进行定量。在成像之前10分钟，所有小鼠 IP注射100 μ 1悬 浮于DPBS中的30mg/ml D-荧光素（PerkinElmer)以提供荧光素酶的底物。在成像前，小 鼠用吸入异氟醚气体麻醉。对于涵盖小鼠头部的目的区域，图像使用Xenogen Ivis 200成 像系统获得且用来自Xenogen的Living Image 4. 1软件定量图像。图像强度表示为光子 数 /sec/cm2/sr〇
[0102] HPLC系统和条件：使用具有扫描荧光检测器的Agilent 1100系列HPLC系统 (Wilmington, DE, USA)，激发和发射波长分别设定为 480nm和 560nm。Agilent Chemstation 软件用于数据采集。分离在装有保护柱（BDS-Hypersil_C18,5yM)的Waters Spherisorb 0DS2柱（4mm x 250mm，5 μ m)上完成。洗脱用含有65 %磷酸单钠 （pH 2. 2)和35 %乙腈的流 动相进行。将1. 25ml/分钟的恒定流速用于分离。所述柱设定为28°C且注射体积为25 μ 1。
[0103] 多柔比星、aldoxorubicin和内部标准品柔红霉素分别表明4. 06分钟、4. 39分 钟和6. 52分钟的平均保留时间且在应用测定条件下充分分辨。在分析的器官样品中， aldoxorubicin以多柔比星的保留时间洗脱。在使用的色谱条件下未观察到干扰峰。
[0104] 样品制备：在具有颅内GBM肿瘤的小鼠中通过尾静脉注射施用24mg/kg/注射 (MTD的75% )的aldoxorubicin，且在注射后4、8、16和24小时之后，通过C02气体对小鼠 (各时间点3个动物）进行安乐死。通过心脏穿刺将血液样品收集于肝素化管中且离心用于 血浆分离。在血液取样后立即手术移除器官（脑、心脏、肾、肝和肺）。血浆和组织在_80°C 储存直至分析。
[0105] 冷冻样品在室温下解冻且使用PowerGen 125型勾衆机（Fisher Scientific)在 无菌生理盐水中均质化以在肝和脑中获得150mg/ml的最终组织浓度（w/v);对肺、心脏和 肌肉，获得125mg/ml的最终组织浓度且对肾获得100mg/ml的最终组织浓度。向血浆或组 织样品的20 μ 1等分试样中添加高氯酸（35%，v/v)，随后添加25 μ 1流动相。将样品涡旋， 随后以10, OOOx g离心10分钟且将25 μ 1上清液施加于HPLC柱。
[0106] 统计学分析：使用时间等效检验、使用SAS Institute, Inc.，Cary, NC的统计学分 析软件生成Kaplan-Meier存活曲线以比较对照小鼠和药物处理的小鼠的存活。各组之间 的差异使用非配对的Student氏t检验评估。所有值都显示为平均值土标准偏差。p值 <0.05被视为统计显著的。
[0107]
[0108] Aldoxorubicin而非多柔比星是小鼠中神经胶质肿瘤的有效抑制剂。图1和2显 示在颜内植入肿瘤细胞8天后，对照组（组C)、多柔比星处理组（组D)和aldoxorubicin 处理组（组A)之间不存在平均肿瘤大小的相对差异（p>0. 05)。在22天内对照组中的3个 动物和多柔比星组中的2个动物死亡且其它发展出大肿瘤。Aldoxorubicin处理2周显示 肿瘤消退，导致平均肿瘤大小为对照组的28%和多柔比星处理组的40% (图2D)。另外，对 照组和多柔比星处理组中的动物经历的存活与aldoxorubicin处理组中的动物相比短得 多。对照组（组C)和多柔比星组（组D)中的所有动物在肿瘤植入后34天内死亡，但处理 组（组A)中的动物仍活着。甚至在41天后，aldoxorubicin组中的八个动物中的七个仍 活着。参见图1。
[0109] 图3特征在于Kaplan-Meier存活曲线，其显示与媒介物处理组或多柔比星处理组 相比，用aldoxorubicin处理的小鼠中的存活时间增加 （p〈. 0001)。媒介物处理和多柔比星 处理的小鼠之间不存在存活时间的差异（P = 0. 949)。当终止研究时，检查存活动物，因为 其尚未达到终点。
[0110] HPLC用于测定aldoxorubicin施用于颜内具有肿瘤的小鼠后的血衆和组织分布。 浓度对时间曲线显不于图4中。静脉内施用aldoxorubicin(MTD的~75% )后，在血衆和 除脑外的其它器官中，药物浓度在4小时后是最高的。血浆浓度是肝、心脏、肺和肾中的平 均浓度的多于20倍，并且是脑中浓度的多于200倍。在血浆和除脑外的其它组织中，前药 在20小时内几乎达到其浓度的50%。在脑中，水平从4小时至24小时几乎保持相同，表明 脑中的高抗肿瘤活性可以与药物的长期存在相关。
[0111] 结论
[0112] 这些结果表明，静脉内施用的aldoxorubicin、但非多柔比星诱导肿瘤消退且显著 增加采用颅内植入人GBM肿瘤的体内异种移植模型中的存活。
[0113] 实施例2 :Aldoxorubicin诱导的肿瘤消退和异种移植小鼠模型中的存活的增加
[0114] 雌性小鼠（6-8周龄）颅内植入具有荧光素酶报告基因的U87-1UC亚系以建立人 神经胶质母细胞肿瘤。肿瘤生长系使用D-荧光素底物、通过生物发光成像评估。将8个小 鼠用aldoxorubicin处理且将8个小鼠经磷酸盐缓冲生理盐水（媒介物）处理。处理在植 入GBM细胞后9天开始。A1 doxorubicin或媒介物静脉注射施用，一周一次，持续三周（细 胞植入后9、16和23天）。Aldoxorubicin的前两次剂量是小鼠中的32mg/kg/注射的MTD 的75 %且第三次剂量是小鼠中的32mg/kg/注射的MTD的50 %。结果显示于图5中。
[0115] Mik
[0116] 这些结果表明，静脉内施用的aldoxorubicin诱导肿瘤消退且增加采用人GBM肿 瘤的颅内植入的体内异种移植模型的存活。
[0117] 实施例3 :肿瘤组织中的aldoxorubicin保留
[0118] HPLC系统和条件：使用的HPLC系统是配备有扫描荧光检测器的Agilent 1100 系列（Wilmington, DE, USA)，激发和发射波长分别设定为480nm和560nm。Agilent Chemstation软件用于数据采集。分离在装有保护柱（BDS-Hypersil_C18,5yM)的Waters Spherisorb 0DS2 柱（4mm x 250mm, 5 μπι)上完成。洗脱用由 65% 50mM 磷酸单钠 （pH 2· 2) 和35%乙腈构成的流动相进行。1. 25ml/分钟的恒定流速用于分离。所述柱设定为28°C且 注射体积为25 μ 1。
[0119] 多柔比星、aldoxorubicin和内部标准品柔红霉素分别表明4. 06分钟、4. 39分 钟和6. 52分钟的平均保留时间且在应用测定条件下充分分辨。在分析的器官样品中， aldoxorubicin以多柔比星的保留时间洗脱。在使用的色谱条件下未观察到干扰峰。
[0120] 样品制备：为了定量脑组织和脑肿瘤中的aldoxorubicin，小鼠通过吸入C02进行 安乐死，Aldoxorubicin注射（24mg/kg/注射）后6小时和24小时收获脑部且切出肿瘤。 收获的组织在_80°C储存直至分析。
[0121] 冷冻样品在室温下解冻且使用PowerGen 125型勾衆机（Fisher Scientific)在 无菌生理盐水中均质化以获得150mg/ml的最终组织浓度（w/v)。然后将高氯酸（35%，v/ v)添加至20 μ 1等分试样，随后添加25 μ 1流动相。将样品涡旋，随后以10, 000x g离心 10分钟且将25 μ 1上清液施加于HPLC柱。在分析的组织样品中，aldoxorubicin以多柔比 星的保留时间洗脱。
[0122] 结论
[0123] Aldoxorubicin在肿瘤组织中的保留高于周围脑组织的3至4倍。参见图8。
[0124] 实施例4 :实验简沐
[0125] 免疫组织化学：对于组织学分析，收获来自对照和药物处理的具有肿瘤的小鼠 的脑组织，在最佳切除温度（0CT)化合物中快速冷冻且在-80°c储存。将冷冻切片置于 载片上且在锌缓冲的福尔马林中固定。载片用在1% BSA中的5%山羊血清封闭，随后 与针对 CD31 (102402, Biolegend, San Diego，CA)、Ki_67(abl56956, Abeam, Cambridge, MA)、波形蛋白（ab92547, Abeam)、切割的-胱天蛋白酶-3 (CP229B, Biocare Medical)和 GFAP(NB300-141,Novus Biologicals, Littleton, CO)的一抗孵育过夜。然后将载片与 一抗源特异性的二抗孵育，所述特异性二抗缀合至作为核复染色剂的Alexa Fluor 488 或635和DAPI。使用的检测荧光团限于多柔比星的固有荧光光谱（Aex= 480nm，λ eni = 550-590nm) (22876313)周围的那些，以避免渗漏且能够实现药物的共检测（就某些抗原而 言）。荧光显微镜显微照片使用配备有multi-Argon 405、559和635二极管的FV1000共焦 显微镜（Olympus of America, Center Valley, PA)以 100X 和 400X 放大率获得。定量分析 用 Slidebook 软件（Intelligent Imaging Innovations，Denver，CO)进行。图 9 和 11 说 明通过免疫组织化学分析获得的数据的定量分析。
[0126] Mik
[0127] Aldoxorubicin在脑肿瘤中累积，但不在正常脑组织中累积。在肿瘤或正常脑中未 发现任何明显量的多柔比星。
[0128] 实施例5 :实验简沐
[0129] 脑肿瘤中的aldoxorubicin/多柔比星检测：如以上实施例1中所述，向具有肿瘤 的小鼠给予aldoxorubicin或多柔比星的静脉内注射。在最后注射后24小时对小鼠进行 安乐死。收获脑部和使用针对明场和落射荧光装备有涵盖多柔比星特异性波长的滤光片的 MVX10立体显微镜（Olympus of America)成像以显现药物累积。参见图10。
[0130] 结论
[0131] Aldoxorubicin而非多柔比星在神经胶质母细胞肿瘤中累积。
【主权项】
1. 用于治疗脑癌的方法，其包括向患者施用治疗有效物质，其中所述治疗有效物质包 含：或其药学上可接受的盐， 其中X是可在所述患者体内以pH依赖性方式水解裂解或酶促裂解的部分。2. 根据权利要求1的方法，其中部分X在所述患者体内裂解，由此释放所述细胞毒素 剂。3. 根据权利要求2的方法，其中所述细胞毒素剂是蒽环霉素。4. 根据权利要求3的方法，其中所述蒽环霉素选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊 达比星、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、洋红霉素、米托蒽醌和阿美蒽醌，或上述 任一种的衍生物或上述任一种的药学上可接受的盐。5. 根据权利要求4的方法，其中所述蒽环霉素是多柔比星或其药学上可接受的盐。6. 根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述共价蛋白结合基团选自马来酰亚胺、 卤代