染GFP-Parkin与所示的对照（P-Gal) 和USP30构建体的SH-SY5Y细胞的免疫染色。表达24小时后，细胞用CCCP(20iiM，24h)处 理，并且针对myc、FLAG和内源性Tom20和HSP60免疫染色（刻度条，5iim)。图IC显示图 IB中具有Tom20或HSP60染色的细胞百分数的量化（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比 较检验，< 0. 001。N= 3次实验。误差条表示SEM)。图ID显示来自图IB的姆个细 胞的总Tom20和HSP60荧光强度的量化（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，**p < 0? 01。对于对照（P-Gal)、USP30-FLAG和USP30-C77S-FLAG组，n分别为 63、67 和 54。 N= 3次实验。误差条表示SEM)。图IE显示来自图IB含有Parkin簇的细胞百分数的量 化（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，< 0? 001。N= 3次实验。误差条表 示SEM)。
[0050] 图2A显示在培养的大鼠海马神经元中转染的USP30-FLAG(红色）和线粒体-标 记的GFP(绿色）的免疫染色。合并用颜色显示；单个通道是灰度的。刻度条是5pm。图 2B显示转染对照或USP30siRNA的SH-Sy5Y细胞的免疫染色。在3天的敲倒（knockdown) 后，固定细胞并且针对内源性USP30和HSP60免疫染色。USP30siRNA主要减少线粒体USP30 抗体染色（刻度条，5pm)。在右图中显示框出的区域的较高放大倍数的图片（刻度条， 2iim)。图2C显示使用USP30、HSP60和GAPDH抗体对来自大鼠脑的细胞质-和线粒体-富 集级分的免疫印迹。图2D显示共转染GFP-Parkin和所示的对照（P-Gal)和USP30构建体 的SH-SY5Y细胞的免疫染色。24小时表达后，细胞用CCCP(20iiM，4h)处理并且针对GFP、 FLAG和内源性Tom20以及聚泛素链（用FK2抗体检测）免疫染色（刻度条，5iim)。图2E 是显示由图2D的线粒体面积标准化的线粒体-相关的聚泛素染色強度的量化的图（积分 的线粒体FK2染色的荧光强度/Tom20染色面积）。（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较 检验，< 〇? 001。对于P-Gal、USP30-FLAG和USP30-C77S-FLAG组，n分别为 61、45 和 59个细胞。误差条表示SEM)。图2F显示来自转染了所示的对照（P-Gal)与USP30构建 体的表达GFP-Parkin的稳定的HEK-293细胞的细胞裂解物的免疫印迹。表达24小时后， 细胞用CCCP(5iiM，2小吋）处理并裂解。图2G是显示来自图2F针对肌动蛋白标准化的关 于GFP-Parkin的免疫印迹信号的量化的图（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验， ***p< 0. 001。N= 6次实验。误差条表示SEM)。
[0051] 图3A显示mt-Keima区分性突出显示细胞质（绿色）和溶酶体（红色）线粒体。 用mt-Keima和GFP转染培养的海马神经元。表达2天后，细胞用458nm(显示为绿色）或 543nm(显示为红色）光激发成像。GFP信号用来描述细胞（显示为白色）。刻度条，5iim。 图3B显示转染了ParkinshRNA敲倒构建体的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5ym。 图3C是显示来自图3B的线粒体自噬指数的量化的图（通过单向ANOVA-Dunnett's多重 比较检验，#P< 〇? 01和#*P< 〇? 001。n= 52-109个细胞/组。N= 3-6次实验。误 差条表示SEM)。图3D显示在转染了PINKlshRNA敲倒构建体的神经元中的mt-Keima成 像。刻度条为5ym。图3E是显示来自图3D的线粒体自噬指数的量化的图（通过单向 ANOVA-Dunnett's多重比较检验，林p< 0? 01 和*#p< 0? 001。n= 52-109 个细胞 /组。 N= 3-6次实验。误差条表示SEM)。图3F显示转染了PINK1-GFP和Parkin-shRNA#l的神 经元中的mt-Keima成像（萤光素酶shRNA和P-Gal作为对照）。刻度条为5iim。图3G 是显示来自图3F的线粒体自噬指数的量化的图（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检 验，< 0. 001。n= 55-77个细胞。N= 3次实验。误差条表示SEM)。
[0052] 图4A显示在NH4Cl处理（50mM，2分钟）之前和之后在培养的海马神经元中的 mt-Keima成像。用543nm或458nm激光发射源收集的mt-Keima信号分别以红色和绿色显 示。刻度条为5ym。图4B显示海马神经元中mt-Keima和Lysotracker的成像（以灰度显 示）。亥Ij度条为5iim。图4C显示在关于mt-Keima信号成像的神经元中针对内源性LAMP-1 的post-hoc免疫染色。在mt-Keima成像后立即固定细胞并且用抗-LAMPl抗体染色（以 灰度显示）。刻度条为5iim。图4D是显示在培养的海马神经元中mt-Keima表达1、3和 6-7天后线粒体自噬指数的量化的图（使用单向ANOVA-Bonferroni's多重比较检验，*p< 0. 05和*#p< 0. 001。n= 56-146个细胞。N= 6次实验。误差条表示SEM)。图4E 是转染了FLAG-ParkincDNA和ParkinshRNA表达构建体的HEK-293细胞裂解物的免疫印 迹。共转染PSD-95-FLAG作为对照。图4F是转染了PINK1-GFPcDNA和PINKshRNA构建 体的HEK-293细胞裂解物的免疫印迹。共转染PSD-95-FLAG作为对照。图4G显示在转染 了表达所示的shRNAs的腺伴随病毒的培养的海马神经元中内源性Parkin的免疫印迹。图 显示在转染了表达所示的shRNAs的腺伴随病毒的培养的海马神经元中的内源性PINKl 的免疫印迹。图41显示在转染了GFP-Parkin(或GFP作为对照）的神经元中的mt-Keima 成像。刻度条为5pm。图4J是显示来自图41的线粒体自噬指数的量化的图（通过斯氏t 检验，P= 0. 52。n= 61-67个细胞。N= 3次实验。误差条表示SEM)。
[0053] 图5A显示在转染了USP30-FLAG或USP30-C77S-FLAG的神经元中的mt-Keima成 像。刻度条为5iim。图5B显示转染了所示的cDNA和shRNA构建体的HEK-293细胞裂解物 的免疫印迹。共转染PSD-95-FLAG作为对照。图5C显示在转染了表达USP30shRNA的腺伴 随病毒颗粒的培养的海马神经元中的内源性USP30的免疫印迹。图显示在转染了大鼠 USP30shRNA和人USP30cDNA表达构建体的神经元中的mt-Keima成像（萤光素酶shRNA 和@ -Gal作为对照）。刻度条为5iim。图5E是显示来自图5A的线粒体自噬指数的量化 的图（通过单向AN0VA-Bonferroni's多重比较检验，林*p<0?001。43-122 个细胞。N= 6次实验。误差条表示SEM)。图5F是显示来自图5B的线粒体自噬指数的量化的图（通过 单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，林p< 0? 01 和*#p< 0? 001。n= 96-101 个细胞。 N= 4次实验。误差条表示SEM)。
[0054] 图6A显示在转染了HA-遍在蛋白和所示的构建体的母代HEK-293细胞系（其缺 乏GFP-Parkin)中关于内源性MIRO和Tom20的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。表达24小时 后，细胞用CCCP(5iiM，2小吋）处理，并且用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白化的蛋白。用所 示的抗体显示免疫沉淀和输入物的印迹。图6B显示用USP30敲倒对内源性MIRO和Tom20 的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。将表达GFP-Parkin的稳定的HEK-293细胞转染HA-遍在 蛋白和所示的shRNA和cDNA表达构建体。表达6天后，如图6A处理细胞。图6C和E显 示来自转染了所示的HA-标记的遍在蛋白突变体并用CCCP(20iiM，2小吋）处理的细胞的 内源性Miro和Tom20的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。图6D和F显示来自（C)和（E)的 免疫印迹信号的量化。相对于野生型遍在蛋白报告由遍在蛋白突变体提供的遍在蛋白化 的量（与'野生型HA-遍在蛋白+CCCP'组相比，#p<0.01和林*p<0.001，使用单向 ANOVA与Dunnett's多重比较检验进行。3表示***p< 〇. 001)。图6G显示转染了所示 的FLAG-标记的USP30构建体并用CCCP(5iiM，1-6小时）处理的GFP-ParkinHEK-293稳定 细胞裂解物的免疫印迹。图6H是显示针对图6G中所示的肌动蛋白标准化的免疫印迹信号 的量化的图（与P-Gal对照相比，*p< 0? 05，#p< 0? 01，*#p< 0? 001，使用两向ANOVA 与Bonferroni's多重比较检验。关于所有其他蛋白（VDAC，Mfn-l，Tom70，Hsp60)的免疫 印迹信号没有达到显著性。N= 3-5次实验）。
[0055] 图7A显示用USP30过量表达对内源性MIRO和Tom20的抗-HA-免疫沉淀的免疫 印迹。将稳定表达GFP-Parkin的HEK-293细胞转染HA-遍在蛋白和所示的构建体。在表 达24小时后，细胞用CCCP(5iiM，2小吋）处理，并且用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白化的 蛋白。用所示的抗体显示免疫沉淀和输入物的印迹。图7B是显示来自图7A的共-IP化的 MIRO的免疫印迹信号的量化的图。图7C是显示来自图7A的共-IP化的Tom20的免疫印 迹信号的量化的图。将用抗-HA珠子共沉淀的蛋白水平针对'P-Gal+CCCP'组标准化（与 3 -Gal+CCCP相比，通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，*p< 0? 05,#p< 0? 01 和 ***p< 0. 001。N= 3-5次实验。误差条表示SEM)。图7D显示用USP30敲倒对内源性MIRO 和Tom20的抗-HA免疫沉淀的免疫印迹。将表达GFP-Parkin的稳定的HEK-293细胞转染 HA-遍在蛋白和所示的shRNA质粒。表达6天后，如图7A处理细胞。图7E是显示来自图7D 的关于共-IP化的MIRO的免疫印迹信号的量化的图。图7F是显示来自图7D的关于共-IP 化的Tom20的免疫印迹信号的量化的图。用抗-HA珠子共沉淀的蛋白水平针对'萤光素酶 shRNA+CCCP'组标准化（与'萤光素酶shRNA+CCCP'相比，通过单向ANOVA-Dunnett's多重 比较检验，*P< 〇? 05,#p< 0? 01和*#p< 0? 001。N= 4-6次实验。误差条表示SEM)。
[0056] 图8A显示来自转染了所示的构建体的GFP-ParkinHEK-293细胞的HA-遍在蛋白 沉淀的免疫印迹。转染并用CCCP(5ilM，2小吋）处理后，用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白 化的蛋白，并且用所示的抗体免疫印迹沉淀和输入物。图8B显示在转染了Tom20-myc和 USP30构建体（P-Gal作为对照）的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5iim。图8C显 示在转染了USP30shRNA和MIROcDNA构建体（萤光素酶RNAi和P-Gal作为对照）的神经 元中的mt-Keima成像。刻度条为5iim。图8D是显示来自图8B的线粒体自噬指数的量化 的图（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，<0. 001。对于所有组，n=67-80 个细胞。N=3次实验。误差条表示SEM)。图8E是显示来自图8C的线粒体自噬指数的量 化的图（通过单向ANOVA-Bonferroni's多重比较检验，*p<0? 05和*#p<0? 001。对 于所有组，n=72-75个细胞。N=3次实验。误差条表示SEM)。