动物用粘膜靶向免疫增强剂及其在兽用疫苗中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及动物用粘膜靶向免疫增强剂及其在兽用疫苗中的应用。

背景技术：

各类病毒性传染病制约我国乃至世界养殖业发展，造成重大经济损失，甚至危及人类的公共卫生安全。目前临床大量使用的基于矿物油佐剂制备的灭活疫苗，对防控这些疫病发挥了重要作用。但这些疫苗仍存在一定的缺陷，疫苗质量有待于进一步提升。这些缺陷包括以下几个方面：

第一，基于矿物油的灭活疫苗免疫机体后几乎不产生粘膜抗体。然而病毒感染的主要途径为粘膜途径。因此，粘膜是宿主防御系统的第一道防线。提高粘膜免疫应答，可以将病毒等病原体在即将进入宿主时清除或阻拦，从而降低感染疫病的风险。

第二，基于矿物油的灭活疫苗免疫机体后副反应较大。具体来说，对于快速出栏的肉鸡，矿物油疫苗难以吸收，会影响肉质和后续食用。而对于蛋鸡，会对蛋鸡产生产蛋下降的影响。对于猪、牛等，矿物油疫苗免疫后会导致发烧，肿大，采食下降等严重副反应。

第三，基于矿物油的灭活疫苗免疫后抗体的产生期较长。基于矿物油疫苗免疫后，一般在免疫后第3周达到有效保护的合格抗体，导致有较长的时间处于无法对野外变异毒株提供有效保护的状态。这就给临床生产带来很大的疫病风险。

第四，基于矿物油的灭活疫苗，需要较高的疫苗抗原含量。兽用疫苗采用提高抗原量来提高疫苗的免疫后的效力，但兽用疫苗受限于低廉的价格，导致疫苗抗原纯度差，杂蛋白较多，也导致副反应较大。

综上所述，一种理想的兽用疫苗应当具有以下特征：（1）能产生高水平粘膜免疫；（2）易于吸收，几乎无副反应；（3）抗体产生期短，抗体效价高，持续期长；（4）在保证疫苗效力的前提下，有效降低抗原用量，降低副反应，降低生产成本；（5）能产生消除性免疫。从而为控制疫病、最终扑灭和消除疫病，提供强有力的技术支持。

技术实现要素：

针对目前现有技术中存在的问题，以及对于理想兽用疫苗的期待，本发明的发明目的之一是提供一种能够产生良好的粘膜免疫，同时缩短免疫窗口期，有效降低抗原用量和产生消除性免疫的动物用粘膜靶向免疫增强剂。

本发明的另一发明目的是提供前述动物用粘膜靶向免疫增强剂在兽用疫苗中的应用可能及应用方法。

本发明公开的动物用粘膜靶向免疫增强剂含有0.5μg～500μg/ml的cpg、0.1μg～1mg/ml的α-gc、0.1μg～3mg/ml的poly（i:c）、1μg～5mg/ml的plga、0.1μg～5mg/ml的pei、1μg～10mg/ml壳聚糖。

所述cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的质量浓度比为1:(3～8):(2～8):(2～8):(3～7):(2～7)。

更为优选地，所述cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的质量浓度比为1:(4～6):(3～5):(4～6):(3～5):(3～5)。

本发明公开的动物用粘膜靶向免疫增强剂的制备方法为：在磷酸盐缓冲溶液中分别加入cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖，调节ph至7.0-7.2，制备成混合溶液，过滤、除菌，即得。

本发明进一步公开了动物用粘膜靶向免疫增强剂在兽用疫苗中的应用。

所述的兽用疫苗中包含有动物用粘膜靶向免疫增强剂及灭活疫苗抗原。

所述的兽用疫苗包括但不仅限于h9亚型禽流感疫苗，新城疫疫苗，传染性法氏囊疫苗，传染性支气管炎疫苗，新城疫-h9禽流感二联疫苗，新城疫-传染性法氏囊二联疫苗，新城疫-传染性支气管炎二联疫苗，新城疫-传染性支气管炎-h9亚型禽流感三联疫苗，猪细小病毒病疫苗，猪乙型脑炎病疫苗，猪伪狂犬病疫苗，猪圆环病毒病疫苗。

进一步地，本发明公开了在兽用疫苗中含有动物用粘膜靶向免疫增强剂的含量为0.5μg～500μg/ml的cpg、0.1μg～1mg/ml的α-gc、0.1μg～3mg/ml的poly（i:c）、1μg～5mg/ml的plga、0.1μg～5mg/ml的pei、1μg～10mg/ml壳聚糖。

另外，本发明还公开了动物用粘膜靶向免疫增强剂在兽用疫苗中的应用方法为：首先按照0.5μg～500μg/ml的cpg、0.1μg～1mg/ml的α-gc、0.1μg～3mg/ml的poly（i:c）、1μg～5mg/ml的plga、0.1μg～5mg/ml的pei、1μg～10mg/ml的壳聚糖配置得到动物用粘膜靶向免疫增强剂，然后将所需疫苗的疫苗抗原加入至制备好的动物用粘膜靶向免疫增强剂中，混匀，即得。

疫苗抗原的加入量（即产品中的含量）参考现有以矿物油为佐剂的制备疫苗的每羽份抗原含量。该疫苗抗原可以为冻干保存的灭活抗原，也可以是灭活抗原溶液。

本发明公开的动物用粘膜靶向免疫增强剂通过各组分的协同作用，可以产生良好的粘膜免疫，显著缩短免疫窗口期，有效提高抗体效价，延长抗体持续期。同时本发明公开的动物用粘膜靶向免疫增强剂在与其他疫苗抗原形成兽用疫苗的过程中能够针对同型毒株攻毒提供消除性免疫保护，有效降低抗原用量，从而实现降低成本等目的。并且，本发明公开的动物用粘膜靶向免疫增强剂在制备兽用疫苗过程中操作简单、灵活，饲养户可以在实际操作过程中将增强剂与现有疫苗抗原混合使用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示实施例2中针对h9的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图2显示实施例4中节省抗原后的针对h9的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图3显示实施例5中针对nd的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图4显示实施例6中针对ibd的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图5显示实施例7中针对ib的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图6显示实施例8中针对nd的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图7显示实施例8中针对ib的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图8显示实施例8中针对h9的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图9显示实施例9中针对nd的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图10显示实施例9中针对ib的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图11显示实施例9中针对ibd的血清抗体效价和粘膜抗体效价。

图12显示实施例10中针对ppv的血清抗体hi效价。

图13显示实施例10中针对ppv的血清抗体elisa效价。

图14显示实施例11中针对jevlat的血清抗体elisa效价。

图15显示实施例12中针对prv的血清中和抗体。

图16显示实施例13中针对pcv2的血清抗体elisa效价。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1复方佐剂及动物疫苗的配制

（1）试验材料

cpg由本室筛选获得，序列为tcgtcgttatagtcgttttagtcgtt(seqno:1)，交由南京金思瑞合成，合成时将其骨架作硫代修饰。α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosylceramide,简称α-gc)和poly（i:c）购自invivogen。plga、pei和壳聚糖均购自sigma公司。配制磷酸盐缓冲液的无机盐购自国药集团化学试剂有限公司。

（2）试验方法

制备复方佐剂：

复方佐剂溶液的配制：首先配制磷酸盐（pbs）缓冲液，其配方中含1.44g/l的na2hpo4，1.44g/l的kh2po4，8g/l的nacl，0.2g/l的kcl，以双蒸水溶解上述盐，调整ph为7.0，灭菌后备用。在所述pbs缓冲液中加入按照配方量加入cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖，调整ph为7.0-7.2，配制成水溶液。将该水溶液过滤、除菌，得到动物用粘膜靶向免疫增强剂。该增强剂可长期密封保存。

其中配方量是指：水溶液含0.5μg～500μg/ml的cpg、0.1μg～1mg/ml的α-gc、0.1μg～3mg/ml的poly（i:c）、1μg～5mg/ml的plga、0.1μg～5mg/ml的pei、1μg～10mg/ml壳聚糖。

为了表述方便，在本发明中我们将动物用粘膜靶向免疫增强剂简称为复方佐剂，或以ma代表。“动物用粘膜靶向免疫增强剂”、“复方佐剂”、“ma”在本发明中均指动物用粘膜靶向免疫增强剂。

其中cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的质量浓度比为1:(3～8):(2～8):(2～8):(3～7):(2～7)。

或者进一步地，cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的质量浓度比为1:(4～6):(3～5):(4～6):(3～5):(3～5)。

兽用疫苗及其配制方法：

兽用疫苗中含有0.5μg～500μg/ml的cpg、0.1μg～1mg/ml的α-gc、0.1μg～3mg/ml的poly（i:c）、1μg～5mg/ml的plga、0.1μg～5mg/ml的pei、1μg～10mg/ml的壳聚糖；以及灭活疫苗抗原。

为了与现有疫苗相区分，在实施例2-13中将该动物疫苗均称为含有复方佐剂的兽用疫苗，以“-ma”代表含有动物用粘膜靶向免疫增强剂。

所述cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的质量浓度比为1:(3～8):(2～8):(2～8):(3～7):(2～7)。

所述cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的质量浓度比为1:(4～6):(3～5):(4～6):(3～5):(3～5)。

其中灭活疫苗抗原根据需要分别为h9亚型禽流感疫苗，新城疫疫苗，传染性法氏囊疫苗，传染性支气管炎疫苗，新城疫-h9禽流感二联疫苗，新城疫-传染性法氏囊二联疫苗，新城疫-传染性支气管炎二联疫苗，新城疫-传染性支气管炎-h9亚型禽流感三联疫苗，猪细小病毒病疫苗，猪乙型脑炎病疫苗，猪伪狂犬病疫苗，猪圆环病毒病疫苗抗原。

制备兽用疫苗的方法可以概述为：在上述制备的复方佐剂溶液中加入所需的疫苗抗原，混匀，即得所需的疫苗。所述的疫苗抗原含量参考现有基于矿物油制备疫苗的每羽份抗原含量。该疫苗抗原可以为冻干保存的灭活抗原，或灭活抗原溶液。

根据现在各疫苗的饲养户在实际操作过程中，能够将该复方佐剂与各种现有疫苗抗原混合使用，操作方便，灵活。

为了完成实施例2-15中的对比试验，我们将各种兽用疫苗分别配置三种配方：兽用疫苗l、m和h。每一兽用疫苗中均含有0.5μg～500μg/ml的cpg、0.1μg～1mg/ml的α-gc、0.1μg～3mg/ml的poly（i:c）、1μg～5mg/ml的plga、0.1μg～5mg/ml的pei、1μg～10mg/ml壳聚糖。

下面我们以h9亚型禽流感疫苗为例说明详细配制过程：

兽用疫苗l中复方佐剂成分cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的浓度分别为：0.5μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和1μg/ml，将复方佐剂制备的h9疫苗，简称为h9-mal。

兽用疫苗m中cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的浓度分别为：20μg/ml、50μg/ml、500μg/ml、1μg/ml、1mg/ml和1mg/ml，将复方佐剂制备的h9疫苗，简称为h9-mam。

兽用疫苗h中cpg、α-gc、poly（i:c）、plga、pei和壳聚糖的浓度分别为：500μg/ml、1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml，将复方佐剂制备的h9疫苗，简称为h9-mah。

在本实施例中，用于制备疫苗的h9疫苗抗原在灭活前，其效价不低于10⁷eid50/ml。

本实施例中的重量单位根据配制体积，可以为纳克、微克、毫克或克。

本实施例中，复方佐剂的各组分可以在给出的配比范围内灵活进行组合，在此不一一列举。除添加上述免疫增强剂成分外，以上方法制备疫苗是熟悉本领域的技术人员所知悉的常规方法。

实施例2复方佐剂对h9亚型禽流感疫苗免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的h9亚型禽流感疫苗，按照实施例1中公开的方法制备含复方佐剂的h9亚型禽流感疫苗l、m和h。h9亚型禽流感疫苗和h9亚型禽流感标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种，设立含复方佐剂的h9-mal、h9-mam和h9-mah疫苗组和商品h9亚型禽流感疫苗组（缩写为h9）、以及不免疫的空白对照组（简称为c），共5组，各组均有40只鸡。

（3）复方佐剂对h9亚型禽流感疫苗免疫效力的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2、3和4周经静脉采血，分离血清，用h9亚型禽流感标准检测抗原。同时在免疫后第1，2和3周，每组各扑杀3只鸡，采集肺冲洗液。将血清和肺冲洗液，均采用微量血凝抑制试验(hi)检测血清抗体效价，hi检测方法参考2010年版《中国兽药典》。根据每组鸡的几何平均抗体效价（gmt）和方差（sd），比较复方佐剂对现有h9亚型禽流感疫苗的免疫增强效果。

结果

血清抗体结果。在免疫后2周，含复方佐剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗效价，其中h9-mam和h9-mah高于规程要求的常规疫苗免疫后4周的合格抗体效价（7log2）。而常规疫苗在免疫后3周达到合格，即含复方佐剂的疫苗能将免疫窗口期缩短1周。免疫后3周，含免疫复方佐剂的疫苗组的抗体效价均高于常规疫苗组抗体效价。详见图1-a。

肺冲洗液粘膜抗体结果。不同剂量的复方佐剂配方均能提高h9亚型禽流感疫苗在鸡体的肺冲洗液粘膜抗体效价，具有明显的粘膜免疫增强作用。详见图1-b。

综合血清抗体和粘膜抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高h9疫苗在鸡体的粘膜免疫和血清免疫应答。

（3）复方佐剂对h9亚型禽流感变异毒株攻毒后抑制排毒的影响

攻毒和排毒检测免疫后第4周，从免疫组随机抽10只，空白对照组10只。攻毒毒株为nj/02株，购自南京天邦生物科技有限公司。攻毒剂量为10^7.0鸡胚半数感染量（eid50）/0.1ml，经点眼滴鼻途径攻毒。攻毒后第3天、5天和7天，分别从喉气管和泄殖腔采取棉拭子。将此棉拭子浸于含5%小牛血清和5000u卡那霉素及5000u庆大霉素的pbs（ph7.0）中。每一棉拭经挤压后，12000转/分，离心10分钟。将离心所得上清液按0.1ml/胚，接种10日龄spf鸡胚，每一棉拭子样品接种3枚鸡胚，用于分离病毒。鸡胚接种后，置37℃温箱中，每天照胚2次，弃去24小时内死亡的鸡胚，观察至接种后120小时，及时将死亡鸡胚取出，检测血凝（heamagglutinin，ha）效价。以3个胚中的1个或以上测出ha效价高于2log2者判为病毒分离阳性。

结果和结论

在攻毒后第3天、5天和7天的喉气管和泄殖腔棉拭子样品检测中，含复方佐剂的疫苗组均未分离到病毒。而常规疫苗免疫组在攻毒后第3天、5天和7天从部分免疫鸡的喉气管分离到病毒，泄殖腔则在攻毒后第3天和5天分离到病毒。未免疫的所有对照鸡在攻毒后第3天、5天和7天从喉气管和泄殖腔均能分离到病毒。详见表1。

试验结果表明，本发明中的复方佐剂能对与疫苗抗原相同的病毒攻击完全抑制排毒，即可提供消除性免疫保护，这为将来某类传染病的消灭提供有力的技术支持。

表1不同免疫组在攻毒后的病毒分离率

实施例3复方佐剂对h9亚型禽流感疫苗在鸡体的安全性的影响

（1）试验材料

采用现有的h9亚型禽流感疫苗，按照实施例1中公开的方法制备含复方佐剂的h9亚型禽流感疫苗h9-mam。h9亚型禽流感疫苗和h9亚型禽流感标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种。

分组如下：设立含复方佐剂的h9-mam单次单剂量（0.3ml）免疫组(简称，h9-mam-s)、h9-mam单次双倍剂量(0.6ml)免疫组(简称，h9-mam-d)、h9-mam两次单剂量(0.3ml+0.3ml)免疫组(简称，h9-mam-r)。其中h9-mam-s和h9-mam-d，仅在第15天免疫一次，后续不再免疫。而h9-mam-r在15日龄免疫0.3ml后，另在29日龄再次免疫0.3ml一次。

设常规h9疫苗作为对照，免疫方式如同复方佐剂免疫组设置，共三组。h9单次单剂量（0.3ml）免疫组(简称，h9-s)、h9单次双倍剂量(0.6ml)免疫组(简称，h9-d)、h9两次单剂量(0.3ml+0.3ml)免疫组(简称，h9-r)。

另设不免疫的空白对照组（control）。

（3）复方佐剂对h9亚型禽流感疫苗在鸡体安全性的影响

检测每组各15只鸡。在最后一次免疫后14天和28天，各组在这两个时间节点上分别取5只鸡扑杀，用于检测疫苗吸收。

结果和结论

免疫后14天各组扑杀5只鸡，观察疫苗吸收情况。复方佐剂的3个试验组，均吸收完全，与空白对照组类似。仅在单次双倍剂量免疫组，h9-mam-d，有1只鸡有黄色类脂肪粒。而常规h9疫苗免疫的3个试验组，每只鸡均有黄色类脂肪粒。空白对照组的组织正常。

免疫后28天各组扑杀5只鸡，观察疫苗吸收情况。复方佐剂的3个试验组，均吸收完全，与空白对照组类似。而常规h9疫苗免疫的3个试验组，部分鸡均有黄色类脂肪粒。其中，h9单次单剂量（0.3ml）免疫组(h9-s)和h9两次单剂量(0.3ml+0.3ml)免疫组(h9-r)各有1只鸡有黄色类脂肪粒。而h9单次双倍剂量(0.6ml)免疫组(h9-d)有2只鸡有类脂肪粒。

试验结果表明，与常规h9矿物油疫苗比较，本发明中的复方佐剂不影响h9亚型禽流感疫苗在鸡体的吸收，对鸡安全。

实施例4复方佐剂降低h9亚型禽流感疫苗抗原用量

（1）试验材料

采用现有的h9亚型禽流感疫苗抗原，按照实施例1中公开的方法制备含复方佐剂mam。

疫苗制备：制备成不同抗原含量的复方佐剂h9疫苗。第一组为正常抗原含量，与商品化基于矿物油的h9亚型禽流感疫苗含量相同，简称h9-mam；第二组疫苗为一半抗原含量，为正常商品化基于矿物油的h9亚型禽流感疫苗的抗原含量的1/2，简称h9-ham-1/2；第三组疫苗为1/4抗原含量，为正常商品化基于矿物油的h9亚型禽流感疫苗的抗原含量的1/4，简称h9-ham-1/4。

商品化h9亚型禽流感疫苗（正常抗原含量）和h9亚型禽流感标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种，设立含复方佐剂的h9-mam、h9-mam-1/2和h9-mam-1/4疫苗组和商品h9亚型禽流感疫苗组（缩写为h9），共4组，各组均有20s只鸡。

采血和抗体效价检测免疫后第2、3、4周经静脉采血，分离血清用作抗体检测。同时在免疫后第4周，从每个免疫组，取出3只鸡采集肺冲洗液，用作粘膜抗体检测。检测抗原用h9禽流感抗原，采用微量血凝抑制试验(hi)检测血清抗体效价。

（3）结果和结论

血清抗体效价在免疫后2、3和4周，含复方佐剂的疫苗组，1/4和1/2抗原含量组，其血清hi抗体效价略高于商品疫苗的效价。在含不同抗原行量的复方佐剂组之间比较hi抗体效价，显示出明显的剂量效应，即抗原含量高，抗体效价高，但1/2抗原含量组与正常抗原量组之间差异不明显。详见图2-a。

粘膜抗体效价在免疫后4周，含复方佐剂的疫苗组，1/4和1/2抗原含量组，其粘膜hi抗体效价显著高于商品疫苗的效价。在含不同抗原行量的复方佐剂组之间比较hi抗体效价，差异不明显。详见图2-b。

试验结果表明，在降低抗原用量的情况下，复方佐剂能提高h9亚型禽流感疫苗抗体效价，具有明显的免疫增强作用，这对于各种联苗的配伍具有重要作用。

实施例5复方佐剂对新城疫疫苗免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的新城疫（nd）疫苗，参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的nd疫苗l、m和h。nd疫苗和nd标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种，设立含复方佐剂的nd-mal、nd-mam和nd-mah疫苗组和商品nd疫苗组（缩写为nd），共4组，各组均有30只鸡。

（3）复方佐剂对nd疫苗免疫效力的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2、3和4周经静脉采血，分离血清，用nd标准检测抗原。同时在免疫后第4周，每组各扑杀3只鸡，采集肺冲洗液。将血清和肺冲洗液，均采用微量血凝抑制试验(hi)检测血清抗体效价，hi检测方法参考2010年版《中国兽药典》。根据每组鸡的抗体效价，比较复方佐剂对现有nd疫苗的免疫增强效果。

结果

血清抗体结果。在免疫后2周，含复方佐剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗效价，其中nd-mam和nd-mah高于规程要求的常规疫苗免疫后3周的合格抗体效价（7log2）。而常规疫苗在免疫后3周达到合格，即含复方佐剂的疫苗能将免疫窗口期缩短1周。免疫后第3周和第4周，含免疫复方佐剂的疫苗组的抗体效价均高于常规疫苗组抗体效价。详见图3-a。

肺冲洗液粘膜抗体结果。不同剂量的复方佐剂配方均能提高nd疫苗在鸡体的肺冲洗液粘膜抗体效价，具有明显的粘膜免疫增强作用。详见图3-b。

综合血清抗体和粘膜抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高nd疫苗在鸡体的粘膜免疫和血清免疫应答。

实施例6复方佐剂对传染性法氏囊疫苗免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的传染性法氏囊（ibd）疫苗，参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的ibd疫苗l、m和h。ibd商品疫苗购自南京天邦生物科技有限公司，ibd标准检测毒株，bc6-85均购自中国兽药监察所,df-1细胞购自美国模式培养物研究所（atcc）。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种，设立含复方佐剂的ibd-mal、ibd-mam和ibd-mah疫苗组和商品ibd疫苗组（缩写为ibd），共4组，各组均有25只鸡。

（3）复方佐剂对ibd疫苗免疫效力的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2、3和4周经静脉采血，分离血清，用ibd标准检测抗原。同时在免疫后第4周，每组各扑杀3只鸡，采集肺冲洗液。将血清和肺冲洗液，均采用df-1细胞血清病毒中和试验检测血清抗体效价，血清中和抗体检测方法参考2010年版《中国兽药典》。

血清中和试验简述如下：将bc6-85病毒稀释至200tcid50(半数组织感染量)/0.1ml，将此含病毒的稀释液按2倍倍比梯度稀释血，在每一稀释梯度中取0.1ml的病毒血清混合液置于37℃孵育作用1h。将此孵育液加至事先长满df-1细胞的96孔板内，将细胞板转移至37℃co2培养箱，观察120h。记录结果。

取根据每组鸡的抗体效价，比较复方佐剂对现有ibd疫苗的免疫增强效果。以上血清中和试验是本研究领域通用的试验操作方法。

结果

血清抗体结果。在免疫后2周，含复方佐剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗效价，其中ibd-mam和ibd-mah高于规程要求的常规疫苗免疫后3周的合格抗体效价（7log2）。而常规疫苗在免疫后3周达到合格，即含复方佐剂的疫苗能将免疫窗口期缩短1周。免疫后第3周和第4周，含免疫复方佐剂的疫苗组的抗体效价均高于常规疫苗组抗体效价。详见图4-a。

肺冲洗液粘膜抗体结果。不同剂量的复方佐剂配方均能提高ibd疫苗在鸡体的肺冲洗液粘膜抗体效价，具有明显的粘膜免疫增强作用。详见图4-b。

综合血清抗体和粘膜抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高ibd疫苗在鸡体的粘膜免疫和血清免疫应答。

实施例7复方佐剂对传染性支气管炎疫苗免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的传染性支气管炎（ib）疫苗，参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的ib疫苗l、m和h。ib疫苗标准检测抗原购自南京天邦生物科技有限公司，m41检测抗原购自荷兰gd公司。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种，设立含复方佐剂的ib-mal、ib-mam和ib-mah疫苗组和商品ib疫苗组（缩写为ib），共4组，各组均有20只鸡。

（3）复方佐剂对ib疫苗免疫效力的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2、3和4周经静脉采血，分离血清，用ib标准检测抗原。同时在免疫后第4周，每组各扑杀3只鸡，采集肺冲洗液。将血清和肺冲洗液，均采用微量血凝抑制试验(hi)检测血清抗体效价。根据每组鸡的抗体效价，比较复方佐剂对现有ib疫苗的免疫增强效果。

结果

血清抗体结果。在免疫后2、3、4周，含复方佐剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗效价。一般常规疫苗需要经活疫苗先免疫，1周后再次免疫常规灭活疫苗，提高灭活疫苗的效价。详见图5-a。

肺冲洗液粘膜抗体结果。不同剂量的复方佐剂配方均能提高ib疫苗在鸡体的肺冲洗液粘膜抗体效价，具有明显的粘膜免疫增强作用。详见图5-b。

综合血清抗体和粘膜抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高ib疫苗在鸡体的粘膜免疫和血清免疫应答。

实施例8复方佐剂对新城疫-传染性支气管炎-h9亚型禽流感三联疫苗（nd-ib-h9）免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的新城疫（nd）疫苗、传染性支气管炎（ib）疫苗、h9亚型禽流感三联疫苗，参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的新城疫-传染性支气管炎-h9亚型禽流感三联疫苗l、m和h。nd疫苗和nd标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司；ib疫苗标准检测抗原购自南京天邦生物科技有限公司，m41检测抗原购自荷兰gd公司；h9亚型禽流感疫苗和h9亚型禽流感标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种，设立含复方佐剂的nd-ib-h9-mal、nd-ib-h9-mam和nd-ib-h9-mah疫苗组和商品nd-ib-h9疫苗组（缩写为nd-ib-h9），共4组，各组均有20只鸡。

（3）复方佐剂对nd-ib-h9疫苗免疫效力的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2、3和4周经静脉采血，分离血清，用nd标准、ib标准、h9亚型禽流感标准检测抗原检测抗体。同时在免疫后第4周，每组各扑杀3只鸡，采集肺冲洗液。将血清和肺冲洗液，均采用微量血凝抑制试验(hi)检测血清抗体效价。根据每组鸡的抗体效价，比较复方佐剂对现有nd-ib-h9疫苗的免疫增强效果。

结果

血清抗体结果。在免疫后2、3、4周，含复方佐剂的疫苗组的各种抗体效价高于常规疫苗效价。一般常规疫苗需要经活疫苗先免疫，1周后再次免疫常规灭活疫苗，提高灭活疫苗的效价。详见图6-a、7-a、8-a。

肺冲洗液粘膜抗体结果。不同剂量的复方佐剂配方均能提高nd-ib-h9疫苗在鸡体的肺冲洗液粘膜抗体效价，具有明显的粘膜免疫增强作用。详见图6-b、7-b、8-b。

综合血清抗体和粘膜抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高nd-ib-h9疫苗在鸡体的粘膜免疫和血清免疫应答。

实施例9复方佐剂对新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联疫苗（nd-ib-ibd）免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的新城疫（nd）疫苗、传染性支气管炎（ib）疫苗、传染性法氏囊（ibd）三联疫苗，参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊（nd-ib-ibd）三联疫苗l、m和h。nd疫苗和nd标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司；ib疫苗标准检测抗原购自南京天邦生物科技有限公司，m41检测抗原购自荷兰gd公司；ibd商品疫苗购自南京天邦生物科技有限公司，ibd标准检测毒株，bc6-85均购自中国兽药监察所,df-1细胞购自美国模式培养物研究所（atcc）。无特定病原体（specificpathogenfree，spf）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至5-15日龄待用。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，4周龄以内的鸡免疫0.3ml/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取15日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3ml/鸡接种，设立含复方佐剂的nd-ib-ibd-mal、nd-ib-ibd-mam和nd-ib-ibd-mah疫苗组和商品nd-ib-ibd疫苗组（缩写为nd-ib-ibd），共4组，各组均有20只鸡。

（3）复方佐剂对nd-ib-ibd疫苗免疫效力的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2、3和4周经静脉采血，分离血清，用nd标准、ib标准、ibd标准检测抗原检测抗体。同时在免疫后第4周，每组各扑杀3只鸡，采集肺冲洗液。将血清和肺冲洗液，均采用微量血凝抑制试验(hi)检测血清抗体效价。根据每组鸡的抗体效价，比较复方佐剂对现有nd-ib-ibd疫苗的免疫增强效果。

结果

血清抗体结果。在免疫后2、3、4周，含复方佐剂的疫苗组的各种抗体效价高于常规疫苗效价。一般常规疫苗需要经活疫苗先免疫，1周后再次免疫常规灭活疫苗，提高灭活疫苗的效价。详见图9-a、10-a、11-a。

肺冲洗液粘膜抗体结果。不同剂量的复方佐剂配方均能提高nd-ib-ibd疫苗在鸡体的肺冲洗液粘膜抗体效价，具有明显的粘膜免疫增强作用。详见图9-b、10-b、11-b。

综合血清抗体和粘膜抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高nd-ib-ibd疫苗在鸡体的粘膜免疫和血清免疫应答。

实施例10复方佐剂对猪细小病毒病疫苗（ppv）免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的猪细小病毒病疫苗（ppv），参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的猪细小病毒病ppv疫苗l、m和h。猪细小病毒疫苗购自南京天邦生物科技有限公司；猪细小病毒elisa抗体检测试剂盒，购自深圳绿诗源生物技术有限公司；5~6月龄阴性后备母猪（猪细小病毒hi抗体阴性），购自江苏明天农牧科技公司。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，5~6月龄阴性后备母猪，免疫途径为肌肉或皮下注射，按2ml/头份接种；2周后二免，按2ml/头份接种。于首免后1周、2周、3周、4周、9周、18周采血，分别用hi和elisa方法检测血清中ppv抗体，同时设立含复方佐剂的ppv-mal、ppv-mam和ppv-mah疫苗组和商品ppv疫苗组（缩写为ppv），共4组，各组均有10只猪。

（3）复方佐剂对ppv疫苗免疫效力的影响

猪细小病毒血凝抑制抗体(hi)的检测血清处理：取100μl阳性血清置于56℃水浴锅中灭活1h，然后加入25%高岭土悬液300μl充分混匀后置于37℃温箱中作用30min，3000r/min离心5min，吸取上清再加入100μl20%豚鼠红细胞泥，震荡混匀后置37℃温箱中作用1h，1500r/min离心10min，收集上清即为1：4稀释后的待检阳性血清。首先在96孔v形板1至11孔加入50μlpbs，第12孔为红细胞对照孔加pbs100μl。然后仅在第1孔加入经处理的待检血清50μl，然后倍比稀释至第10孔，并从第10孔吸出50μl弃去，此时待检血清分别为1：8、1：16、……1：4096。除第12排红细胞对照孔外每孔加4单位猪细小病毒抗原50μl，此时第11孔为病毒对照孔，震荡混匀置湿盒中在37℃温箱作用1h。每孔加0.6%豚鼠红细胞悬液50μl，震荡混匀置湿盒中在37℃温箱中作用2h，观察结果。结果判定：能抑制100%红细胞凝集的血清最高稀释倍数为被检血清的血凝抑制抗体效。

间接elisa抗体检测将分离待检血清按照elisa检测试剂盒使用说明书的方法进行ppvelisa抗体。通过酶标仪读取od630值，测定血清样品elisa抗体效价，od630﹥0.32判为阳性。

③结果

hi检测结果。常规疫苗免疫组1周后hi抗体部分转阳(hi抗体不低于6)，2周后全部为阳性，1~4周hi抗体处于较高水平，至免疫后18周有所下降。不同剂量的复方佐剂配方疫苗免疫组1周后hi抗体全部转阳，免疫后4个月抗体水平均维持在较高水平且明显高于常规疫苗免疫组(图12)。

间接elisa抗体检测结果。ppv灭活疫苗免疫后备母猪后的elisa抗体检测结果表明，各免疫组免疫后1周elisa抗体全部转阳(od630≥0.32)，1～3周为上升阶段，4～18周水平较稳定。不同剂量的复方佐剂配方疫苗组免疫后1~4个月抗体水平均维持在较高水平。含免疫增强剂组在各个时间段的抗体水平均明显高于常规疫苗免疫组(图13)。

综合血清hi抗体和间接elisa抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高ppv疫苗在猪体的血清免疫应答。

实施例11复方佐剂对猪乙型脑炎病疫苗（jev）免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的猪乙型脑炎病疫苗（jev），参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的猪乙型脑炎病jev疫苗l、m和h。猪乙型脑炎病疫苗购自南京天邦生物科技有限公司；猪乙型脑炎乳胶凝集（lat）抗体检测试剂盒，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。实验用40日龄健康仔猪，购自江苏明天农牧科技公司。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，40日龄健康仔猪，免疫途径为肌肉或皮下注射，按2ml/头份接种；2周后二免，按2ml/头份接种。同时设立含复方佐剂的jev-mal、jev-mam和jev-mah疫苗组和商品jev疫苗组（缩写为jev），共4组，各组均有10只猪。试验猪群在首次免疫前先经前腔静脉采血并分离血清，以后每隔两周采血一次，至二免后十周。检测所采集血清样本的jevlat抗体水平。

（3）复方佐剂对jev疫苗免疫效力的影响

间接elisa抗体检测将分离待检血清按照elisa检测试剂盒使用说明书的方法进行jevlatelisa抗体。通过酶标仪读取od630值，测定血清样品elisa抗体效价，od630﹥0.32判为阳性。

②结果

间接elisa抗体检测结果。疫苗免疫仔猪后jevlat抗体检测结果表明，所有剂量组仔猪免疫后免疫1周抗体全部转阳，随后抗体效价逐步增高，免疫后2～4周抗体效价均维持较高水平，含免疫增强剂组在各个时间段的抗体水平均明显高于常规疫苗免疫组(图14)。

间接elisa抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高jev疫苗在猪体的血清免疫应答。

实施例12复方佐剂对猪伪狂犬病疫苗（prv）免疫效力的影响

（1）试验材料

采用现有的猪伪狂犬病疫苗（prv），参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的猪伪狂犬病prv疫苗l、m和h。伪狂犬活疫苗bartha-k61，南京天邦生物科

技有限公司生产；bhk21细胞购自美国模式培养物研究所（atcc），中和抗体检测使用的流行变异毒株是prv-nj株，为本研究所分离鉴定。猪伪狂犬病毒血清抗体阴性健康后备母猪，购自江苏明天农牧科技公司。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，健康后备母猪，免疫途径为肌肉或皮下注射，2.0ml疫苗，14d后以同等剂量加强免疫一次。同时设立含复方佐剂的prv-mal、prv-mam和prv-mah疫苗组和商品prv疫苗组（缩写为prv），共4组，各组均有5只猪。免疫后14d和35d采血，待检测中和抗体。

（3）复方佐剂对prv疫苗免疫效力的影响

中和抗体检测将血清无菌处理，56℃灭活30min用于中和试验。用维持液将血清进行1：2，1：4，1：8，……倍比稀释，与200tcid50prv-nj株病毒液混合，37℃孵育1h；接种96孔板bhk-21细胞，100ul/孔，每个血清稀释度设4个重复孔。置于5%co2细胞培养箱37℃培养5d，观察细胞病变（cpe）记录病变孔数目。按reed-muench法计算中和抗体效价。

②结果

中和抗体检测结果。免疫后14d和35d的血清样品进行中和抗体的检测，prv各疫苗免疫组在免疫后14d均可以检测到特异性中和抗体，免含免疫增强剂组在各个时间段的抗体水平均明显高于prv疫苗。(图15)。

中和抗体检测结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高prv疫苗在猪体的血清免疫应答。

实施例13复方佐剂对猪圆环病毒2型疫苗（pcv2）免疫效力的影响

采用现有的猪圆环病毒2型疫苗（pcv2），参考实施例1第一种方法制备含复方佐剂的猪圆环病毒2型疫苗l、m和h。猪圆环病毒2型灭活疫苗（sh株）（生产批号1305009）由江苏南农高科技股份有限公司生产。猪圆环病毒2型疫苗elisa抗体检测试剂盒，购自深圳绿诗源生物技术有限公司；实验用35日龄的健康仔猪，购自江苏明天农牧科技公司。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”，35日龄的健康仔猪，免疫途径为颈部肌肉注射，2ml/头份。首次免疫后间隔2周加强免疫一次。免疫后每隔2周对各试验组采血一次，检测猪圆环病毒2型抗体水平，同时设立含复方佐剂的pcv2-mal、pcv2-mam和pcv2-mah疫苗组和商品pcv2疫苗组（缩写为pcv2），共4组，各组均有10只猪。

（3）复方佐剂对pcv2疫苗免疫效力的影响

利用本实验室已经建立的pcv2抗体，elisa检测方法检测样本中的抗体水平，操作步骤如下：（1）将大肠杆菌表达的pcv2重组cap蛋白用包被液稀释至终浓度5μg/ml，包被酶标板每孔100μl，37℃1h，4℃过夜后洗涤3-4次每次3min。（2）每孔加入300μl5％的脱脂奶粉37℃封闭1h后洗涤3-4次每次3min。（3）将待检血清用pbs1：50稀释，然后再做2倍系列稀释，每样品l行，每孔加100μl，37℃作用1h后洗涤3-4次，每次3min。（4）加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1：2000倍稀释)，100μl/孔，37℃作用1h后洗涤3-4次，每次3min。（5）加底物显色液tmb，100μl/孔，37℃避光显色15min。（6）加2mol/l硫酸，50μl/孔终止反应，10min内在酶标仪上读取450nm波长的od值。

结果判定：待检血清od450nm值大于0.211者判为阳性，以od450nm值大于0.211时的血清最大稀释倍数作为该血清的elisa抗体效价

②结果

elisa抗体检测结果。pcv2灭活疫苗免疫35日龄的健康仔猪后的elisa抗体检测结果表明，各免疫组免疫后1周elisa抗体全部转阳疫苗；接种2周时抗体效价达800倍；3周～4周抗体效价大幅上升，可达到4000倍；5周～7周抗体效价高达12800倍。含免疫增强剂组在各个时间段的抗体水平均明显高于常规疫苗免疫组(图16)。

间接elisa抗体结果表明，与常规基于矿物油佐剂的疫苗相比较，本项目发明的复方佐剂能显著提高pcv2疫苗在猪体的血清免疫应答。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>动物用粘膜靶向免疫增强剂及其在兽用疫苗中的应用

<130>20171213

<150>2017109434048

<151>2017-10-11

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工合成(人工序列)

<400>1

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