[0057] 图9A显示在USP30敲倒实验中与由Tom20鉴定的K-GG肽相对应的萃取离子色谱 (extractedionchromatograms)。相对于最丰富的分析，其前体离子m/z表示高于姆个峰， 在y轴上显示每种遍在蛋白化肽的相对丰度。每种K-GG肽的序列在下方显示为绿色。星号 表示修饰的赖氨酸残基。图9B显示在Parkin过表达实验中与由USP30鉴定的K-GG肽相对 应的萃取离子色谱。数据以与（A)相似的方式表示。图9C显示来自转染了野生型、K161N 和G430DGFP-Parkin构建体的细胞的内源性USP30的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。表达 24小时后，细胞用CCCP(20iiM，2小吋）处理，并且用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白化的蛋 白。用所示的抗体显示免疫沉淀和输入物的印迹。图9D显示来自（C)的共IP化的USP30的 免疫印迹信号的量化。将用抗-HA珠子共沉淀的蛋白水平针对'野生型GFP-Parkin+CCCP' 组标准化。（与'野生型GFP-Parkin+CCCP'相比，通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检 验，***p<0.001。N= 4次实验。误差条表示S.E.M.)。图9E显示由转染了所示的GFP 和GFP-Parkin构建体并用CCCP(20iiM)处理的HEK-293细胞制备的裂解物的免疫印迹。 图9F显示来自（E)的针对肌动蛋白标准化的关于USP30的免疫印迹信号的量化。（与野 生型GFP-Parkin比较，使用两向ANOVA与Bonferroni's多重比较检验，林p<0? 01，林*p < 0. 001。N= 4次实验。误差条表示S.EM.)。
[0058] 图IOA显示在转染了所示的siRNAs和cDNA表达构建体的表达GFP-Parkin-G430D 的稳定SH-SY5Y细胞中的免疫染色。在表达3天后，细胞用CCCP(20iiM，24小吋）处理，固 定，并针对GFP、FLAG和内源性Tom20染色。刻度条为5iim。图IOB是显示来自图IOA的 Tom20荧光强度的量化的图（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，< 0. 001，误 差条表示SEM)。图IOC是显示来自图IOA的GFP-Parkin-G430D点纹面积的量化的图（通 过单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，< 0. 001，误差条表示SEM)。图IOD显示在 转染了ParkinshRNA和USP30-C77A-FLAG的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5iim。 图IOE是显示来自图IOD的线粒体自噬指数的量化的图（通过单向ANOVA-Dunnett's多重 比较检验，< 0. 001。N= 71-77个细胞。N= 3次实验。误差条表示SEM)。
[0059] 图IlA显示在转染USP30siRNA3天的SH-SY5Y细胞中内源性USP30的免疫印 迹。图IlB和IlC显示在转染了所示的siRNAs的表达GFP-Parkin-G430D的稳定的SH-SY5Y 细胞中的免疫染色。敲倒3天后，细胞用CCCP(20iiM，24小吋）处理，固定，并针对GFP和 内源性Tom20染色。刻度条为5iim。图IlD是显示来自图IlB和IlC针对对照siRNA标 准化的Tom20染色强度的倍数变化的量化的图（通过单向ANOVA-Dunnett's多重比较 检验，*#p<〇. 001。误差条表示SEM)。图IlE和IlF显示转染了USP30siRNA的表达 GFP-Parkin-G430D(E)和表达GFP-Parkin-K161N(F)的SH-SY5Y细胞的免疫染色。敲倒 3 天后，细胞用CCCP(20iiM，24小时）处理，固定，并针对GFP和内源性Tom20与HSP60染色。 刻度条为5iim。图IIG和IIH是显示来自图IIE和IIF针对对照siRNA标准化的Tom20 (G) 和HSP60(H)染色强度的倍数变化的量化的图。（通过斯氏t检验，*p< 0. 05，#p< 0. 01 和*** <〇? 〇〇1。N= 2-3次实验。误差条表示S.E.M.)。
[0060] 图12A显不来自野生型、parkin突变体（park25)和"parkin突变体；dUSP30敲 倒"（park25;Actin-GAL4>UAS-dUSP30KNAi)果蝇（flies)的间接飞行肌（IFMs)的横截面。 电子致密的线粒体用箭头标记。具有減少的和无组织的嵴（cristae)的线粒体（由此在外 观上是苍白的）用虚线表示（上图-刻度条为Ium)。下图中显示更高放大倍数的图像（刻 度条为0.2ym)。图12B和C显示来自（A)的线粒体完整性的量化。相对于总线粒体面积 的含有无组织的嵴的线粒体的面积百分数（B)和含有无组织的线粒体的肌肉面积的百分 数（C)进行不知情的定量。（与野生型比较，通过两向ANOVA-Bonferroni's多重比较检验， *p< 0? 05,**p< 0? 01 和***p< 0? 001。对于park25 相对于park25,***p< 0? 001 ;肌动 蛋白-GAL4 >UAS-dUSP30KNAi。每只果蝇34-35个成像视野，N= 3-4只苍蝇。误差条表示 S.EM.)。图12D和E显示dUSP30敲倒和百草枯对果蝇（Drosophila)的爬行测定的影响。 对于所示的基因型，用赋形剂（5 %蔗糖）或百草枯（10mM，48小吋）处理，在30秒内爬行> 15cm的果蝇的百分数。（通过单向ANOVA与Bonferroni's多重比较检验，< 0. 01和 ***p<0.001。N= 4-10次实验。误差条表示S.E.M)。图12F显示对于所示的基因型通 过ELISA确定的每只果蝇头的多巴胺神经递质水平。（通过单向ANOVA-Bonferroni's多 重比较检验，*P< 〇? 05和*#p< 0? 001。n= 28个头/基因型。N= 4次实验。误差条 表示S.E.M.)。图12G和H显示dUSP30敲倒和百草枯对果蝇存活的影响。对于所示的基 因型，用赋形剂或百草枯（10mM，多至96小吋）处理，仍然存活的果蝇的百分数。（利用两 向ANOVA与Bonferroni's多重比较检验，林p< 0? 01 和***p< 0? 001。N= 3 次（G)和 4次（H)实验。误差条表示S.E.M.)。
[0061] 图13显示不対称的"火山图"，显示在USP30敲倒（左边）和GFP-Parkin过表达 (右边）两个实验中，相对于单独的CCCP-处理，对于"组合"处理，其遍在蛋白化显著增加 的41种蛋白的子集（P<0. 05)。在所述两个实验中，"组合"分别是指用CCCP处理并且表 达USP30-shRNA的细胞或用CCCP处理并且表达GFP-Parkin的细胞。对于该蛋白子集，报 道了遍在蛋白化的倍数增加（X轴）和p-值（y-轴）。线粒体蛋白（基于人MitoCarta数 据库鉴定）用红色显示。
[0062]图 14 显示抑制性肽USP30_3( "p印3"；SEQIDNO:1)和USP30_8( "p印8"；SEQ IDNO:2)对各种肽酶的抑制，所述肽酶包括USP30,如实施例10中所述。
[0063] 图15显示关于USP30_3以及某些亲和力成熟的肽的肽位置的残基概率、以及信号 与噪声比率（"S/N"）、ELISA信号（"信号"）、每种序列的克隆数（"n"）、克隆总数（"总 数"）和特有序列的数目（"Uniq"）的图表，如实施例10中所述。
[0064] 图16显示关于USP30_3和三种亲和力成熟的肽的信号与噪声比率的图表，如实施 例10中所述。对于每种肽，测试的靶标从左至右为USP2，USP7，USP14，USP30，UCHL1，UCHL3 和UCHL5。甸种肤的序列显不在下方。
[0065] 图17A显示在转染了USP30shRNA的海马神经元中的參比mito-roGFP成像。"相 对氧化指数"以'颜色刻度'从〇(ImMDTT处理后的mito-roGFP比率，以黑色显示）至1 (在 100iiMaldrithiol处理后的mito-roGFP比率，以红色显示）显示。图17B是显示来自图 17A的相对氧化性的量化的图（通过斯氏t检验，***p< 0. 001。n= 24个细胞（关于萤 光素酶shRNA)和36个细胞（关于USP30shRNA)。N= 3次实验。误差条表示SEM)。图17C 显示dUSP30mRNA的定量性RT-PCR。在肌动蛋白-GAL4、UAS-dUSP30mi和肌动蛋白-GAL4 >UAS-dUSP30mi果蝇中的qRT-PCR相对于肌动蛋白-GAL4进行表示。每组中dUSP30mRNA 水平针对果蝇RpII140mRNA水平标准化。N= 7次实验。通过单向ANOVA与Bonferroni's 多重比较检验，< 0. 001。图17D显示在对照果蝇（肌动蛋白-GAL4)中的爬行測定。 果蝇用赋形剂对照（5 %蔗糖）或百草枯（10禮，48小吋）处理。如所示，L-DOPA(1禮，48小 时）与百草枯同时施用。（通过单向AN0VA-Dunnett's多重比较检验，***p<0?001。N =6次实验。误差条表示S.E.M.)。图17E显示每只果蝇头通过ELISA測定的5-羟色胺 (serotonin)水平。果蝇用百草枯（10mM，48小时）或赋形剂对照（5%鹿糖）处理。（通过 单向ム^3\^-13〇1^61'1'〇11；['8多重比较检验计算ロ-值。11 = 8个头』=2次实验。误差条表 示S.E.M.)。图17F和G显示在所示基因型的果蝇中的（F)dUSP47和（G)dYODlmRNA水平的 定量RT-PCR测量，相对于肌动蛋白-GAL4基因型进行表示。使用TaqMan测定DmOl795269_ gl(果蝇CG5486(USP47))和DmOl840115_sl(果蝇CG4603 (Y0D1))。使用DmO2134593_ gl(RpII140)进行标准化。（使用单向ANOVA-Dunnett's多重比较检验，p** <0? 01和p*** <0.001。N= 3次重复。误差条表示S.E.M.)。图17H和I显示用赋形剂或百草枯（IOmM) 处理的所示基因型的果蝇的存活曲线。图表显示在喂饲百草枯后在所示的时间存活的果蝇 的百分数。（使用两向ANOVA与Bonferroni's多重比较检验，*p< 0? 05,p# < 0? 01和 P*** < 0. 001。N= 5次⑶和4次⑴实验。误差条表示S.E.M.)。
[0066] 详述
[0067] 本发明人已经鉴定了USP30,即定位线粒体的去遍在蛋白酶（deubiquitinase， DUB)，作为Parkin-介导的线粒体自噬的拮抗剂（atagonist)。USP30通过其去遍在蛋白酶 活性抵消受损的线粒体的遍在蛋白化和降解，并且抑制USP30挽救由突变体Parkin引起的 线粒体自噬缺陷。此外，USP30的USP30抑制减少氧化应激，并且提供针对线粒体毒素鱼藤 酮的保护作用。由于受损的线粒体更可能积聚Parkin，因此，USP30抑制应该优先清除不健 康的线粒体。除了神经元（如黑质神经元，其在帕金森病中特别易受线粒体功能障碍的影 响）之外，长期代谢活性的细胞，如心肌细胞，也依赖于有效的线粒体质量控制系统。在这 一情形中，已经表明Parkin通过响应缺血性应激而激活线粒体自噬并且清楚受损的线粒 体来保护心肌细胞抵抗缺血/再灌注损伤。因此，为我们提供USP30的抑制剂，用于治疗涉 及线粒体缺陷的疾病，包括神经学病症、心脏病症和系统病症。
[0068]I?定义
[0069] "抑制剂"是指能够阻断、中和、抑制、取消、減少和/或干扰靶标的ー种或多种活性 和/或减少靶蛋白的表达（或编码所述靶蛋白的核酸的表达）的试剂。抑制剂包括，但不 限于，抗体、多肽、肽、核酸分子、短干扰RNAs(siRNAs)和其他抑制性RNAs、小分子（例如， 小的无机分子）、多糖、多核苷酸、反