sm test)进行接种后，在一个星期内，每24个小 时测量一次抗菌活性。
[0102]
[0103]对蛋白质分解酶的效果分析
[0104]在 37°C的温度条件下，对蛋白酶 K(proteinase K, Sigma-Aldrich、Inc.、USA)、胰 凝乳蛋白酶（chymotrypsin、Boehringer MannheimGmbH.、Germany)、蛋白酶 K (proteinase K, Sigma-Aldrich、Inc.、USA)、膜蛋白酶（trypsin、Sigma-Aldrich、Inc.、USA)进行一个小 时的孵化处理后，除了蛋白酶K以外，在常温（25°C)条件下，将其它蛋白酶的最终浓度调至 I mg/mf后，观察了除细胞以外的蛋白物质及非-蛋白物质是否对病原性微生物具有活性以 及对于CS (利用醋酸纤维膜YM-I进行过滤，分子量在1000以下及1000以上）蛋白质分解 酶的敏感度。经适当时间进行恒温反应后，对混合物进行变性处理，并为对这些蛋白酶进行 非活性化处理，而在95°C的温度条件下，进行5分钟时间的热处理。如上所述，利用纸片扩 散法，确定了抗菌活性。
[0105]
[0106] 对抗菌物质的热处理
[0107] 为了确认温度对抗菌物质的活性造成的影响，而在100°C的水浴（water bath) 中，经60分钟、120分钟时间，对CS进行热处理，又在121°C温度条件下，利用高压蒸气灭菌 器（autoclave)，对对CS进行15分钟时间的热处理。在对样品进行活性分析之前，将CS置 于常温条件下。此时，将CS用作对照群。此外，在进行高温处理后，通过纸片扩散法测量了 剩余的抗菌活性。
[0108]
[0109] 抗细菌物质的分离准备
[0110] 为在分离的Lb. plantarum LBP-KlO中，利用变形的MRS(mCS)，从CS中提炼出抗菌 性化合物，并阐明其特性而确定了如下的组成要素。mMRS中包括如下的组成要素：
[0111] 每升含有l〇g蛋白胨、2g柠檬酸铵、5g钠醋酸纤维、0.1 g镁硫酸、0.05g锰硫酸、2g 磷酸钾、5g酵母菌提取物及20g葡萄糖。
[0112] 在将D-葡萄糖与其它供应源混合之前，分别进行了灭菌处理。从在mMR中培养 三天的 Lb. plantarum LBPK-10 中提取 CS (在 P. pentosaceus 及 Lc. Mesenteroides 中 也是如此），并如上所述，在8000rpm条件下进行了 30分钟时间离心分离处理，然后将 Lb. plantarum LBPK-10菌株浓缩10倍后，进行冷冻干燥（freeze-drying)处理，并根据液 体-液体提取法，利用分液漏斗（separating funnel)，提取一天时间的二氯甲烧（CH2Cl2), 并在55°C的温度条件下，利用蒸发器进行了脱水处理。然后，获取分离有机相（organic phase)，并利用蒸汽去除了有机溶剂。此外，为比较水基相（aqueous phase)与有机相 及CS的活性而只提取了水基相（aqueous phase)。使洗脱液（eluent)通过C18SPE墨盒 (WatersSep-pak C18plus cartridge、Millipore Corp.、Marlborou、MA)后，让溢出的样品 置于SPE墨盒上，并采用了 100%的甲醇溶剂（isocratic flow)。在将样品置于SPE上之 前，对墨盒进行活性化处理，并利用15ml的MeOH及15ml的流水进行了 100%的清洗后，将 样品置于SPE上，并用谁进行了 100%的清洗。通过墨盒及100% MeOH，完成了样品的最终 溢出。此外，为继续收集溢出的样品以及清除剩余的有机溶剂而进行了蒸发处理。为了实 施下述HPLC过程，而利用适当进行灭菌处理的TDW，对每个浓缩的样品进行了溶解处理。
[0113]
[0114] 通过高性能液体色谱法（HPLC)分析的抗病毒物质分离
[0115] 利用适量的蒸馏水溶解已提取的物质，并利用0.22 ym的醋酸纤维素膜进行 了过滤处理。过滤的样品通过采用ODS C-18垂直轴（octadedosyl_C18hydrophobic semi-preparative column) (9.4X250mm,Agilent,USA)的 HPLC(High Performance Liquid Chromatography (semi-prep HPLC system, Agilentl200series, USA))系统进行了 分析和分离处理。此外，在将垂直轴的温度固定在40 °C后，35分钟内的流动相中，67 %是 水、3%是乙腈（ACN)、30%是乙醇，而此时的流速为1.5ml/分钟。此外，利用UV多重波张 感应系统（UV multi-wavelength detector system)，在波长分别为 210nm、260nm、280nm 的条件下进行了观察。为了获取每个粉末样品，而通过蒸发及冻结的方式，对每个分离 (fraction)进行了收集和浓缩处理。
[0116]
[0117] 利用最低抑菌浓度法（MIC)测量抗菌活性
[0118] 利用HPLC搜集分馏物质质质（fractionation)后，如引用文献[Mathur et al.、2005;Messens et al.，2002]所述那样，通过最低抑菌浓度法（minimum inhibitory concentration ;MIC)，对每个获取样品的活性进行了检测。通过相同的方法，在如此分离的 样品中，追加提炼具有最高活性的适当峰值的分离（fraction)，然后又获取了单一化合物。 对此，还可通过GC/MS、元素分析（elemental analysis)、NMR光谱法及X光散射技术（X-ray crystallography)等多种分析法进行追加分析。
[0119]
[0120] 细胞培养及病毒菌株、培养基及培养条件
[0121] DMEM(v/v)培养基的完全组成成分如下：即，76. 5 %的DMEM(高葡萄糖、 HycloneLaboratories、USA)、1. 0%的青霉素链霉素（Gibco、USA)、2. 5%的 I. 0MHEPES 缓冲 溶液、杜尔贝科的磷酸-缓冲生理食盐水（7. 5% DPBS)内牛血清灭菌、BioXtra、适合细胞 培养的2. 5 %的蛋白溶液（Sigma，USA)及10. 0 %牛胎血清（FBS) (NOVA、USA)。
[0122]
[0123]此外，VIM 由 94. 0 % 的 DMEM(高葡萄糖）（Hyclone Laboratories、USA)、1. 0 % 的青霉素/链霉素（Gibco、USA)、2. 5% 1.0 M HEPES缓冲液（Gibco, USA)、杜尔贝科的磷 酸-缓冲生理食盐水（7.5% DPBS)内进行牛血清灭菌处理的BioXtra、适合细胞培养的 2. 5 %的蛋白溶液（Sigma、USA)及10.0 %牛胎血清（FBS) (NOVA、USA)、0? 1 %的进行甲苯 矿酰氯甲基酮 _ 处理的膜蛋白酶（tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin(TPCK-treated trypsin) (2μg/ml)组成。为了进行齿菌斑分析，而将VIM琼脂糖 附加到2X VM中，并从1.4%的琼脂糖SEG(TNT research、Korea)中，被最终用作0.7%的 VM琼脂糖。
[0124]
[0125] 抗病毒活性测试-齿菌斑分析法
[0126] a. MDCK细胞培养条件
[0127] 如上述研宄一样，以齿菌斑（plaque)为系数进行了抗病毒测试。[Gaush et al.、 1968 ；Huprikar et al. >1980 ；Chapel et al. >2006 ；Chapel et al. ,2007 ；Furuta et al.、2009]在本发明实施例中，为了观察抗病毒活性，而将Madin-Darby犬肾（Madin Darby canine kidney ;MDCK)的上皮细胞用作抗病毒指标。在本发明中，针对每个齿菌斑-精 炼的每个野生型流感病毒细胞，采用了 5pfu的单层5x10s细胞内的MDCK细胞。[Gaush et al. 1968 ；Huprikar et al. 1980 ；Chapel et al. 2006 ；Chapel et al. 2007 ；Furuta et al. 2009]在上述DMEM中培养了 MDCK细胞。最初，是在37°C的水槽中缓速融化了 MDCK细 胞，并为去除细胞内所含有的二甲亚砜（DMS0)，而用10倍以上的完全DMEM进行了轻柔混 合处理，且在12, OOOrpm条件下，进行了 3分钟时间的离心分离处理，然后去除上清液，以防 止MDCK细胞浮游。在此，反复进行了三次上述过程。利用DMEM培养基清洗MDCK细胞后， 让MDCK细胞悬浮在IOml的完全DMEM培养基上，并通过轻轻搅拌，使得MDCK细胞分散于细 胞培养盘中，然后转移至将100n细胞培养盘上。此后，在37°C温度的5% CO2孵化器内， 对MDCK细胞进行了 72个小时的培养。利用如此方法，反复培养了 MDCK细胞（细胞培养盘 的90~95% )。在倒掉DMEM培养基后，利用I. 5ml的PCK-胰蛋白酶对培养的MDCK细胞 (2x105)进行处理，并在37°C温度的5% C0J?化器内，对MDCK细胞进行了 10-15分钟时间 的培养。此外，利用10倍的DMEM培养基混合分离出来的MDCK细胞，为了防止生长细胞的 保留，并将上述混合物移送至经过灭菌处理的50ml锥形管内，然后进行3分钟时间的离心 分离处理，并利用磷酸缓冲生理食盐水（PBS)清洗了三次。利用PBS清洗结束后，添加IOml 的完全DMEM培养基，并继续添加了 30ml的完全DMEM培养基。然后，将每个IOml的MDCK细 胞移送至l〇n细胞培养盘中，并在37°C温度的5% 0)2孵化器内，进行了 48个小时培养。
[0128]
[0129] b.抗病毒活性的齿菌斑分析法
[0130]如上述说明（Gaush et al. 1968 ;Huprikar et al. 1980 ;Chapel et al. 2006 ; Chapel et al. 2007 ;Furuta et al. 2009)，做好了齿菌斑的分析准备。将生长至细胞培养 盘90~95 %的MDCK细胞移送到了 6孔板细胞盘中，再将生长至细胞培养盘80 %的MDCK 细胞，并利用PBS清洗两次，然后将含有200 M病毒感染培养基（virus infection media; VM)的多种单一化合物投入到MDCK细胞当中。在34°C温度条件下进行90分钟恒温培养期 间，每15分钟轻轻摇动感染病毒6孔板盘。此后，去除感染病毒的培养基，并将0. 7% DMEM 琼脂糖（1:1)放置到各自的孔板中，然后在34°C温度的5% CO2保育箱内进行72个小时的 培养，以观察齿菌斑的生成鉴定。
[0131]
[0132] 通过采用GS-MS的电子轰击电离法（electron ionization:EI)和化学离子化法 (chemical ionization:Cl)的分析
[0133] 在本发明中，采用具备7679系列自动液体采样器，并由Agilent 6890系列 GC(Agilent Technologies、Waldron、Germany)组成的色谱图系统。质量分析法中利用了高 分辨率质量分析仪（JE0LJMS-700、Tokyo, Japan)，以在Lb. plantarum中进行电子离子化及 化合物离子化研宄，并采用气体色谱图系