.65、70、75、80、85、90、95 或 100% 的总气溶胶输出(TAO)。
19.权利要求3的可吸入药物组合物，其中所述MMAD为约1、2、3、4或5μπι。
20.权利要求3的可吸入药物组合物，其中所述多个液滴具有小于约2.5,2.4,2.3、.2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、.0.3、0.2或0.1的几何标准偏差(GSD)。
21.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述疏水性生物活性剂包括CoQIO。
22.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述疏水性生物活性剂占组合物的约4%w/w或以下。
23.权利要求1的可吸入药物组合物,其中所述疏水性生物活性剂占组合物的约l%w/Wo
24.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述磷脂包括DPPC、DSPC、DMPC或其组合。
25.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述磷脂占组合物的约3%w/w或以下。
26.权利要求1的可吸入药物组合物，其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约1:1、.4:3 或 4:2.5。
27.权利要求1的可吸入药物组合物，进一步包含低于组合物的约1.0%w/v的量的氯化钠。
28.权利要求1的可吸入药物组合物，进一步包含使得组合物与人的肺基本上等渗的量的盐。
29.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述分散体为悬浮液、纳米悬浮液、乳液或微乳液。
30.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述疏水性生物活性剂包括一种或多种疏水性抗炎类固醇、NSAID剂、抗菌剂、抗真菌剂、化疗剂、血管舒张剂或其组合。
31.包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体的可吸入药物组合物，所述组合物包含: 平均直径为约30至300nm的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含CoQIO、DPPC和水性分散介质， 其中CoQIO:DPPC的比率为约5:1至约1:5,CoQlO占组合物的约0.1至6%w/w，所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内，和 其中，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的该疏水性生物活性剂的连续雾化。
32.包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体的可吸入药物组合物，所述组合物包含: 平均直径为约30至300nm的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含CoQIO、DSPC和水性分散介质， 其中CoQIO:DSPC的比率为约5:1至约1:5,CoQlO占组合物的约0.1至6%w/w，所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内，和 其中，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的该疏水性生物活性剂的连续雾化。
33.包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体的可吸入药物组合物，所述组合物包含: 平均直径为约30至300nm的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含CoQIO、DMPC和水性分散介质， 其中CoQIO:DMPC的比率为约5:1至约1:5，CoQlO占组合物的约0.1至6%w/w，所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内，和 其中，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的该疏水性生物活性剂的连续雾化。
34.包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体的可吸入药物组合物，所述组合物包含: 平均直径为约30至500nm的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质， 其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w,所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w,并且所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内，和 其中，当连续雾化时，所述组合物能够实现至少约500 μ g/g湿肺组织的生物活性剂浓度。
35.制备可吸入药物组合物的方法，其包括步骤: 水化磷脂，从而形成水化的磷脂； 混合该水化的磷脂、疏水性生物活性剂和水性分散介质，从而得到混合物；和均质化该混合物，从而得到脂质体颗粒的分散体，其包含分散在水性分散介质内的磷脂和疏水性生物活性剂，且具有约30至500的平均直径， 其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w,且所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w,和 其中，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的该疏水性生物活性剂的连续雾化。
36.权利要求35的方法，其进一步包括: 雾化所述脂质体颗粒分散体，从而形成包括多个液滴的可呼吸气溶胶，各个液滴包含脂质体颗粒的分散体且具有约I至5 μ m的质量中值空气动力学直径(MMAD)。
37.权利要求35的方法，其中混合包括以约10，000至20，OOOrpm且在约50至65°C下高至约5分钟的高剪切混合。
38.权利要求35的方法，其中均质化包括微流化。
39.权利要求35的方法，其中均质化包括在约30，OOOpsi且在约50至65°C下约1_50轮的高压均质化。
40.权利要求35的方法，其中均质化包括超声均质化。
41.权利要求35的方法，其中雾化包括振动筛网喷雾。
42.施用可吸入药物组合物的方法，其包含步骤: 雾化脂质体颗粒的分散体，从而形成包含多个具有约I至5 μ m的质量中值空气动力学直径(MMAD)的液滴的可呼吸气溶胶， 其中所述脂质体颗粒的分散体具有约30至500nm的平均直径，各个脂质体颗粒包含分散在水性分散介质内的疏水性生物活性剂和磷脂，其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w,所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w,和 其中，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的该疏水性生物活性剂的连续雾化；和 将治疗有效量的所述疏水性生物活性剂递送至需要治疗的受试者的肺。
43.权利要求42的方法，其中雾化包括振动筛网喷雾。
44.权利要求42的方法，其中所述气溶胶特征在于经至少15分钟的连续雾化，其APT为约50至100%ο
45.权利要求42的方法，其中所述气溶胶特征在于APT为约50至100%、约60至100%、约70至100%、约80至100%、约90至100%、小于约50%、小于约60%、小于约70%、小于约80%、小于约90%或小于约100%。
46.权利要求42的方法，其中经至少15分钟的连续雾化，所述多个液滴具有约I至5 μ m 的 MMAD。
47.权利要求42的方法，其中所述MMAD为约1、2、3、4或5μπι。
48.权利要求42的方法，其中所述液滴具有至少约2.0的几何标准偏差(GSD)。
49.权利要求42的方法，其中递送实现至少约1、5、10、15或20%的沉积质量分数。
50.权利要求42的方法，其中递送实现向肺的局部递送而基本没有全身性递送。`
51.权利要求42的方法，其中在施用后至少48小时，递送在肺中实现升高的疏水性生物活性剂的量。
52.权利要求42的方法,其中当连续雾化时,所述组合物能够实现至少约500μg/g湿肺组织的生物活性剂浓度。
53.权利要求42的方法，其中递送治疗有效量的疏水性生物活性剂包括计量生物活性剂的剂量。
54.权利要求42的方法，其中所述受试者患有肺癌。
55.权利要求42的方法，其中所述受试者患有下述疾病的一种或多种:哮喘、变态反应、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、急性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、肺炎、结核病、肺水肿、急性呼吸窘迫综合征、肺尘埃沉着病、间质性肺病、肺水肿、肺栓塞、肺动脉高血压、胸腔积液、气胸、间皮瘤、肌萎缩性侧索硬化、重症肌无力和肺病。
56.通过包括下述步骤的方法制备的可吸入药物组合物: 水化磷脂，从而形成水化的磷脂； 混合该水化的磷脂、疏水性生物活性剂和水性分散介质，从而得到混合物；和均质化该混合物，从而得到脂质体颗粒的分散体，其包含分散在水性分散介质内的磷脂和疏水性生物活性剂，且具有约30至500的平均直径， 其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w,且所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w,和 其中，当向受试者施用时，所述组合物特征在于足以向受试者提供治疗剂量的该疏水性生物活性剂的连续雾化。
57.包含适于连续雾化的脂质体颗粒分散体的可吸入药物组合物，所述组合物包含: 平均直径为约30至500nm的脂质体颗粒的分散体，各个脂质体颗粒包含疏水性生物活性剂、磷脂和水性分散介质， 其中疏水性生物活性剂:磷脂的比率为约5:1至约1:5，所述疏水性生物活性剂占组合物的约0.1至30%w/w,所述磷脂占组合物的约0.1至30%w/w,并且所述脂质体颗粒分散在所述水性分散介质内，和 其中，当连续雾化时，经15秒的时间所述组合物能够实现至少约2，900 μ g的总喷射剂量(TED)。
58.权利要求57的可吸入药物组合物，其中所述TED为经15秒的时间至少约3，600、3，900、4，300 或 4，600 μ g。
59.权利要求1的可吸入药物组合物，其中所述连续雾化的持续时间为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50 或 60 分钟。
60.权利要求1的可吸入药物组合物，其进一步包含占总组合物0.001-5%重量的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物。`
【文档编号】A61K9/00GK103732214SQ201280040008
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年6月18日 优先权日:2011年6月17日
【发明者】N·R·纳莱恩, J·P·麦库克 申请人:博格有限责任公司