人参皂苷作为乙酰肝素酶抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的应用的制作方法

本发明涉及化学物质在医药领域的用途。更具体的说是人参皂苷作为乙酰肝素酶抑制剂的应用，也涉及人参皂苷在制备肿瘤治疗药物中的应用。技术背景乙酰肝素酶(Heparanase，HPSE-1)是一种哺乳动物的β-葡萄糖醛酸内切酶，是迄今被发现的唯一能切割乙酰硫酸肝素(HS)的内切酶，乙酰肝素酶从特定位点切断HS链产生约5-7kD的片段。乙酰肝素酶通过切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)上的HS链以促进细胞的迁移和浸润过程。乙酰肝素酶在肺癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌等肿瘤细胞中高表达并促进肿瘤细胞的侵袭和转移。同时，HPSE还能将HS链上结合的VEGF、bFGF、HGF等血管新生促进因子释放到肿瘤细胞的附近，诱导肿瘤组织的血管新生。因此乙酰肝素酶的拮抗剂能够抑制肿瘤的生长和转移。多种乙酰肝素酶的拮抗剂正处于研发阶段。抗体和疫苗类拮抗剂生产工艺复杂，生产成本高，还经常引起剧烈的免疫反应。现有的抑制剂如肝素类似物和硫酸化多糖，很难制备单体并常常伴随抗凝血作用。PI-88是澳大利亚Progen公司生产的乙酰肝素酶抑制剂，相对分子质量为2300,是高度硫酸化的甘露聚糖寡聚糖的混合物，是有前景的抗肿瘤候选药物，其作为抗肿瘤药物已经进入临床研究。与这些物质相比小分子抑制剂制备简单、产品纯度高、药物传递方便、半衰期长等优点，是现代抑制剂类药物研发的热点。技术实现要素：针对现有乙酰肝素酶拮抗剂作为抗肿瘤药物所存在的问题，本发明发现了人参皂苷作为乙酰肝素酶抑制剂的应用，进一步涉及其作为乙酰肝素酶抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述肿瘤包括：结肠直肠癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌。本发明还公开了一种用于肿瘤分子靶向治疗的药物组合物，其包含人参皂苷及药学上可接受的载体。所述人参皂苷选自和乙酰肝素酶蛋白存在相互作用的人参皂苷。优选的，所述人参皂苷选自人参皂苷Rk1、(20S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rk2、(20R)-人参皂苷PPT、(20S)-人参皂苷PPD、(20S)-人参皂苷PPT、(20R)-人参皂苷PPD、人参皂苷Rh3、(20S)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rh4。最优选的，所述人参皂苷为人参皂苷Rk1。本发明还公开了一种用于肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌靶向治疗的药物组合物，其包含人参皂苷及药学上可接受的载体。所述的药物组合物中，所述人参皂苷选自人参皂苷Rk1、(20S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rk2、(20R)-人参皂苷PPT、(20S)-人参皂苷PPD、(20S)-人参皂苷PPT、(20R)-人参皂苷PPD、人参皂苷Rh3、(20S)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rh4。本发明中，人参皂苷Rk1，化学名是3β,6α,12β-trihydroxydammar-20(21),24-diene-6-O-β-D-glucopyranoside，分子式C42H70O12，分子量767.0无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：494753-69-4，结构式为：(20S)-人参皂苷Rh2，化学名是3-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，分子式：C36H62O8，分子量：622.4，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：78214-33-2，结构式为：人参皂苷Rk2，化学名是3-O-β-D-glucopyranosyl-20(-H2O)-cis-protopanaxadio，分子式：C36H60O7，分子量：604.4，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：364779-14-6，结构式为：(20R)-人参皂苷PPT，化学名是20(R)-protopanaxatriol，分子式：C30H52O4，分子量：476.7，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：1453-93-6，结构式为：(20S)-人参皂苷PPD，化学名是20(S)-protopanaxadiol，分子式：C30H52O3，分子量：460.7，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：30636-90-9，结构式为：(20S)-人参皂苷PPT，化学名是20(S)-protopanaxatriol，分子式：C30H52O4，分子量：476.7，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：34080-08-5，结构式为：(20R)-人参皂苷PPD，化学名是20(R)-protopanaxadiol，分子式：C30H52O3，分子量：460.7，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：7755-01-3，结构式为：人参皂苷Rh3，化学名是3-O-β-D-glucopyranosyl-20(-H2O)-cis-protopanaxadiol，分子式：C36H60O7，分子量：604.4，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：105558-26-7，结构式为：(20S)-人参皂苷Rh1，化学名是6-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol，分子式：C36H62O9，分子量：638.4，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：63223-86-9，结构式为：人参皂苷Rh4，化学名是β-D-Glucopyranoside,(3β,6α,12β,20E)-3,12-dihydroxydammara-20(22),24-dien-6-yl，分子式：C36H60O8，分子量：620.87，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：174721-08-5，结构式为：因此，基于天然化合物开发肿瘤分子靶向治疗药物，既有优良的经济效益和社会效益，也对天然化合物的应用转化有推进作用。人参自古是补虚调神之良药，《神农本草经》记载人参“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，……开心益智”。人参皂苷Rk1是鲜人参在加工成红参时，由某些二醇组皂苷受热降解后生成的一种珍贵的次生苷，在红参中的含量很低，但它是人参的有效活性成分之一，有广泛较强的药理活性。目前，针对人参皂苷Rk1以及其它种类人参皂苷(包括原人参二醇皂苷及原人参三醇皂苷)尚无作为乙酰肝素酶抑制剂应用的报道，本发明将在乙酰肝素酶抑制剂用于癌症的治疗上具有重大意义。附图说明图1为人参皂苷Rk1处理细胞后乙酰肝素酶成熟体含量的柱状图；图2为人参皂苷Rk1杀伤肿瘤细胞时细胞生存率柱状图；图3为人参皂苷Rk1有效降低人源肺癌细胞A549的侵袭能力实验结果图。具体实施方式实施例1安全性评价本发明的非临床安全性评价的研究结果如下：1、小鼠口服急性毒性试验在最大给药浓度和最大给药容量条件，小鼠口服灌胃给予人参皂苷Rk112g/kgwt.，连续观察14天，动物未见死亡及异常毒性反应。表明人参皂苷Rk1小鼠灌胃的最大耐受量为12g/kgwt.。2、Beagle犬口服急性毒性试验在最大给药浓度和最大给药容量条件，Beagle犬口服灌胃给予人参皂苷Rk12g/kgwt.，连续观察14天，动物未见死亡及异常毒性反应。表明人参皂苷Rk1Beagle犬灌胃的最大耐受量为2g/kgwt.。3、大鼠灌胃给药的长期毒性人参皂苷Rk1(100mg/kgwt.、300mg/kgwt.和500mg/kgwt.)SD大鼠连续口服灌胃三个月后停药恢复四周长期毒性试验。结果显示：①一般情况：在给药和恢复期间，摄食饮水正常，体重增加，动物皮毛光滑，行为活动正常；②血液学和血液生化学指标：在给药结束和恢复期后，动物血液学和血液生化学各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；③骨髓和尿常规指标：在给药结束和恢复期后，动物骨髓和尿常规各指标未见明显异常；④组织病理学指标：在给药结束和恢复期后，动物各脏器肉眼未见明显异常，脏器重量和脏器系数与对照组相比未见显著差异，各脏器病理未见明显异常改变。结果表明，SD大鼠长期给药人参皂苷Rk1未见明显毒性反应。4、对Beagle犬灌胃给药的长期毒性试验人参皂苷Rk1(50mg/kgwt.、100mg/kgwt.和150mg/kgwt.)Beagle犬连续口服灌胃三个月后停药恢复四周长期毒性试验。结果显示：①一般情况：在给药和恢复期间，摄食、饮水和体温正常，体重增加，动物皮毛光滑，行为活动正常；②血液学和血液生化学指标：在给药结束和恢复期后，动物血液学和血液生化学各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；③心电图指标：在给药结束和恢复期后，动物心电图各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；④骨髓和眼科检查：在给药结束和恢复期后，动物骨髓细胞和各分类细胞未见异常；眼科检查各组动物眼底血管纹路清晰无出血渗出，视乳头无水肿，动静脉管径比正常；⑤免疫学和尿粪检测指标：在给药结束和恢复期后，动物免疫学和尿粪检测各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；⑥组织病理学指标：在给药结束和恢复期后，动物各脏器肉眼未见明显异常，脏器重量和脏器系数与对照组相比未见显著差异，各脏器病理未见明显异常改变。结果表明，Beagle犬长期给药人参皂苷Rk1未见明显毒性反应。5、一般药理学试验麻醉Beagle犬口服灌胃人参皂苷Rk1(25mg/kgwt.、50mg/kgwt.、100mg/kgwt.)后，Beagle犬的血压(舒张压、收缩压)、心率无明显影响，P波、T波、R波和QRS间期、PR间期、Q-T间期、呼吸频率以及呼吸幅度也无明显影响。人参皂苷Rk1(150mg/kgwt.、300mg/kgwt.和500mg/kgwt.)对小鼠Irwin’s行为试验评分及爬杆试验评分均无明显影响。表明人参皂苷Rk1在试验条件下不影响动物的中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统。6、致突变试验哺乳动物培养细胞(CHL)染色体畸变试验、Ames试验和小鼠微核试验显示，人参皂苷Rk1无致突变作用。实施例2药效学本发明的研究结果如下：1、人参皂苷Rk1下调乙酰肝素酶成熟体含量材料：人源肺癌细胞A549，乙酰肝素酶特异性抗体(SantaCruz)，人参皂苷Rk1(大连美仑生物技术有限公司，纯度>99％)，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(BioRad)。方法：培养人源肺癌细胞A549至对数生长期，以2.0×106个/板传代于100mm细胞培养板，37℃、5％CO2环境中培养24h，培养基中加入人参皂苷Rk1乙醇溶液至人参皂苷Rk1的终浓度分别为1、2、3、4、5μg/mL(储存液为1mg/mL的人参皂苷Rk1乙醇溶液)，37℃、5％CO2环境中继续培养4h，收集细胞，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳——免疫印记检测，结果如图1所示，随着人参皂苷Rk1浓度的加大，乙酰肝素酶成熟体的含量呈浓度依赖的方式降低。2、多种人参皂苷均能结合乙酰肝素酶通过分子模拟对各种人参皂苷与乙酰肝素酶蛋白的结合能力进行分析表明多种人参皂苷均可以与乙酰肝素酶蛋白结合(分子模拟方法基于LamarckianGeneticAlgorithm(ScrippsResearchInstitute,LaJolla,CA,USA)在AutoDock中完成，结合自由能和解离常数由工作站生成)，结果见表1。表1人参皂苷与乙酰肝素酶蛋白结合自由能及解离常数人参皂苷结合自由能(kcal/mol)解离常数(μM)人参皂苷Rk1-7.962.13(20S)-人参皂苷PPD-7.714.91(20R)-人参皂苷PPT-7.626.28(20S)-人参皂苷PPT-6.979.15(20R)-人参皂苷PPD-6.9212.55人参皂苷Rh3-6.6222.91(20S)-人参皂苷Rh1-6.5626.09人参皂苷Rh4-6.5241.51(20S)-人参皂苷Rh2-5.9151.05人参皂苷Rk2-5.7157.623、人参皂苷Rk1诱导肿瘤细胞死亡材料：人源肺癌细胞系A549，人宫颈癌细胞系HeLa，人肝癌细胞系HepG2，人结肠癌细胞系SW480，人乙酰肝素酶特异性抗体(SantaCruz)，CCK8试剂盒(Sigma)，人参皂苷Rk1(大连美仑生物技术有限公司，纯度>99％)。方法：将4种肿瘤细胞培养至对数期，8000个/孔传代于96空培养板中，37℃、5％CO2环境中培养24h，培养基中加入人参皂苷Rk1乙醇溶液至人参皂苷Rk1的终浓度分别为1、2、5、10、15、25、50μg/mL(储存液为1mg/mL的人参皂苷Rk1乙醇溶液)，继续培养48h，使用CCK8试剂盒对肿瘤细胞进行计数。结果如图2所示，人参皂苷Rk1对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。4、人参皂苷Rk1抑制肿瘤细胞侵袭转移材料：人源肺癌细胞系A549，matrigel基质胶(BD)，transwell小室(corning)，人参皂苷Rk1(大连美仑生物技术有限公司，纯度>99％)。方法：使用DMEM培养基按1：5(v/v)稀释matrgel基质胶，100μL每孔加入transwell小室上室，37℃、5％CO2放置过夜。将培养至对数期的A549细胞消化，稀释至细胞浓度5×105个/mL，100μL每孔加入transwell小室上室，在下室中加入500μL含10％胎牛血清(v/v)的DMEM培养基。实验组加入人参皂苷Rk1乙醇溶液至终浓度5μg/mL(储存液为1mg/mL的人参皂苷Rk1乙醇溶液)，阴性对照组加入等体积乙醇，37℃、5％CO2培养48h。清除上室中的细胞以及基质胶，对下室中的细胞进行甲醇固定、结晶紫染色，光镜下观察。实验结果表明，5μg/mL人参皂苷Rk1有效降低人源肺癌细胞A549的侵袭能力(图3)。5、乙酰肝素酶在肿瘤组织的表达水平人肿瘤组织芯片购买于上海上海芯超生物科技有限公司(肝细胞癌：HLivH180Su06；胃癌：HStmA180Su09；结肠直肠癌：HColA180Su11；胰腺癌：PanA150CS02；食管癌：HEsoS180Su06；卵巢癌：HUteA060CS01；乳腺癌：HBreD145Su01；宫颈癌：HUteA060CS01；前列腺癌：HProA180PG03)，并利用免疫组织化学检测乙酰肝素酶在肿瘤组织中的表达水平。并使用乙酰肝素酶特异性抗体(一抗、二抗均为SantaCruz公司免疫组织化学用途抗体)，使用AEC显色系统(sigma)对组织切片进行染色。在显微镜高倍视野(×200)，计阳性细胞百分比，阳性细胞<5％为0分，6％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，>76％为4分。再按染色强度分为0～3分，两者相乘的结果对肿瘤组织进行评分，0～1为-，2～4为+，5～8为++，9～12为+++。乙酰肝素酶在肿瘤组织的表达水平如表2所示。乙酰肝素酶在肿瘤组织中呈现中高水平表达，所述肿瘤包括：结肠直肠癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌。表2乙酰肝素酶在肿瘤组织中的表达水平当前第1页1 2 3