林蛙提取中药复合制剂及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的用途

林蛙提取中药复合制剂及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的用途
【专利摘要】一种林蛙提取中药复合制剂及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的用途，属于中药学制剂【技术领域】。是将林蛙干除杂除尘后粉碎，再加入复合酶水解液，取离心后的上层上清液；将剩余混合物研磨后剪切，喷雾干燥成粉末状，将该超微粉加入到醋酸中超声后纱网过滤，离心后取上清液减压浓缩；从而得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物；将上述物质混合得到林蛙提取混合液，再与复合药物提取液混合，从而得到林蛙提取中药复合制剂；林蛙提取中药复合制剂是中药制剂，无任何副作用，并且能够给予细胞充足营养，修复受损细胞；抗菌肽可结合钙离子，增强杀菌效果。本发明对皮肤粘膜无刺激、杀菌速度快、病灶部位愈合快、使用简便、无色无味，适合不同年龄人群使用。
【专利说明】林蛙提取中药复合制剂及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的用途

【技术领域】
[0001]本发明属于中药学制剂【技术领域】，具体涉及林蛙提取中药复合制剂及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的用途。

【背景技术】
[0002]痤疮是好发于毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，好发于颜面、胸背，以粉刺、丘疹、脓疤、结节、囊肿及疤痕为特征，常伴皮脂溢出。多发于青年男女，又被称为“青春痘”，古代称面疮、酒刺、肺风等。但随着生活压力加大和综合因素的影响，痤疮的发病年龄有提高的趋势。病情缠绵难愈且留下瘫痕，不仅影响美观，还给患者带来严重的精神负担，影响工作和社交活动。
[0003]目前，国内对林蛙皮抗菌肽进行了研究，申报的专利也在增多，以林蛙为关键词，检索国内外专利，没有查到国外关于林蛙的专利，国内专利中CN1216768A “生物抗菌肽及其制备方法”是涉及一种具有广谱抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其制备方法；CN1583166A “林蛙抗菌肽喷雾剂及其制备方法”、CN1583165A “林蛙抗菌肽凝胶剂及其制备方法”是涉及保护林蛙皮肤抗菌肽以喷雾剂和凝胶剂两种形式用于临床皮肤感染、烧伤烫伤感染领域；CN1679632A“林蛙镇痛水提物及其制备方法及其制备方法”是关于保护从林蛙皮中提取的一种具有镇痛作用的林蛙镇痛水提物及其制备技术。均是以林蛙皮为原料，提取了林蛙皮抗菌肽。CN103073628A—种利用超声波从林蛙体中提取抗菌肽的生产制备方法是以林蛙体为原料采用超声提取抗菌肽，提取的抗菌肽是分子量为4KDa最适pH值为3.5，等电点Pl值为8.0?10.5的碱性多肽。以上专利均以抗菌肽为保护内容，申请保护其在抗菌方面的作用，所述抗菌是指抵抗细菌和真菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌及临床耐药菌克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、酵母菌的一种或多种；并且抗菌治疗途径均为外用给药。CN103432058A “林蛙胶原蛋白液及其制备工艺”是以林蛙皮提取物、西洋参皂甙、五味子浸出液、芦荟提取物和水配制而成；CN102492760A “一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法”是以干东北林蛙皮为原料；CN102229972A “制备林蛙皮胶原蛋白肽的方法”是以林蛙皮为原料，以上三个专利均是以林蛙皮为原料或主要原料提取林蛙皮中所含的胶原蛋白。


【发明内容】

[0004]本发明的目的之一提供一种林蛙提取中药复合制剂，其由如下步骤制备得到:
[0005](I)君药林蛙提取混合液的制备
[0006]①45?65重量份林蛙干(林蛙干为除脂除卵的林蛙干体)除杂除尘后分别经20?100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以下，按照Ig:1?1mL的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶I?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%，风味蛋白酶
I?3wt%，酶解温度为50?55 °C，酶解时间为I?2h，酶解pH为7.0?7.5，而后85?90°C下灭酶5?15min,将混合物在温度10?30°C时离心,离心时间为I?5min,离心转速为2000?4000rpm，取离心后混合液体积20?40%的上层上清液，此时上层上清液中含有林蛙干短肽胶原蛋白(由于离心力的作用，短链胶原蛋白将集中在上层上清液中，长链蛋白分子将会集中在混合液的中下层剩余混合物中)，其分子量为2?3KDa，等电点pi值为
7.5?7.8，其中碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)占上层上清液的11.04?12.89%(质量比)，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占上层上清液的17.99?19.13% (质量比)。
[0007]②将上清后剩余混合物(原体积的60?80% )，放入胶体磨，研磨2?15min，使混合物的平均粒径在300 μ m以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切I?15min，使混合物平均粒径在100?200 μ m之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋白后剩余的纤维、骨质等物质的超微粉；
[0008]将上述超微粉加入到质量浓度为2?10%醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比为10?40mL:lg，在4?30°C下超声5?75min ;再经150 μ m纱网过滤，将150 μ m纱网上面未过滤物质加入质量体积比为Ig:1?8mL的0.01?0.03mol/L的氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为500?600W，微波时间3?9min，再次经150 μ m纱网过滤；合并两次滤液，30?50°C下搅拌10?30min,搅拌速度为100?200rpm ;搅拌后的滤液离心,离心温度为4?30°C，离心时间为2?40min，离心转速为2000?15000rpm ;取上清，减压浓缩，压力为600?700托，温度为65?70°C，浓缩体积比为8?40:1 ;此时得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物，多糖的分子量为I?5KDa ;抗菌肽的分子量为I?3KDa，其等电点pi值为
7.5?8.0，且其中碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)占多糖、抗菌肽和钙离子的混合物的11.28?13.05% (质量比)，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占多糖、抗菌肽和钙离子的混合物的10.01?11.47% (质量比)；
[0009]③将步骤①和步骤②的产物混合，得到林蛙提取混合液；
[0010](2)复合药物提取液的制备
[0011]①称取20?30重量份灰葡巴、I?3重量份苍术、I?2重量份百部、I?2重量份藿香、I?3重量份金银花、I?重量2份牛膝，混合后加入质量分数90?100 %的乙醇中浸泡I?10h，乙醇的体积与上述物质质量和的比例为I?20mL:lg ;然后100?300 μ m纱网过滤，滤液15?30°C、3000?6000rpm条件下离心10?20min,去沉淀后，85?100°C加热浓缩，浓缩体积比为24?8:1，得乙醇提取液；
[0012]②称取I?3重量份五倍子、I?3重量份苦参、I?3重量份马齿觅、I?2重量份蛇床子、I?3重量份黄柏、I?3重量份薄荷叶、I?3重量份宪活、I?2重量份防己、I?3重量份白癖皮、I?2重量份胡黄连、I?2重量份地肤子、I?3重量份红花、I?2重量份桂枝、I?3重量份铁冬青，混合后加入水浸泡I?24h，水的体积与上述物质质量和的比例为10?25mL:lg ;然后100?300 μ m纱网过滤，15?30°C、3000?7000rpm条件下离心10?20min，去沉淀后，85?100°C加热浓缩，浓缩体积比为24?8:1，得水提取液；
[0013]③将上述乙醇提取液与水提取液混合，搅拌10?30min，搅拌速度为100?400rpm，得复合药物提取液；
[0014](3)将步骤(I)制得的林蛙提取混合液与步骤(2)制得的复合药物提取液混合，从而得到林蛙提取中药复合制剂。
[0015]所述林蛙提取中药复合制剂可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂或湿巾等外用剂型。
[0016]所述林蛙提取中药复合制剂可以与化妆品上可接受的载体或赋形剂形成相关化妆品，所述化妆品可以为洗面奶、化妆水、洁肤水、平衡水、乳液、面霜、面膜、浴液等日化产品O
[0017]所述林蛙提取中药复合制剂可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为口服液、颗粒剂、混悬液、乳剂等口服剂型。
[0018]本发明的目的之二是提供一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合软膏剂，其由如下步骤制备得到:
[0019](I)油相的制备:取5?15重量份石腊、2?5重量份单硬脂酸甘油脂、5?10重量份白凡士林、5?10重量份液体石腊、I?5重量份司盘40、I?5重量份乳化剂0P、1?3重量份对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；
[0020](2)将步骤(I)制得的油相与由45?65重量份林蛙干按上述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂分别加热至70?100°C，将林蛙提取中药复合制剂加入到所述油相中，边加料边搅拌通过自体冷却至室温，再经纳米匀质机匀质4?7次，115?121°C灭菌10?30min ;然后将I?3重量份冰片加热到70?100°C后过0.45 μ m膜，无菌条件下与上述灭菌后的产物混合均匀，即得到治疗痤疮的林蛙提取中药复合软膏剂。
[0021]用法用量:外用，每日早晚两次患部涂敷，I?3mL/次，7天为I疗程。
[0022]本发明的目的之三是提供一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合乳液，其由如下步骤制备得到:
[0023](I)将由45?65重量份林蛙干按上述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂与5?10重量份甘油、0.1?0.5重量份三乙醇胺、60?75重量份超纯水充分混合，搅拌，搅拌温度15?30°C，搅拌时间10?40min，搅拌速度为200?300rpm，形成水相；
[0024](2)将2?10重量份硬脂酸，I?5重量份十八醇，I?5重量份十六醇，2?10重量份白油，0.1?2重量份Twenn-60,1?5重量份羊毛脂,0.1?I重量份橄榄油混合，搅拌，搅拌温度20?50°C,搅拌时间10?30min,搅拌速度为200?500rpm,形成油相；
[0025](3)将油相与水相在20?50°C下混合搅拌，再加入0.1?0.3重量份香精、0.01?0.1重量份布罗波尔、0.01?0.1重量份尼泊金丙酯，再次搅拌，搅拌温度20?50°C，搅拌时间10?30min,搅拌速度为200?400rpm,经纳米勻质机2?7次,既得林娃提取中药复合乳液。
[0026]用法用量:外用，每日早晚两次患部涂敷，I?3mL/次，7天为I疗程。
[0027]本发明的目的之四是提供一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合面膜，其由如下方法制备得到:
[0028]将由45?65重量份林蛙干按上述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂与2?10重量份甘油、2?6重量份1，3-丁二醇、0.1?2重量份透明质酸、I?5重量份熊果苷、0.1?2重量份卡波树脂、0.1?I重量份泛醇、2?8重量份维生素C脂质体、0.1?2重量份三乙醇胺、0.1?I重量份聚乙二醇-60氢化蓖麻油、0.1?2重量份尼泊金丙酯、0.1?0.5重量份茉莉香精和70?80重量份超纯水混合，搅拌，搅拌温度20?50°C，搅拌时间10?30min,揽祥速度为200?400rpm,揽祥后115?121°C灭菌10?20min ；自体冷却至室温后加入到放有无菌无纺布(15CmX15Cm)独立包装袋内，密封即得林蛙提取中药复合面膜。
[0029]本发明的目的之五是提供一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合口服制剂，其由如下步骤制备得到:
[0030](I)减压浓缩:将由45?65重量份林蛙干按上述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂在减压条件下进行蒸馏，压力在8X 13?3X 14帕，温度为50?85°C，浓缩比为I?5:1，得浓缩液；
[0031](2)将I?5重量份醋酸锌缓慢加入到浓缩液中，边加料边搅拌；加完后用0.lmol/L NaOH调节pH为6.2?6.5，搅匀后使其自然沉降，自体冷却至室温过夜；
[0032](3)0.45 μ m滤膜过滤后，向得到的澄清液中加入5?15重量份柠檬酸、5?25重量份蜂蜜、5?30重量份白砂糖，温度在50?65°C时，100?200rpm搅拌，搅拌时间为10-25min，过滤，再向清液中加入5?15重量份黄原胶和5?15重量份山梨酸钾，经0.22 um滤膜精滤；
[0033](4)灌装压盖:在无菌条件下灌装，压盖封口 ；
[0034](5)灭菌:加热到62?65°C，保持30?40min，自体冷却至室温即得林蛙提取中药复合口服制剂。
[0035]用法用量:内服,每日早晚两次口服，20mL/次,7天为I疗程。
[0036]本发明的积极效果在于:林蛙提取中药复合制剂是中药制剂，无任何副作用，所含短肽胶原蛋白在灰蔸巴多糖的作用下可更好的进入正常细胞，给予细胞充足营养；抗菌肽可结合钙离子，增强其对真菌细胞壁的破坏，使五倍子、苦参、马齿苋、蛇床子、黄柏、薄荷叶、羌活、防己、苍术、白癣皮、胡黄连、地肤子、百部、红花、桂枝、藿香、金银花等中药的有效杀菌成分进入真菌细胞达到杀菌效果；灰蔸巴、红花、牛膝、铁冬青等活血有效成分可与林蛙短肽胶原蛋白一同修复受损细胞。本发明对皮肤粘膜无刺激、杀菌速度快、病灶部位愈合快、使用简便、无色无味，适合不同年龄人群使用。

【专利附图】

【附图说明】
[0037]图1:林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图。
[0038]采用Tricine电泳法测短肽胶原蛋白分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，得出所含短肽胶原蛋白分子量约为2?3KDa。
[0039]图中左侧为标准的marker，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施例一中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例二中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例四中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图。
[0040]图2:多糖分子量标准曲线。
[0041]以标准葡聚糖Tl (分子量1000)、T3 (分子量3000)、Τ5 (分子量5000)、Τ10 (分子量10000)，蓝葡聚糖(分子量2000000)为标准品，经S印hadex G-25凝胶柱(10cmX 1.5cm)以超纯水洗脱，流速为1.2mL/min, 254nm检测多糖分子量分布,计算出每种标准葡聚糖糖峰洗脱体积。以分子量为200万的蓝葡聚糖和葡萄糖作为标准糖来确定层析柱的外水体积Vo和总体积Vt，Ve为总体积减去外水体积。以Ve/Vt为横坐标，Ig(Mw)为纵坐标作标准曲线，计算多糖分子量的公式为:
[0042]Ig(Mw) = (K1 - K2) Ve/Vt
[0043]Mw:多糖分子量；
[0044]Ve:待测样品的糖峰洗脱体积；
[0045]Vo:分子筛排阻层析柱的外水体积；
[0046]Vt:分子筛排阻层析柱的总体积；
[0047]KpK2S 常数。
[0048]以蓝葡聚糖和不同分子量葡萄糖标准制作得出多糖分子量标准曲线；
[0049]图3:林蛙提取混合液所含多糖经S印hadex G_25凝胶柱层析得到的洗脱曲线。
[0050]采用凝胶层析制备方法检测，用S印hadex G_25凝胶柱层析254nm下紫外检测仪测定林蛙提取混合液洗脱曲线，得出洗脱体积Ve。将洗脱体积Ve，带入公式Ig(Mw)=(K1 -K2) Ve/Vt，根据标准葡聚糖曲线(图2所示曲线)，算出林蛙提取混合液所含多糖分子量Mw约为I?5Kda。
[0051 ] 图4:混合多糖标准RP-HPLC分析图谱。
[0052]采用高效液相色谱法测定绘制单糖标准曲线，称取多糖标准样品，加入ImL无水盐酸-甲醇，充N2封管后，100°C水解16h后吹干液体。甲醇解后的多糖标准样品经干燥后，加入2mol/L三氟乙酸2mL，120°C充N2封管水解3h，水解产物倒入蒸发皿中，加入适量无水乙醇45°C水浴蒸除三氟乙酸。PMP柱前衍生化及其处理，取0.5mL PMP试剂和0.5mL0.3mol/L的NaOH溶液于蒸发皿中，将干燥物溶解后取其中的0.1 mL于小离心管中，7 O °C水浴30min。进行高效液相检测。
[0053]高效液相色谱分析条件
[0054]仪器:Shimadzu LC_14ATvp液相色谱仪，附SPD-10AVD紫外检测器
[0055]色谱柱:DIKMAInertsil 0DS-3 μ m(150X4.6mm)
[0056]检测温度:35°C
[0057]检测波长:245nm
[0058]洗脱液:82%PBS (0.1M, pH7.0), 18% Acetonitrile (v/v)
[0059]流速:1.0mT ,/mi η
[0060]图5:林蛙提取液所含多糖组分的RP-HPLC分析图谱。
[0061]采用高效液相法分析其单糖组成情况，利用混合多糖的标样确定组分中单糖的比例。林蛙提取混合液中含有的单糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸，其中鼠李糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖的比例约为1:4:6:12:7:5:3(体积比)，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=
1:1(体积比)；
[0062]图6:林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图。
[0063]采用Tricine电泳法测抗菌肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，得出所含抗菌肽分子量约为I?3Kda。
[0064]图中左侧为标准的marker，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施例一中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例二中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例四中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图。

【具体实施方式】
[0065]下面结合实施例对本发明作进一步描述。本发明所用林蛙干产自是我国东北地区长白山麓。中国林娃(Rana temporaria chensinensis)俗称田鸡、哈士蟆、雪哈等,在动物分类上属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是我国东北地区长白山麓的特有品种，属于药、食两用的珍贵蛙种，并且资源丰富。
[0066]实施例一林蛙提取复合中药制剂的制备
[0067](I)林蛙提取混合液的制备
[0068]将林蛙干54g (林蛙干为除脂除卵的林蛙干体)除杂除尘后分别经20目、40目、80目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500μπι以下，按照Ig:8mL的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶3wt %、胰蛋白酶2wt %，风味蛋白酶Iwt %，酶解温度为55°C，酶解时间为lh，酶解pH为7.2，而后90°C、1min灭酶，将混合物在温度25°C时离心，离心时间为2min，离心转速为3500rpm，取离心后混合液总体积30%的上层上清液，此时提取了林蛙干中含有的短肽胶原蛋白；
[0069]上层上清液所含胶原蛋白中(紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定氨基酸质量分数)精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量(相对于上层上清液的质量百分数)分别为3.12%,7.43%,0.73%，天冬氨酸、谷氨酸的含量(相对于上层上清液的质量百分数)分别为7.86%、11.19%。
[0070]取上清后剩余混合物(原体积的70% )，放入胶体磨，研磨8min，使混合物的平均粒径在300 μ m以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切3min，使混合物平均粒径在100?200 μ m之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋白后剩余纤维、骨质等物质的超微粉；
[0071]将纤维、骨质等物质的超微粉加入到质量浓度为7%醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比(mL:g)为15:1。超声，超声时间为:35min，超声温度为20°C;过滤，经150μπι纱网过滤；150 μ m纱网上面未过滤物质加入质量体积比(g:mL)为1:3的0.03mol/L氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为500W，微波时间5min，再次经150 μ m纱网过滤；合并两次滤液，40°C，搅拌15min，搅拌速度为120rpm ;搅拌后的滤液离心，离心温度为20°C，离心时间为lOmin，离心转速为5000rpm;取上清，减压浓缩，压力为650托，温度为65°C，浓缩体积比为12:1 ;此时得到多糖、抗菌肽和钙离子(钙离子的检测采用EDTA滴定法检测)的混合物；
[0072]混合物中多糖(Sephadex G - 25凝胶柱分离收集单糖,高效液相色谱法测定单糖组成)主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸组成，其中含单糖鼠李糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖约为
1:4:6:12:1:0.5:1(体积比)，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=1:1(体积比)；
[0073]混合物所含抗菌肽中(紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定氨基酸质量分数)精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量(相对于混合物的质量百分数)分别为2.73%,8.16%,0.69%，天冬氨酸、谷氨酸的含量(相对于混合物的质量百分数)分别为4.47%,5.98%0
[0074]将短肽胶原蛋白、多糖、抗菌肽、钙离子混合，得到林蛙提取混合液130ml，其中含有隹丐离子 104mg(80mg/100ml)。
[0075](2)复合药物提取液的制备
[0076]称取灰葡巴27g、苍术lg、百部2g、藿香Ig,金银花3g,牛膝Ig,加入12倍体积(mL:g，乙醇的体积为420mL)的质量分数95%乙醇浸泡8h，300 μ m纱网过滤，20°C、4000rpm离心12min，去沉淀后，90°C加热浓缩，浓缩体积比为15:1，得乙醇提取液；称取五倍子lg、苦参2g、马齿觅lg、蛇床子lg、黄柏lg、薄荷叶lg、宪活2g、防己lg、白癣皮lg、胡黄连2g、地肤子lg、红花lg、桂枝lg、铁冬青lg，加入15倍体积(mL:g，水的体积为255mL)的水浸泡14h, 300 μ m纱网过滤,20°C、5000rpm离心15min,去沉淀后,90°C加热浓缩,浓缩体积比为16:1 ;得水提取液；将乙醇提取液与水提取液混合，搅拌20min，搅拌速度为300rpm，得复合药物提取液；
[0077]将林蛙提取混合液与复合药物提取液充分混合，得到林蛙提取液中药复合制剂，体积是230mL。
[0078]实施例二林蛙提取中药复合软膏剂的制备
[0079]处方组成(按重量份):林娃干54份,灰葡巴27份,五倍子I份,苦参2份,马齿苋I份，蛇床子I份，黄柏I份，薄荷叶I份，羌活2份，防己I份，苍术I份，白癣皮2份，胡黄连2份，地肤子I份，百部2份，红花I份，藿香I份，桂枝I份，金银花3份，牛膝I份，铁冬青I份，石蜡8份，液体石蜡6份，白凡士林8份，单硬脂酸甘油酯3份，司盘402份，乳化剂0P3份，对羟基苯甲酸乙酯I份，冰片I份。
[0080]制备方法:
[0081](I)林蛙提取中药复合制剂的制备
[0082]称取林娃干54g(中国林娃长白山亚种,购自吉林大药房)，灰葡巴27g(购自成都药房)，五倍子lg，苦参2g,马齿觅Ig,蛇床子lg，黄柏lg，薄荷叶lg，宪活2g,防己lg,苍术lg，白癣皮lg，胡黄连2g,地肤子lg,百部2g,红花Ig,藿香Ig,桂枝Ig,金银花3g,牛膝Ig,铁冬青Ig (以上19味中药均购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂230mL ；
[0083](2)油相的制备:取石蜡8g，液体石蜡6g，白凡士林8g，单硬脂酸甘油酯3g，司盘402g，乳化剂0P3g，对羟基苯甲酸乙酯Ig研磨混匀，得到油相；
[0084](3)林蛙提取中药复合软膏剂的制备:将步骤(2)制得的油相与林蛙提取中药复合制剂分别加热至90°C，将林蛙提取中药复合制剂加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，经纳米匀质机匀质7次，115°C灭菌lOmin，冰片Ig加热到90°C过膜，无菌条件下与灭菌后产物混合均匀，分装，即可。
[0085]实施例三林蛙提取中药复合乳液的制备
[0086]处方组成(按重量份):林娃干54份，灰葡巴27份，五倍子I份，苦参2份，马齿苋I份，蛇床子I份，黄柏I份，薄荷叶I份，羌活2份，防己I份，苍术I份，白癣皮2份，胡黄连2份，地肤子I份，百部2份，红花I份，藿香I份，桂枝I份，金银花3份，牛膝I份，铁冬青I份，硬脂酸4份，十八醇2份，十六醇3份，白油3份，Twenn-600.5份，羊毛脂I份，橄榄油0.5份，甘油6份，二乙醇胺0.3份，茉莉香精0.1份，布罗波尔0.05份，尼泊金丙酯0.05份，加超纯水70份。
[0087]制备方法:
[0088](I)林蛙提取中药复合制剂的制备
[0089]称取林娃干54g(中国林娃长白山亚种,购自吉林大药房)，灰葡巴27g(购自成都药房)，五倍子lg，苦参2g,马齿觅Ig,蛇床子lg，黄柏lg，薄荷叶lg，宪活2g,防己lg,苍术lg，白癣皮lg，胡黄连2g,地肤子lg,百部2g,红花Ig,藿香Ig,桂枝Ig,金银花3g,牛膝Ig,铁冬青Ig (以上19味中药均购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂；
[0090](2)林蛙提取中药复合乳液的制备
[0091]将4g硬脂酸,2g十八醇,3g十六醇,3g白油,0.5gTwenn_60, Ig羊毛脂,0.5g橄榄油混合,搅拌,搅拌温度40°C，搅拌时间20min，搅拌速度为200rpm，形成油相；
[0092]将林蛙提取中药复合制剂230mL与6g甘油，0.3g三乙醇胺，70g超纯水充分混合，搅拌，搅拌温度20°C,搅拌时间1min,搅拌速度为300rpm,形成水相；
[0093]将油相与水相在30°C下混合搅拌，加入0.1g茉莉香精，0.05g布罗波尔，0.05g尼泊金丙酯，再次搅拌，搅拌温度25°C,搅拌时间15min,搅拌速度为200rpm,经纳米勻质机4次，既得林蛙提取乳液。
[0094]实施例四林蛙提取中药复合面膜的制备
[0095]处方组成(按重量份):林娃干54份，灰葡巴27份，五倍子I份，苦参2份，马齿苋I份，蛇床子I份，黄柏I份，薄荷叶I份，羌活2份，防己I份，苍术I份，白癣皮2份，胡黄连2份，地肤子I份，百部2份，红花I份，藿香I份，桂枝I份，金银花3份，牛膝I份，铁冬青I份，甘油5份，I, 3- 丁二醇4份，透明质酸0.5份，熊果苷2份，卡波树脂0.5份，泛醇0.5份，维生素C脂质体3.0份，三乙醇胺0.1份，聚乙二醇-60氢化蓖麻油0.3份，尼泊金丙酯0.2份，茉莉香精0.1份，超纯水80份。
[0096]制备方法:
[0097](I)林蛙提取中药复合制剂的制备
[0098]称取林娃干54g(中国林娃长白山亚种,购自吉林大药房)，灰葡巴27g(购自成都药房)，五倍子lg，苦参2g,马齿觅Ig,蛇床子Ig,黄柏Ig,薄荷叶lg，宪活2g,防己lg,苍术lg，白癣皮lg，胡黄连2g,地肤子Ig,百部2g,红花Ig,藿香Ig,桂枝Ig,金银花3g,牛膝lg，铁冬青lg，(以上19味中药均购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂230mL ；
[0099](2)林蛙提取中药复合面膜的制备
[0100]将林娃提取中药复合制剂230mL,5g甘油，4gl, 3_ 丁二醇,0.5g透明质酸，2g熊果苷,0.5g卡波树脂，0.5g泛醇,3g维生素C脂质体，0.1g三乙醇胺,0.3g聚乙二醇-60氢化蓖麻油，0.2g尼泊金丙酯，0.1g茉莉香精与80g超纯水混合，115°C灭菌lOmin。自体冷却至室温，加入到放有无菌无纺布(15cmX15cm)独立包装袋内，密封即得。
[0101]实施例五林蛙提取中药复合口服制剂的制备
[0102]处方组成(按重量份):林娃干54份,灰葡巴27份,五倍子I份,苦参2份,马齿觅I份，蛇床子I份，黄柏I份，薄荷叶I份，羌活2份，防己I份，苍术I份，白癣皮2份，胡黄连2份，地肤子I份，百部2份，红花I份，藿香I份，桂枝I份，金银花3份，牛膝I份，铁冬青I份，柠檬酸5份，蜂蜜21份，白砂糖22份，黄原胶6 g份，山梨酸钾8份，醋酸锌I份。
[0103]制备方法:
[0104](I)林蛙提取中药复合制剂的制备
[0105]称取林娃干54g(中国林娃长白山亚种,购自吉林大药房)，灰葡巴27g(购自成都药房)，五倍子lg，苦参2g,马齿觅Ig,蛇床子lg，黄柏lg，薄荷叶lg，宪活2g,防己lg,苍术lg，白癣皮lg，胡黄连2g,地肤子lg,百部2g,红花Ig,藿香Ig,桂枝Ig,金银花3g,牛膝Ig,铁冬青Ig (以上19味中药均购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂；
[0106](2)减压浓缩:将林蛙提取中药复合制剂在减压条件下进行蒸馏，压力在9.2 X 13帕，温度为74°C，浓缩比为3:1，得浓缩液；
[0107](3)调节混合液
[0108]将研细的Ig醋酸锌缓慢加入林蛙提取混合液中，边加边搅拌；加完后用0.lmol/LNaOH调节pH为6.4 ± 0.1，搅匀后使其自然沉降，自体冷却过夜；
[0109](4)过滤
[0110]0.45μπι滤膜过滤后，向得到的澄清液中加入5g柠檬酸、21g蜂蜜、22g白砂糖，温度在55°C时，150rpm搅拌,搅拌时间为15min,过滤,再向清液中加入6g黄原胶和8g山梨酸钾，经0.22 μ m滤膜精滤；
[0111](5)灌装压盖
[0112]在无菌条件下灌装，每瓶20mL，压盖封口；
[0113](6)灭菌
[0114]将灌装好的林蛙提取混合液口服制剂加热到65°C，保持30min，自体冷却至室温即为成品。
[0115]以下试验例表明本发明在治疗痤疮药物中的用途
[0116]试验例I
[0117]采用完全随机的方法，将780例受试对象分配到治疗组(300例，共5组)和对照组(480例，8组)。治疗组分别采用实施例二、实施例三、实施例四、实施例五、实施例二 +实施例五制成的林蛙提取复合中药制剂，对照组采用迪维霜(市售重庆华邦制药股份有限公司)、林蛙皮抗菌肽(采用CN1216768A方法制备)、林蛙体抗菌肽(采用CN103073628A方法制备)、中药复合制剂A组(组成为本发明中去掉林蛙干的外用制剂)、中药复合制剂Al组(组成为本发明中去掉林蛙干的口服制剂)、中药复合制剂B组(组成为本发明中去掉林娃干、灰葡巴的外用制剂)、中药复合制剂C组(组成为本发明中去掉林娃干、五倍子、苦参、蛇床子、防己、苍术的外用制剂)、中药复合制剂A+中药复合制剂Al组。根据疗效标准判断疗效，结果见表I。
[0118]用法:实施例二组、实施例三组、实施例四组、迪维霜组、林娃皮抗菌肽组、林娃体抗菌肽组、中药复合制剂A组、中药复合制剂B组、中药复合制剂C组为外用组，每日早晚两次清洗患处后使用药物或化妆品，实施例二组每次用药量为2g，用药方式为涂抹患处，2次/d ;实施例三组每次用量为2mL，使用方式为涂抹患处，2次/d ;实施例四组使用前清洗患处，每次使用时间为15min，l次/d ;迪维霜组每次用药量为2g，用药方式为涂抹患处，2次/d ;林蛙皮抗菌肽组、林蛙体抗菌肽组、中药复合制剂A组、中药复合制剂B组、中药复合制剂C组，每次用药量为2mL，用药方式为涂抹患处，2次/d ;
[0119]实施例五组、中药复合制剂Al组为口服组；实施例二 +实施例五组、中药复合制剂A+中药复合制剂Al组为外用+ 口服组。实施例五组、中药复合制剂Al组每日早晚口服，每次20mL，服药期间无食物禁忌；实施例二 +实施例五组每日早晚口服实施例五，每次20mL，并且早晚两次清洗患处后外用实施例二，每次用药量为2g，用药方式为涂抹患处，2次/d;中药复合制剂A+中药复合制剂Al组每日早晚口服中药复合制剂Al，每次20mL，并且早晚两次清洗患处后外用中药复合制剂A，每次用药量为2mL，用药方式为涂抹患处，2次/d。
[0120]各组同时停用其他相关手段和治疗药物，均以7天为I疗程。
[0121]统计学方法:计量资料用t检验，记数资料用X2及Rdiit检验，P〈0.05为差异有统计学意义。
[0122]疗效评定标准:
[0123]参照《中药新药治疗痤疮的临床研究指导原则》中关于疾病疗效判定标准。痊愈:症状，体征消失或基本消失，积分值减少1>95% ;显效:症状，体征明显改善，积分值减少^ 70% ;有效:症状，体征有好转，积分值减少> 30% ;无效:症状，体征未见好转，积分值减少 <30% ο
[0124]表1本发明治疗痤疮的情况(例)
[0125]

【权利要求】
1.一种林蛙提取中药复合制剂，其由如下步骤制备得到: (1)君药林蛙提取混合液的制备 ①45?65重量份林蛙干除杂除尘后分别经20?100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以下，按照Ig:1?1mL的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶I?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%、风味蛋白酶I?3wt%，酶解温度为50?55°C，酶解时间为I?2h，酶解pH为7.0?7.5，而后85?90°C下灭酶5?15min，将混合物在温度10?30°C时离心，离心时间为I?5min,离心转速为2000?4000rpm,取离心后混合液体积20?40%的上层上清液； ②将上述剩余混合物放入胶体磨，研磨2?15min,使混合物的平均粒径在300μ m以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切I?15min，使混合物平均粒径在100?200 μ m之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干剩余混合物的超微粉； 将上述超微粉加入到质量浓度为2?10%醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比为10?40mL:lg，在4?30°C下超声5?75min ;再经150 μ m纱网过滤，将150 μ m纱网上面未过滤物质加入质量体积比为Ig:1?8mL的0.01?0.03mol/L的氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为500?600W，微波时间3?9min，再次经150 μ m纱网过滤；合并两次滤液，30?50°C下搅拌10?30min,搅拌速度为100?200rpm ;搅拌后的滤液离心,离心温度为4?30°C,离心时间为2?40min，离心转速为2000?15000rpm ;取上清，减压浓缩，压力为600?700托，温度为65?70°C，浓缩体积比为8?40:1 ;此时得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物； ③将步骤①和步骤②的产物混合，得到林蛙提取混合液； (2)复合药物提取液的制备 ①称取20?30重量份灰葡巴、I?3重量份苍术、I?2重量份百部、I?2重量份藿香、I?3重量份金银花、I?重量2份牛膝，混合后加入质量分数90?100%的乙醇中浸泡I?10h，乙醇的体积与上述物质质量和的比例为I?20mL:lg ;然后100?300 μ m纱网过滤，滤液15?30°C、3000?6000rpm条件下离心10?20min,去沉淀后，85?10CTC加热浓缩，浓缩体积比为24?8:1，得乙醇提取液； ②称取I?3重量份五倍子、I?3重量份苦参、I?3重量份马齿觅、I?2重量份蛇床子、I?3重量份黄柏、I?3重量份薄荷叶、I?3重量份宪活、I?2重量份防己、I?3重量份白癖皮、I?2重量份胡黄连、I?2重量份地肤子、I?3重量份红花、I?2重量份桂枝、I?3重量份铁冬青，混合后加入水浸泡I?24h，水的体积与上述物质质量和的比例为10?25mL:lg ;然后100?300 μ m纱网过滤，15?30°C、3000?7000rpm条件下离心10?20min，去沉淀后，85?100°C加热浓缩，浓缩体积比为24?8:1，得水提取液； ③将上述乙醇提取液与水提取液混合，搅拌10?30min，搅拌速度为100?400rpm，得复合药物提取液； (3)将步骤(I)制得的林蛙提取混合液与步骤(2)制得的复合药物提取液混合，从而得到林蛙提取中药复合制剂。
2.权利要求1所述的林蛙提取中药复合制剂在制备治疗痤疮的药物或化妆品中的用途。
3.一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合软膏剂，其由如下步骤制备得到: (I)油相的制备:取5?15重量份石腊、2?5重量份单硬脂酸甘油脂、5?10重量份白凡士林、5?10重量份液体石蜡、I?5重量份司盘40、I?5重量份乳化剂ΟΡ、1?3重量份对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相； (2)将步骤(I)制得的油相与由45?65重量份林蛙干如权利要求1所述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂分别加热至70?100°C，将林蛙提取中药复合制剂加入到所述油相中，边加料边搅拌通过体系自动冷却至室温，再经纳米匀质机匀质4?7次，115?121 °C灭菌10?30min ;然后将I?3重量份冰片加热到70?100°C后过0.45 μ m膜，无菌条件下与上述灭菌后的产物混合均匀，即得到治疗痤疮的林蛙提取中药复合软膏剂。
4.一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合乳液，其由如下步骤制备得到: (1)将由45?65重量份林蛙干如权利要求1所述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂与5?10重量份甘油、0.1?0.5重量份三乙醇胺、60?75重量份超纯水充分混合，搅拌，搅拌温度15?30°C,搅拌时间10?40min,搅拌速度为200?300rpm,形成水相； (2)将2?10重量份硬脂酸，I?5重量份十八醇，I?5重量份十六醇，2?10重量份白油，0.1?2重量份Twenn-60，I?5重量份羊毛脂，0.1?I重量份橄榄油混合，搅拌，搅拌温度20?50°C，搅拌时间10?30min，搅拌速度为200?500rpm，形成油相； (3)将油相与水相在20?50°C下混合搅拌，再加入0.1?0.3重量份香精、0.01?0.1重量份布罗波尔、0.01?0.1重量份尼泊金丙酯，再次搅拌，搅拌温度20?50°C，搅拌时间10?30min,搅拌速度为200?400rpm,经纳米勻质机2?7次,既得林娃提取中药复合乳液。
5.一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合面膜，其由如下方法制备得到: 将由45?65重量份林蛙干如权利要求1所述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂与2?10重量份甘油、2?6重量份1，3- 丁二醇、0.1?2重量份透明质酸、I?5重量份熊果苷、0.1?2重量份卡波树脂、0.1?I重量份泛醇、2?8重量份维生素C脂质体、0.1?2重量份三乙醇胺、0.1?I重量份聚乙二醇-60氢化蓖麻油、0.1?2重量份尼泊金丙酯、0.1?0.5重量份茉莉香精和70?80重量份超纯水混合，搅拌，搅拌温度20?50°C，搅拌时间10?30min,揽祥速度为200?400rpm,揽祥后115?121°C灭菌10?20min ；自体冷却至室温后加入到放有无菌无纺布独立包装袋内，密封即得林蛙提取中药复合面膜。
6.一种治疗痤疮的林蛙提取中药复合口服制剂，其由如下步骤制备得到: (1)减压浓缩:将由45?65重量份林蛙干如权利要求1所述步骤制备得到的林蛙提取中药复合制剂在减压条件下进行蒸馏，压力在8X 13?3X 14帕，温度为50?85°C，浓缩比为I?5:1，得浓缩液； (2)将I?5重量份醋酸锌缓慢加入到浓缩液中，边加料边搅拌；加完后用0.lmol/LNaOH调节pH为6.2?6.5，搅匀后使其自然沉降，自体冷却过夜； (3)0.45 μ m滤膜过滤后，向得到的澄清液中加入5?15重量份柠檬酸、5?25重量份蜂蜜、5?30重量份白砂糖，温度在50?65 °C时，100?200rpm搅拌，搅拌时间为10-25min，过滤，再向清液中加入5?15重量份黄原胶和5?15重量份山梨酸钾，经0.22 um滤膜精滤； (4)灌装压盖:在无菌条件下灌装，压盖封口； (5)灭菌:加热到62?65°C，保持30?40min，自体冷却至室温即得林蛙提取中药复合口服制剂。
【文档编号】A61K8/98GK104173867SQ201410360141
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】刘艳, 孟庆繁, 王迪, 付珧, 谢晶, 逯家辉, 张 杰, 刘瑜, 滕美玉, 滕利荣, 姜丹, 孟珈同 申请人:吉林大学