专利名称：抑制Wnt信号传导途径的单克隆抗体及其制备方法和用途的制作方法
抑制Wnt信号传导途径的单克隆抗体及其制备方法和用途关于联邦政府资助的研究或开发的陈述本发明用美国国立卫生研究院授予的合同号EY019309下的政府支持来进行。政府具有本发明中的某些权利。
背景技术：
I.发明领域本文公开并要求保护的发明构思涉及单克隆抗体，并且更具体地，但不是通过限制的方式，涉及抑制fct信号传导途径的单克隆抗体及其使用方法。2.背景技术描述 异常或反常的新血管形成与许多疾病和病症相关，包括但不限于癌症、炎性疾病、黄斑变性和糖尿病性视网膜病变(DR)。Wnt信号传导途径在新血管形成以及包括视网膜血管发育和炎症过程在内的许多其他相关生物学过程中起着至关重要的作用。Wnt信号传导途径基因FriZZled-4(FZ4)或LRP5的突变导致家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)患者中视网膜血管发生的抑制，而Fz4敲除小鼠表现出不完整的视网膜血管形成。此外，在结肠癌和人内皮细胞中，作为Wnt信号传导的突变激活的结果，VEGF上调。VEGF是血管通透性和血管发生的有效介质，并且是建立的包括癌症和年龄相关性黄斑变性在内的许多血管发生相关疾病的治疗靶标。许多其他血管发生调节物也是fct靶基因，包括但不限于FGF18、内皮素-1、Cx43、uPAR、MMP7和 MMP3。在异常新血管形成相关疾病中，糖尿病性视网膜病变(DR)是很常见的糖尿病并发症和发达国家中四种常见的威胁视力的疾病状况(condition)之一。几乎100%患有I型糖尿病的患者和60%的II型糖尿病患者在他们的一生中会发展某些程度的视网膜病变。约10%的糖尿病患者在15年的糖尿病后发展严重的视觉障碍。DR是慢性和进行性病症，主要影响视网膜毛细血管。血-视网膜屏障的破坏是患有糖尿病的患者和链佐星(STZ)诱导的糖尿病动物模型中常见的病理变化。在DR的早期阶段中，视网膜血管通透性增加，但未出现临床视网膜病变。视网膜血管渗漏和视网膜的增厚导致糖尿病性黄斑水肿(DME)。在DR的晚期阶段中，毛细血管内皮细胞的过度增殖导致视网膜新血管形成(NV)，从视网膜和玻璃体中预先存在的毛细血管异常形成新血管。反过来，这导致增殖性糖尿病性视网膜病变(TOR)。异常血管发生最终可以引起严重的玻璃体腔出血和/或视网膜脱离，导致严重的视力丧失。据证实DR的发病机理涉及眼中的多种生长因子，例如但不限于VEGF、bFGF、IGF-I和PEDF。这些生长因子和它们的受体在糖尿病中的改变已在实验和临床研究中鉴定。升高的VEGF水平至少部分负责患有DR的患者中的视网膜血管渗漏、视网膜血管高通透性和视网膜NV。因此VEGF在DR的发展和发病机理中起重要作用。上调的视网膜VEGF及其受体的表达与OIR中的视网膜NV有关。据证实抑制VEGF和VEGF受体防止糖尿病和OIR动物模型中的视网膜NV。
越来越多的证据显示Wnt信号传导途径不仅介导炎症，即TNF- a、NF- k B易位和VEGF,而且还调节眼中的血管发生。研究证实Frizzled-4 (Fz4)和Lrp5/6均在成年小鼠视网膜脉管系统中表达。人中Fz4或LRP5基因的突变导致家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)患者中正常视网膜血管发生的抑制，并且Fz4敲除(fz4+)小鼠表现出不完整的视网膜血管形成。同时，据证实在VEGF-A的基因启动子中存在7个￠-联蛋白/TCF结合位点。在低氧条件下，HIF-I a与TCF-4竞争与P -联蛋白形成新复合物，代替HIF_1 a基因启动子区中的￠-联蛋白/TCF。此外，在结肠癌细胞和人内皮细胞中，作为Wnt/￠-联蛋白信号传导的突变激活的结果，VEGF上调。许多其他血管发生调节物先前已被报道为Wnt靶基因，包括但不限于FGF18、内皮素-I、Cx43、uPAR、MMP7和MMP3。因此Wnt可以通过诱导多种血管发生基因来调节血管发生。当Wnt配体结合至许多Frizz led蛇形受体家族及其共同受体LRP6或近亲如LRP5时，经典途径启动。当fct诱导的FZ-LRP6复合物形成时，LRP6会在其PPPS P基序磷酸化，然后能够以磷酸化依赖性方式结合轴蛋白至质膜，从而导致3 -联蛋白磷酸化和降解的抑制。LRP6在人疾病中至关重要。LRP6胞质域对于轴蛋白结合是必不可少的，并且其在LRP6 AC中的缺失导致结合Wnt但不能结合轴蛋白的显性负受体。LRP6胞外域具有自身抑制活性，因为其在LRP6 A N中的缺失导致在Wnt配体不存在的情况下结合轴蛋白的组成性激活受体。如本文中以上所述，视网膜NV是导致DR中视力丧失的主要病理特征。VEGF是公知的刺激DR中的视网膜NV形成的关键因子。因此，对用于抑制Wnt信号传导途径的新的和改进的组合物和方法存在巨大需要。这类组合物和方法可用于治疗和预防新血管形成相关和/或fct信号传导途径相关疾病，包括但不限于炎症、纤维化、血管发生和/或肿瘤发生。本文公开并要求保护的发明构思涉及所述组合物和方法，其克服现有技术的缺点和缺陷。
图I说明患有DR的人视网膜中激活的Wnt信号传导。将来自5个非DM供体和6个患有NPDR的糖尿病供体的视网膜切片用￠-联蛋白的抗体免疫染色。信号用二氨基联苯胺法显影(褐色)。来自2个非DM (A和B)和2个NPDR供体(C和D)的代表性视网膜图像显示与来自非DM对象的相比，来自DM-NPDR供体的内层视网膜中￠-联蛋白的信号更强，并且视网膜细胞核中的￠-联蛋白染色增加。比例尺=20i!m。Ej-联蛋白信号通过使用形态计量分析软件来定量并表示为任意单位(平均值土SD)。**P〈0.01。图2示出Akita小鼠、STZ诱导的糖尿病大鼠和OIR大鼠的视网膜中升高的￠-联蛋白水平。将来自16周龄Akita小鼠、STZ注射之后16周的STZ-DM大鼠、年龄为P16的OIR大鼠以及年龄匹配的非糖尿病或常氧对照的视网膜用于￠-联蛋白的蛋白印迹(A-C)和免疫组织化学(D-Q)分析。A-C :将来自每只动物的相同量(50iig)的视网膜蛋白用￠-联蛋白特异性的抗体印迹。将膜剥离并用￠-肌动蛋白的抗体重新印迹。每条泳道代表单独的动物。D-Q :将来自Akita小鼠(G-I)和它们的非糖尿病同窝仔畜(D-F)、STZ-DM大鼠(M-O)和非DM大鼠(J-L)、OIR大鼠(Q)和维持在恒定常氧下的年龄匹配的正常大鼠(P)的代表性视网膜切片用P -联蛋白的抗体染色。F、I、L和0 :将核用4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染(红色)并与P -联蛋白信号合并。红色箭头(I和O中)指示显示绿色和橙色的核，为糖尿病视网膜的核中增加的￠-联蛋白信号的结果，而白色箭头(F和L中)指向非糖尿病视网膜中的核(红色)。比例尺=20iim。图3说明STZ-糖尿病和OIR大鼠的视网膜中上调表达的LRP5/6。A和B :将来自3只糖尿病发病后16周的STZ诱导的糖尿病大鼠和年龄匹配的非糖尿病大鼠(A)，以及年龄为P16的4只OIR大鼠和正常大鼠⑶的相同量的视网膜蛋白(IOOyg)用于蛋白印迹分析，使用LRP5/6特异性的抗体(Santa Cruz Biotechnology)。将相同的膜剥离并用￠-肌动蛋白的抗体重新印迹。C-F:将来自STZ-糖尿病大鼠⑶和非DM对照(C)的视网膜切片，以及来自OIR大鼠(F)和它们的常氧对照(E)的视网膜切片用抗LRP5/6的抗体免疫染色(绿色)。将核用DAPI复染(红色)。原始放大，X 400。图4示出通过低氧和氧化应激诱导Wnt信号传导。A :将RCEC暴露于2%氧和常氧14小时。利用相同量(50iig)的来自每个样品的总蛋白通过蛋白印迹分析测定总￠-联蛋白水平，并且将其归一化至￠-肌动蛋白水平。注意印迹代表两个独立的实验。B-D:将 RCEC用低葡萄糖(LG ;5mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇，B)、高葡萄糖(HG, 30mmol/L葡萄糖，C)以及高葡萄糖加上IOii mol/L氨基胍(HG+AG，D)处理24小时。使用￠-联蛋白的抗体通过免疫细胞化学来显示￠-联蛋白的亚细胞分布。E :将相同量的来自上述各组的分离的核蛋白(50iig)用￠-联蛋白的抗体印迹并归一化至TATA框结合蛋白(TBP)水平。图5说明DKKl缓解视网膜炎症、血管渗漏和NV，并且抑制ROS产生。A :将各种剂量的纯化的DKKl注射入糖尿病发病之后16周的STZ-糖尿病大鼠的右眼的玻璃体，并且将相同量的BSA注射入对侧眼用于对照。通过酶联免疫吸附测定测量视网膜中可溶的ICAM-I浓度，通过总蛋白浓度将其归一化，并且表示为ng/mg蛋白(平均值土SD，n=3)。B :将纯化的DKKl注射入糖尿病发病之后16周的STZ-糖尿病大鼠的右眼的玻璃体(I. 2 ii g/眼)，并且将相同量的BSA注射入对侧眼用于对照。注射后48小时通过利用伊文思蓝作为示踪剂测量视网膜血管渗漏，通过总蛋白浓度将其归一化，并且表示为U g伊文思蓝/mg视网膜蛋白(平均值土SD，n=4)。C和D:在年龄P14，OIR大鼠接受玻璃体内注射的DKKl (I y g/眼)，注射入右眼，并且将相同量的BSA注射入对侧眼。在P16收获视网膜，将相同量的视网膜蛋白(20iig)上样用于通过利用C0X2(C)和VEGF(D)特异性的抗体进行蛋白印迹分析，并且通过￠-肌动蛋白水平归一化。E :在P14的OIR大鼠接受玻璃体内注射的所示剂量的DKKl0在P16通过利用伊文思蓝作为示踪剂测量视网膜血管渗漏，通过总蛋白浓度将其归一化，并且表示为Ug伊文思蓝/mg视网膜蛋白(平均值土SD，n=3)。*P〈0. 05。F-J :在年龄P14，OIR大鼠接受玻璃体内注射的2 ii g/眼DKK1，并且将BSA注射入对侧眼。在P18，在来自用BSA注射(F和G)和用DKKl注射(H和I)的眼的全封片视网膜上通过荧光素血管造影术将视网膜脉管系统可视化。原始放大X 12. 5 (F和H) ; XlOO (G和I)。J :在来自用BSA和DKKl注射的眼的眼横截面(cross ocular section)上计数视网膜前血管细胞(平均值土 SD，n=5)。图6说明Wnt途径有助于氧化应激和HIF-I激活。A_D =DKKl抑制HIF- a激活将原代RCEC暴露于5mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇(A)、30mmol/L葡萄糖(B)、TNF-a (C)、以及具有I ii g/ml DKKl的30mmol/L葡萄糖(D) 4小时。通过用抗HIF-Ia抗体利用免疫细胞化学测定HIF-I a核易位。比例尺=50 iim。E :在不存在或存在各种浓度的DKKl (6. 25-100nmol/L)的情况下，将RCEC暴露于低葡萄糖(5mmol/L葡萄糖加上25mmol/L甘露醇)或高葡萄糖(30mmol/L葡萄糖)、或者I y g/ml的TNF- a。氨基胍(AG ；10 u mol/L)用作阳性对照。测量胞内ROS产生并表示为荧光单位/孔(平均值土SD，n=3)。图7示出蛋白印迹分析，证实抗LRP6-lmAb完全抑制LRP6活性。将RCEC用抗LRP6-1预处理lOmin，然后引入包含20%Wnt3a的培养基并另外培养16小时。蛋白印迹分析显示以剂量依赖性方式抑制LRP6磷酸化，表明LRP6活性被阻断。图8说明抗LRP6-lmAb抑制Wnt信号传导途径激活。不用和用抗LRP6-1将RCEC细胞预处理10分钟，并且还使用不同浓度的Dkkl用于阳性对照。用抗LRP6-1或Dkkl预处理后，将RCEC分别分配至3个不同组，分别暴露于包含Wnt3a的培养基、低氧或高葡萄糖。左图蛋白印迹分析证实LRP6磷酸化被抑制。右图0-联蛋白的TOPflash分析显示抗LRP6-1基本上完全抑制P -联蛋白积累。 图9通过图表示出抗LRP6-1抑制内皮细胞的增殖。将RCEC接种于96-孔组织培养板中，将[14C]胸苷加入细胞并与不同浓度的抗LRP6-1或DKKl混合。然后将RCEC暴露于1%的023天，测定掺入细胞单层的放射性并计算最大信号的抑制百分比。图10通过图表示出抗LRP6-1减少VEGF过量表达。将RCEC用抗LRP6-1预处理IOmin,并且暴露于低氧24小时。利用ELISA测量培养基中的VEGF水平。抗LRP6-1显著减少暴露于低氧条件的内皮细胞中过量表达的VEGF。图11通过图表示出Dkkl和抗LRP6-1对高葡萄糖诱导的ROS产生的影响的比较。在各种浓度的DKKl (6. 25-100nM)和抗LRP6-1不存在或存在的情况下将RCEC暴露于30mM葡萄糖2h。利用CM-H2DCFDA测量胞内ROS产生，并且表示为荧光单位/孔(平均值土SD，n=3)。图12包含证实抗LRP6-1减弱糖尿病大鼠中的视网膜血管白细胞淤滞(Ieukostasis)的显微照片。糖尿病发病后2周的STZ糖尿病大鼠在处理组中接受玻璃体内注射的5 PM/眼的抗LRP6-1，并且在对照组中接受玻璃体内注射的相同剂量的对照小鼠IgG和Dkkl。注射后4周，进行视网膜血管白细胞淤滞。通过FITC缀合的伴刀豆球蛋白A将视网膜脉管系统和粘附的白细胞染色。A-D:非糖尿病大鼠(A)、用IgG的STZ诱导的糖尿病大鼠(B)、用Dkkl (C)和抗LRP6-1(D)注射的STZ诱导的糖尿病大鼠中的视网膜脉管系统和粘附的白细胞。图13说明抗LRP6-1对局部缺血诱导的视网膜血管渗漏和VEGF过量表达的影响。将抗LRP6-1玻璃体内注射(10 y g/眼)入P12的OIR大鼠。(A)在P16利用伊文思蓝法测量血管通透性，并且通过总视网膜蛋白浓度将其归一化(平均值土SD，n=4)。⑶将相同量的总视网膜蛋白(50 yg/大鼠)用VEGF的抗体免疫印迹，并且通过￠-肌动蛋白水平归一化。图14通过图表示出抗LRP6-1对AMD的影响。将抗LRP6-1玻璃体内注射(10 ii g/眼)入Vldlr+小鼠。用伊文思蓝法注射后2周测量视网膜血管通透性，并且通过总视网膜蛋白浓度将其归一化(平均值土 SD，n=4)。图15说明抗LRP6-1对LRP6胞外域的特异性。A :将HEK-293T细胞分别用表达LRP5-Flag和LRP6-Myc的质粒转染，用空载体转染作为对照。转染后48小时，将总细胞裂解物(50 u g)应用于蛋白印迹分析，使用抗LRP6-1和抗Flag抗体(M2)。B :抗LRP6-1识别不同物种中的内源性LRP6的能力。将来自每种细胞系总细胞裂解物(50iig)应用于蛋白印迹分析，使用抗LRP6-1。C :将包含LDLRN-Myc、LRP5N_Myc和LRP6N_Myc条件培养基，以及VLDLR-N-His、LRP6ElE2_His和LRP6E3E4_His的纯化的重组肽上样用于蛋白印迹，使用抗LRP6-1、抗His和抗Myc抗体。D :LRP6在视网膜冷冻切片中的免疫定位。FITC标记的抗LRP6-1用来测定LRP6的大鼠(D1-D6)和小鼠(D7-D12)的视网膜中的细胞定位。将非特异性小鼠IgG用FITC标记并用作阴性对照(Dl，D4, D7, DlO)。将切片用FITC-抗LRP6-1染色(D2，D5，D8，D11)。将用 10 y g/ml 纯化的 LRP6ElE2_His 抗原预吸附的 FITC-抗 LRP6-1用于染色以证实LRP6的免疫信号的特异性(D3，D6, D9, D12)。图16示出抗LRP6-1在受体-配体相互作用水平对Wnt信号传导的抑制效果。A =Wnt信号激活之前将70%汇合的hTERT-RPE细胞血清饥饿3hr。将每个孔用0、0. 5、5和50 u g/ml的抗LRP6-1预温育30min ;在每个孔中补充非特异性小鼠IgG以使总IgG浓度达到50 ii g/ yl。然后，将25%的Wnt3A条件培养基(Wnt3A)加入具有L细胞CM(L)作为对照的培养基。2hr刺激之后，使等量的细胞裂解物(50iig)进行蛋白印迹分析，使用磷酸化LRP6 (p-LRP6) (Serl490)和总LRP6的抗体。分离胞质蛋白(20 u g)并用胞质P -联蛋 白(cyto-P-ctnn)的抗体印迹。B :将hTERT-RPE细胞用T0PFLASH和对照pRL_TK质粒转染。将细胞暴露于具有各种浓度的抗LRP6-1的25%的WCM(Wnt3A) 16hr，然后利用双萤光素酶测定测量TCF/P-联蛋白活性并表示为相对萤光素酶单位(RLU)(平均值土SD，n=4,*P〈0. 05，#P〈0. 01)。C :将hTERT-RPE细胞用T0PFLASH载体和Wntl表达质粒转染。将没有插入的载体用作对照。在转染后4hr，将细胞用所示浓度的抗LRP6-1处理16hr，然后测量萤光素酶活性(平均值土 SD，n=4,fP<0.001)。D :将细胞暴露于25mM的LiCl以激活Wnt信号传导，用NaCl作为对照。将等量的非特异性IgG或抗LRP6-1 (50 u g/ml)加入细胞并温育16hr，并且测量萤光素酶活性(平均值土 SD，n=4，fP<0.0001，N. S :不统计显著)。图17说明抗LRP6-1对高葡萄糖诱导的经典Wnt信号传导的抑制效果。利用30mmol/L的D-葡萄糖(HG)将视网膜细胞暴露于高葡萄糖培养基，5mmol/L的D-葡萄糖和25mmol/L的甘露醇(M)用于渗透对照。A :将hTERT-RPE细胞暴露于HG不同的持续时间。将总细胞裂解物用来测量P-LRP6、总LRP6和P -联蛋白的水平。B :将hTERT-RPE细胞暴露于高葡萄糖6hr，有不同浓度的抗LRP6-1。将总细胞裂解物用于蛋白印迹分析以测量P-LRP6和总LRP6 ;将胞质部分用于测量胞质￠-联蛋白(Cyto-0-ctnn)。将来自4个独立蛋白印迹分析的胞质3-联蛋白水平通过光密度测定法定量，并且通过3-肌动蛋白水平归一化(平均值土SD，n=4，*P〈0. 05/i*P<0.001)。C :将hTERT-RPE细胞暴露于高葡萄糖24hr，有50ii g/ml抗LRP6-1或IgG，然后利用细胞周期蛋白Dl和c-myc特异性的抗体进行蛋白印迹分析。D&E :用抗LRP6-1预温育Ihr后将Muller细胞系(rMC_l)⑶和原代BRCEC(E)暴露于HG 6hr。使胞质部分(20 y g)进行胞质P _联蛋白和磷酸化￠-联蛋白(Ser33/37/Thr41)的蛋白印迹分析。图18说明抗LRP6-1对高葡萄糖诱导的血管发生和炎症因子的过量表达的抑制效果。抗LRP6-1预温育Ihr之后，将hTERT-RPEs⑷、rMC_l⑶和BRCEC (C)暴露于30mmol/L的D-葡萄糖(HG) 24hr (A&C)和48hr⑶，用5mM葡萄糖和25mM甘露醇(M)作为对照。利用ICAM-I、TNF-a和VEGF的特异性抗体进行蛋白印迹分析。示出来自至少3个独立实验的代表性印迹。通过光密度测定法定量水平，并且通过3-肌动蛋白水平将其归一化(平均值土SD，n=3, *P〈0. 05,fP<0.0014P<().00()l) 0图19说明抗LRP6-1对内皮细胞迁移的抑制效果。A :划痕损伤模型中的内皮细胞迁移。将平板接种在明胶包被的平板上的BRCEC划痕并暴露于高葡萄糖48hr，有20 y g/ml抗LRP6-1或非特异性IgG。示出划痕区域的代表性图像。B :拍摄每个平板的3个不同区域的图片，并且利用ImageJ (NIH)测量没有迁移细胞的表面积用于定量。高葡萄糖增加BRCEC的迁移率。与非特异性IgG相比，抗LRP6-1显著抑制BRCEC的迁移(平均值土SD，n=3， 卜P<0.001，*P〈0. 05)。C :管腔形成^fMatrigel在冰上解冻并均匀地铺在24孔板上，然后在37° C下温育30min。将BRCEC (2. 5X IO4)接种在每个孔中，并且补充PBS以及作为阴性对照的20 u g/ml非特异性IgG和20 u g/ml的抗LRP6-1。使BRCEC生长12hr至形成管腔，并且将来自每个孔的5个视野拍照。D :通过计数视野中的分枝数量来进行管腔形成的定量。与非特异性IgG相比，抗LRP6-1显著抑制BRCEC的管腔形成(平均值土SD，n=3，TP<0.001)o
图20说明抗LRP6-1对OIR模型中的血管渗漏和炎症的抑制效果。A:在年龄P12，OIR大鼠接受玻璃体内注射的IOiig抗LRP6-1/眼，并且将相同量的非特异性IgG玻璃体内注射至对侧眼。在P16利用伊文思蓝作为示踪剂测量视网膜血管通透性，通过总视网膜蛋白浓度将其归一化，并且表示为Ug伊文思蓝/mg视网膜蛋白(平均值土SD，n=8,P<0. 001) o虚线表示年龄匹配的正常动物中的血管通透性的基础水平。B:在P16将视网膜收获，将相同量的视网膜蛋白(50iig)上样用于蛋白印迹分析，使用LRP6、￠-联蛋白、ICAM-1、VEGF和TNF-a特异性的抗体，并且通过P -肌动蛋白水平归一化(平均值土SD，n=3, *P〈0. 05,fP<0.001) 0图21说明抗LRP6-1对STZ诱导的糖尿病大鼠中的视网膜血管渗漏和炎症的抑制效果。糖尿病发病后2周的STZ诱导的糖尿病大鼠接受玻璃体内注射的抗LRP6-1 (20 u g)或者作为对照的相同量的非特异性IgG。A :在抗体注射后I周利用伊文思蓝作为示踪剂测量视网膜血管通透性，并且通过总视网膜蛋白浓度将其归一化(平均值土SD，n=6,P=O. 00667)。B :通过彻底灌注去除循环白细胞后，在非糖尿病大鼠、用IgG或抗LRP6-1处理的糖尿病大鼠中将粘附的白细胞用FITC-伴刀豆球蛋白-A染色。然后将视网膜平铺，并且在荧光显微镜下使粘附的白细胞可视。代表性图像在(B)中示出。在糖尿病大鼠视网膜和用IgG注射的糖尿病大鼠视网膜中观察到粘附至视网膜脉管系统的多个白细胞，但在抗LRP6-1处理的糖尿病大鼠中较少。在每个视网膜的4个随机视野中计数粘附的白细胞(平均值土SD，n=5，:i；P<a0001)。C :玻璃体内注射后2周，从非糖尿病(non-DM)、糖尿病(DM)、以及用IgG(DM-IgG)或抗LRP6-1 (DM-2F1)处理的糖尿病大鼠组解剖视网膜。将相同量的视网膜蛋白上样用于蛋白印迹分析以测量LRP6、ICAM-I和TNF-a的表达水平(平均值土 SD，n=3, *P〈0. 05，**P〈0. 01，十PO.001)。图22说明在低氧下通过抗LRP6-1抑制ICAMl和CTGF表达。在各种浓度的抗LRP6-1的存在下将ARPE19细胞暴露于200 y M的CoCl224hr。非特异性IgG (50 u g/ml)用作对照。将等量的总细胞裂解物上样用于蛋白印迹分析以测量ICAM-I和CTGF的表达水平，并且通过￠-肌动蛋白水平归一化。图23说明抗LRP6-1降低患有激光诱导的CNV的眼杯中的@ -联蛋白水平。大鼠接受激光凝固，然后玻璃体内注射20 y g/眼抗LRP6-1或非特异性大鼠IgG。在注射后第7天，解剖视网膜-脉络膜复合物，并且通过蛋白印迹分析测量￠-联蛋白水平。将相同量的来自正常眼和患有CNV但未注射的眼的蛋白印迹用于比较。通过光密度测定法定量总联蛋白水平并归一化至￠-肌动蛋白水平(平均值土SD，n=6)。CNV表现出上调的联蛋白水平，这被CNV模型中的抗LRP6-1降低。每条泳道代表单独的大鼠。*P〈0.05。图24说明抗LRP6-1减少激光诱导的CNV中4级病变的数量。在激光凝固后14天进行荧光素血管造影术。捕捉眼底图像。(A)没有荧光素血管造影术的眼底图像；(B-D)有荧光素血管造影术的代表性眼底图像。(E)计数并比较4级病变(平均值土SD，n=10)*P〈0. 01。图25说明抗LRP6-1减少CNV区域。在大鼠中通过激光凝固诱导CNV。在激光的同一天将抗LRP6-l(20i!g/眼)注射入玻璃体，用相同量的大鼠IgG作为对照。注射后2周，用荧光素血管造影术使CNV可视。(A-C)没有处理(A)、有对照IgG(B)和有抗LRP6-1 (C)的CNV中的RPE-脉络膜平铺片中的CNV病变的代表性显微图像。(D)测量并比较CNV区域(平均值土 SD，n=20)。*P〈0. 05。 发明详沭在通过示例性图片、实验、结果和实验室方法的方式详细解释本文公开并要求包含的发明构思的至少一个实施方案之前，应当理解所述发明构思的应用并不限于以下说明中所示或者图片、实验和/或结果中说明的构建细节和组件的排列。所述发明构思能够有其他实施方案，或者以各种方式实施或进行。因此，本文所用的语言意图给出最广的可能的范围和含义；并且实施方案应该是示例性的-不是详尽的。而且，应当理解本文采用的用语和术语是为了描述的目的，而并不应当认为是限制性的。除非本文中另有定义，连同本文公开并要求保护的发明构思使用的科学和技术术语应当具有本领域技术人员通常理解的意思。而且，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。一般来说，本文所述的细胞和组织培养、分子细胞学、以及蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交所用的命名以及它们的技术是本领域公知和常用的。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或者如本领域通常完成的或者如本文所述来进行。前述技术和方法一般根据本领域公知的常规方法并如本说明书中引用和讨论的各种普通和更具体的参考文献所述来进行。参见例如，Sambrook etal. Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nded. , Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)和 Coligan et al. Current Protocols inImmunology (Current Protocols, WileyInterscience (1994)),其援引加入本文。本文所述的分析化学、合成有机化学、以及医学化学和药物化学所用的命名以及它们的实验室方法和技术是本领域公知和常用的。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备、配制和递送以及患者的治疗。说明书中提到的所有出版物和专利申请是本文公开并要求保护的发明构思相关的本领域技术人员的技术水平的指示。所有出版物和专利申请援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的出版物或专利申请援引加入本文相同。可以根据本公开制备和执行本文公开并要求保护的所有组合物和/或方法而无需过多实验。虽然本文公开并要求保护的发明构思的组合物和方法已根据优选实施方案来描述，但是本领域技术人员会清楚变化可以应用于所述组合物和/或方法以及步骤或本文所述方法的步骤的顺序而不背离本发明构思的构思、精神和范围。本领域技术人员显而易见的所有这类相似的取代和修改被视为在如所附权利要求定义的发明构思的精神、范围和构思内。如按照本公开所用，除非另有指明，以下术语应当理解为具有以下含义当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，使用单词“一个(a) ”或“一个(an)”可以表示“一个(one)”，但是其还与“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或超过一个”的含义一致。在权利要求中使用术语“或”用来表示“和/或”，除非明确表示仅指可选物或者可选物互相排斥，虽然本公开支持指仅可选物和“和/或”的定义。在整个申请中，术语“约”用来表示包括装置、用来确定值的方法的内在错误变化或者存在于研究对象之间的变化的值。术语“至少一个”的使用应当理解为包括一个以及超过一个的任何数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个等。术语“至少一个”可以延伸 至100个或1000个或更多，取决其连接的术语，此外，100/1000的数量并不认为是限制性的，因为更高的限制也可以产生令人满意的结果。术语“约”用来表示包括装置、用来确定值的方法的内在错误变化和/或存在于研究对象之间的变化的值。如本说明书和权利要求所用，单词“包含(comprising) ”(以及包含的任何形式，如“包含(comprise) ”和“包含(comprises) ”)、“具有(having)” (以及具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)” (以及包括的任何形式，如“包括(includes) ”和“包括(include)”)或“含有(containing) ”(以及含有的任何形式,如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性或开放性的，并且不排除额外的未列举的元件或方法步骤。如本文所用，术语“或其组合”指该术语之前所列的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下的至少一种4、8、(、483(、8(或48(，并且如果在特定上下文中顺序是重要的，还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。接续这个实例，明确包括包含一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员会理解除非从上下文显而易见，在任何组合中通常没有对项目或术语的数量的限制。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文中用来指氨基酸残基的多聚体。如本文所用，术语“多肽”是指天然蛋白、蛋白片段或多肽序列类似物的通用术语。因此，天然蛋白、蛋白片段和类似物是多肽属的物种。如本文所用，术语“分离的肽/多肽/蛋白”指cDNA、重组RNA或合成来源或者它们的一些组合的肽/多肽/蛋白，凭借其起源或衍生的来源，“分离的肽/多肽/蛋白”:⑴不与自然中发现的肽/多肽/蛋白相关，⑵不含来自相同来源的其他肽/多肽/蛋白，例如不含小鼠蛋白，⑶由来自不同物种的细胞表达，和/或⑷在自然中不存在。如本文所用，术语“氨基酸”涵盖天然或合成的所有分子，其包括氨基官能度和酸官能度，并且能够包括在天然存在的氨基酸的多聚体中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同属物(congener);具有不同侧链的氨基酸类似物；以及前述任一种的所有立体异构体。
术语“多核苷酸”和“核酸”可交换使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或者它们的类似物。以下是多核苷酸的非限制性实例基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析定义的基因座(locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖核酸酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰，那么对核苷酸结构的修饰可以在多聚体组装之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”可交换使用；认为核酸或多核苷酸是“分离的”，如果其(I)不与多核苷酸的全部或部分相关，其中所述“分离的多核苷酸”在自然中发现，⑵连接至多核苷酸，在自然中其并不连接至该多核苷酸，或者(3)在自然中不作为较大的序列的部分存在。如本文所用，术语“载体”是指能够转运其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型为“质粒”，其指圆形双链DNA环，可以将其他DNA片段连接至其中。载体的另一类型为病毒载体，其中可以将其他DNA片段连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的 宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。如本文所用，术语“天然存在”在用于物体时指物体可以在自然中发现这一事实。例如，存在于可以分离自自然来源的生物(包括病毒)中并且尚未被人在实验室或其他地方有意修改的多核苷酸或多肽序列是天然存在的。术语“天然存在”在本文中可以与术语“天然”可交换地使用。本文中提到的术语“选择性杂交”表示可检测地和特异性地结合。编码本发明构思的肽/多肽/蛋白的多核苷酸、寡核苷酸及其片段选择性地在最小化可检测地结合至非特异性核酸的可察觉的量的杂交和洗涤条件下杂交至核酸链。高严格性条件可以用来实现如本领域已知和本文讨论的选择性杂交条件。一般来说，本发明构思的多核苷酸、寡核苷酸及其片段与所关注的核酸序列之间的核酸序列同源性为至少80%，并且更典型地具有至少85%、90%、95%、99%和100%的增加的同源性。如果两个氨基酸序列之间有部分或完全相同性，那么这两个氨基酸序列是同源的。例如，85%同源性表示当将两个序列比对最大匹配时，85%的氨基酸是相同的。在最大化匹配中允许缺口(在匹配的两个序列的任一个中)；优选缺口长度为5或更少，更优选2或更少。可选地和优选地，如这个术语在本文中所用，如果利用程序ALIGN两个蛋白序列具有超过5(以标准差单位计)的比对得分，所述程序ALIGN具有突变数据矩阵以及6或更大的缺口罚分，那么这两个蛋白序列(或者来源于它们的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)是同源的。参见Dayhoff M. 0. , in Atlas ofProtein Sequence and Structure, pp.101-110 (第 5 卷，National Biomedical ResearchFoundation (1972))以及这卷的补充2, pp. I-IO0如果当利用ALIGN程序最佳比对时两个序列或其部分的氨基酸大于或等于50%相同，那么这两个序列或其部分更优选是同源的。术语“对应于”在本文中用来表示多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即，相同，不严格地进化上相关)，或者多肽序列与参考多肽序列相同。与此不同，术语“互补”在本文中用来表示与参考多核苷酸序列的全部或部分同源的互补序列。为了说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”，并且与参考序列“GTATA”互补。以下术语用来描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系“参考序列”、“比较窗口”、“序列相同性”、“序列相同性百分比”和“实质上的相同性”。“参考序列”是用作序列比较的基础的定义的序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如，作为序列列表中给出的全长cDNA或基因序列的片段，或者可以包含完整cDNA或基因序列。一般来说，参考序列长度为至少18个核苷酸或6个氨基酸,长度经常为至少24个核苷酸或8个氨基酸，并且长度常为48个核苷酸或16个氨基酸。因为两个多核苷酸或氨基酸序列可以各自(I)包含在这两个分子之间相似的序列(即，完整多核苷酸或氨基酸的部分)，以及(2)可以还包含在这两个多核苷酸或氨基酸序列之间不同的序列，两个(或更多个)分子之间的序列比较通常通过在“比较窗口”中比较这两个分子的序列来进行，以便鉴定和比较局部区域的序列相似性。如本文所用，“比较窗口”指至少18个连续的核苷酸位置或6个氨基酸的概念片段，其中可以将多核苷酸序列或氨基酸序列与至少18个连续核苷酸或6个氨基酸的参考序列比较，并且其中为了这两个序列的最佳比对而与参考序列(不含 添加或缺失)比较时，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含20%或更少的添加、缺 失、取代等(8卩，缺口)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman(Adv. AppI. Math. , 2:482 (1981))的局部同源性算法、通过 Needleman 和 Wunsch (J. Mol.Biol. , 48:443 (1970))的同源性比对算法、通过 Pearson 和 Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci.(U. S. A.), 85:2444(1988))的搜索相似性方法、通过这些算法的计算机实现(WisconsinGenetics Software Package Release 7. 0 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, (GeneticsComputer Group, 575Science Dr. , Madison, ffis. )、Geneworks 或 MacVector 软件包、或者通过检查来进行，并且选择各种方法产生的最佳比对(即，在比较窗口中导致最高的同源性百分比)。术语“序列相同性”表示两个多核苷酸或氨基酸在比较窗口中是相同的(即，在逐个核苷酸或逐个残基的基础上)。术语“序列相同性百分比”是这样计算的，在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中存在相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即，窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列相同性百分比。如本文所用，术语“基本相同性”表示多核苷酸或氨基酸的特征，其中在至少18个核苷酸出个氨基酸)位置的比较窗口中，经常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口中与参考序列相比时，所述多核苷酸或氨基酸包含具有至少85%序列相同性，例如至少90-95%序列相同性，或者至少99%序列相同性的序列，其中序列相同性百分比通过比较所述参考序列与所述序列来计算，所述序列在比较窗口中可以包括总计所述参考序列的20%或更少的缺失或添加。所述参考序列可以是较大序列的子集。如本文所用，20个常规氨基酸和它们的缩写按照常规用法。参见Immunology—A Synthesis(2nd Edition,E.S. Golub and D. R. Gren,Eds. , SinauerAssociates, Sunderland, Mass. (1991)),其援引加入本文。20个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸如a-，a-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常规氨基酸也可以是本文公开并要求保护的发明构思的多肽的合适的组分。非常规氨基酸的实例包括4-羟脯氨酸、a -羧基谷氨酸、e -N，N，N-三甲基赖氨酸、e -N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、a -N-甲基精氨酸以及其他相似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽标记法中，按照标准用法和常规，左边方向为氨基端方向，而右边方向为羧基端方向。当应用于多肽时，术语“基本相同性”表示当例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口权重最佳比对时,两个肽序列享有至少80%序列相同性，例如至少90%序列相同性，或者至少95%序列相同性，或者至少99%序列相同性。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守氨基酸取代。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有包含硫的侧链的氨基酸组为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨 酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。术语参考多肽的“变体”指相对于所述参考多肽具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的多肽。氨基酸取代可以是“保守的”或“非保守的”。“保守”氨基酸取代指用具有相似特性(例如但不限于大小和电荷)的另一氨基酸取代多肽中的氨基酸。保守替代是发生在侧链相关的氨基酸家族内的替代。遗传编码的氨基酸一般分为以下家族(I)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更具体的家族为丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺为包含酰胺的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族家族；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香家族。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸单独替代亮氨酸、用谷氨酸单独替代天冬氨酸、用丝氨酸单独替代苏氨酸或者用结构上相关的氨基酸相似替代氨基酸不会对所得分子的结合或特性具有重大影响，特别是如果替代不包括框架位点内的氨基酸。氨基酸改变是否导致功能肽可以通过测定多肽衍生物的特定活性容易地确定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以由本领域技术人员容易地制备。片段或类似物的优选氨基端和羧基端存在于功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库来鉴定。优选地，计算机比较方法用来鉴定存在于已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象。鉴定折叠为已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的(Bowieet al.，Science, 253:164 (1991))。因此,前述实例证实本领域技术人员可以识别序列基序和结构构象，这可以用来按照本文公开并要求保护的发明构思定义结构和功能结构域。优选氨基酸取代是这些，其(I)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(5)赋予或修改这类类似物的其他物理化学或功能特性。类似物可以包括除天然存在的肽序列之外的序列的各种突变。例如，可以在天然存在的序列中(优选在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当基本上改变亲本序列的结构特征(例如，替代氨基酸不应当倾向于打破存在于亲本序列中的螺旋，或者破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。本领域认可的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed. , ff. H. Freemanand Company, New York(1984));Introductionto Protein Structure (Branden andJ. Tooze, eds. , Garland Publishing, NewYork, N. Y. (1991));和 Thornton et al. (Nature354:105 (1991))，它们各自援引加入本文。如本文所用，术语“多肽片段”指具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽，但是其中剩余的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置相同。多肽片段可以是小于参考多肽的长度的任何长度。术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性。因此，术语“抗体”或“抗体肽”指全长免疫球蛋白分子(即，完整抗体)，或者与完整抗体竞争特异性抗原结合的其结合片段。结合片段可以通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来制备。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、 Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体、NANOBOD丨ESk以及保留至少部分的完整抗体可变区的其他抗体片段。参见例如，Hudson etal. (NatureMed. ,9:129-134(2003)) o如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”指保留结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合片段”内涵盖的结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、SCFv、二硫键连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、NANOBODIES 、分离的⑶冊3以及保留至少部分的完整抗体可变区的其他抗体片段。利用常规重组和/或酶促技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式对其筛选抗原结合。术语“⑶R”及其复数“⑶Rs”指抗体或抗体片段的互补性决定区域(⑶R)，其决定抗体或抗体片段的结合特征。在大多数情况下，3个CDR存在于轻链可变区中(CDRL1、CDRL2和⑶RL3)，并且3个⑶R存在于重链可变区中(⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3)。⑶R有助于抗体分子的功能活性，并且被包含支架区或框架区的氨基酸序列隔开。在各种CDR中，CDR3序列，特别是CDRH3是最多样的，并且因此对抗体特异性具有最强贡献。有至少两种技术用于确定⑶R : (I)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat et al. , Sequences of Proteinsof Immunological Interest (National Instituteof Health,Bethesda, Md. (1987),其整体援引加入本文)；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Chothia etal.，Nature, 342:877 (1989)，其整体援引加入本文)。术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。在某些实施方案中，表位是被抗体特异性结合的抗原区域。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基团如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在某些实施方案中，表位可以具有特定三维结构特征(例如，“构象表位”)以及特定电荷特征。如果特定抗体特异性结合至两个表位，那么表位定义为与另一表位“相同”。在某些实施方案中，具有不同一级氨基酸序列的多肽可以包含相同的表位。在某些实施方案中，相同的表位可以具有不同的一级氨基酸序列。如果不同抗体竞争特异性结合至相同表位，那么则说不同抗体结合至相同表位。
当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优先识别抗原时，抗体“特异性结合”该抗原。在某些实施方案中，抗体包含特异性结合至特定表位的抗原结合位点。在某些这样的实施方案中，抗体能够结合不同抗原，只要所述不同抗原包含该特定表位或密切相关的表位。在某些情况下，例如，来自不同物种的同源蛋白可以包含相同表位。在某些实施方案中，抗体以不大于10_6M、10_7M、10_8M或10_9M的解离常数特异性结合至抗原。当抗体特异性结合至受体或配体(即反受体)时，所述抗体可以基本上抑制所述受体粘附至所述配体。如本文所用，当过量抗体将结合至配体的受体的量减少至少约20%、40%、60%或80%、85%或90%时(如体外竞争结合测定所测量的)，抗体基本上抑制受体粘附至配体。“分离的”抗体是已从制备它的环境组分分离和/或回收的抗体。其制备环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方案中，如通过至少3种不同方法可测量的，将抗体纯化1)如 通过Lowry方法测定的，至抗体的大于50重量％,例如超过75重量％,或者超过85重量％,或者超过95重量％，或者超过99重量％ ；2)至足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少10个残基的程度，例如序列的至少15个残基；或者3)至同质性，通过在还原或非还原条件下SDS-PAGE，利用考马斯蓝或优选银染。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为制备抗体的环境的至少一种组分不存在。然而，通常分离的抗体通过至少一个纯化步骤来制备。此外，“分离的抗体”基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。然而，分离的抗体可以具有一些与其他相关抗原的交叉反应性。术语“抗体突变体”指抗体的氨基酸序列变体，其中一个或多个氨基酸残基已修改。这类突变体必需与氨基酸序列具有少于100%序列相同性或相似性，所述氨基酸序列与抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75%氨基酸序列相同性或相似性，例如至少80%，或者至少85%，或者至少90%，或者至少95%。如本文所用，术语“单克隆抗体”指获得自特异性结合至相同表位的基本上同质的抗体群体的抗体，即包含该群体的各抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的有利之处在于在制备的一种方法中，它们可以通过杂交瘤培养来合成，并且因此不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，在一实施方案中，按照本文公开并要求保护的发明构思制备的单克隆抗体可以通过由Kohler和Mi I stein (Nature, 256:495 (1975))首先描述的杂交瘤方法来制备。按照本文公开并要求包含的发明构思利用的单克隆抗体可以通过本领域抑制的任何方法来制备，包括但不限于有意(deliberate)免疫方案的结果；导致在疾病或癌症的过程中自然产生抗体的免疫应答的结果；噬菌体来源的抗体等。除了上文所列的杂交瘤制备方法，本文公开并要求保护的发明构思的单克隆抗体可以通过其他各种方法制备，例如但不限于重组DNA方法(参见例如，美国专利第4，816，567号)；从噬菌体展示文库分离抗体片段(参见例如，Clackson et al.，Nature, 352:624-628 (1991);和 Marks et al. , J.Mol. Biol., 222:581-597(1991));以及各种其他单克隆抗体制备技术(参见例如，Harlowand Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory,ColdSpring Harbor, N. Y.))。一旦已获得抗体，例如一旦已鉴定单独的B细胞和/或已制备单克隆抗体，可以获得编码这些抗体的可变区的序列。可变区序列可以例如通过首先测序杂交瘤、B-细胞或噬菌体产生的抗体蛋白并确定编码核酸序列来获得。在一实施方案中，作为代替，可以将免疫球蛋白可变区(VH和VL)DNA或cDNA测序。当抗体来源于杂交瘤细胞系或分离的B-细胞时，编码可变区的cDNA可以通过例如Babcook等人(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93:7843-7848 (1996))和PCT公开第WO 92/02551号所述的方法利用PCR来扩增。这两个参考文献的内容明确地整体援引加入本文。“嵌合”抗体指由来自至少两种不同来源的组分组成的抗体。在某些实施方案中，嵌合抗体包含来源于第一物种的抗体部分，其融合至另一分子，例如来源于第二物种的抗体部分。在某些这样的实施方案中，嵌合抗体包含来源于非人动物的抗体部分，其融合至来 源于人的抗体部分。在某些这样的实施方案中，嵌合抗体包含来源于一种动物的抗体可变区的全部或部分，其融合至来源于第二动物的抗体部分。例如但不是通过限制的方式，嵌合抗体可以包含来源于非人动物的抗体可变区的全部或部分，其融合至来源于人的抗体恒定区。利用本文公开并要求保护的发明构思的单克隆抗体可能要求将其施用给对象，例如但不限于人。然而，当所述单克隆抗体在非人动物如啮齿动物中制备时，将这类抗体施用给人患者通常会引发免疫应答，其中所述免疫应答针对所述抗体的序列。这类反应限制这样的治疗的持续时间和有效性。为了克服这样的问题，本文公开并要求保护的发明构思的单克隆抗体是“人源化的”，即将所述抗体工程化，从而将其一个或多个抗原部分去除并因此用人抗体的相似部分取代，而保留所述抗体对期望表位的亲和力。这种工程化可以仅包括几个氨基酸，或者可以包括抗体的整个框架区，仅留下抗体的互补性决定区域保持完整。人源化抗体的几种方法是本领域已知的，并且公开于2001年I月30日授予Queen等人的美国专利第6，180, 370号;2000年4月25日授予Brickell的美国专利第6，054，927号；1999年2月9日授予Studnicka的美国专利第5，869，619号；1999年I月19日授予Lin的美国专利第5，861，155号；1998年I月27日授予Rodriquez等人的美国专利第5,712, 120号；以及1989年3月28日授予Cabilly等人的美国专利第4，816，567号，它们的说明书全部明确地整体援引加入本文。如上文所提到的，“人源化”抗体指已修饰的非人抗体，从而其更紧密匹配(在氨基酸序列上)人抗体。因此人源化抗体是嵌合抗体的一种类型。如上文所述，抗体主要通过位于重链和轻链互补性决定区域(⑶R)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为了这个原因，CDR内的氨基酸序列在不同抗体之间比CDR外的序列更多样。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体来表达模拟特异性的天然存在的抗体的特性的重组抗体，其中将来自天然存在的抗体的CDR序列移植入来自具有不同特性的不同抗体的框架序列，例如人抗体框架区。这类框架序列可以获得自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或出版的参考文献。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在〃VBase〃人种系序列数据库(在互联网上于www. mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 可获得)以及 Kabat, E. A. , etal. (1991) Sequences of Proteinsof Immunological Interest,Fifh Edition, U. S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242;Tomlinson, I. M. , et al. (1992)"The Repertoireof Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segmentswith DifferentHypervariable Loops^J.Mol.Biol. 227:776-798;和 Cox,J.P.L.etal. (1994)〃A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias intheirUsage〃Eur. J. Immunol. 24:827-836中找到；它们每个的内容明确地援引加入本文。抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或者抗体的其它抗原结合子序列)，其主要包含人免疫球蛋白的序列，并且含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化可以按照Winter和同事(Jones etal. , 1986; Riechmann et al. , 1988; Verhoeyen et al. , 1988)的方法通过用卩齿齿动物 CDR或⑶R序列取代人抗体的相应序列来进行。(还参见美国专利第5，225，539号。)在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基代替。人源化抗体还可以包含这样的残基，其在受体抗体或者引入的CDR或构架序列中均未发现。一般来说，人源化抗体包含·基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最优选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al. , 1986; Riechmann et al. , 1988; and Presta, 1992)。现有技术充满出版的关于人源化抗体的制备或用途的文章。许多这些研究教导可以用于本文公开并要求保护的发明构思的方案的可用实例，例如但不限于 Sandborn et al. ,Gatroenterology,120:1330 (2001) ;Mihara et al.,Clin.Immunol.,98:319(2001) ;Yenari et al. ,Neuro I. Res.,23:72 (2001) ;Moraleset al. , Nucl. Med. Biol. , 27: 199 (2000) ;Richards et al. , CancerRes. , 59:2096(1999);Yenari et al. , Exp. Neurol. , 153:223 (1998);和 Shinkura etal. , Anticancer Res. , 18:1217 (1998),全部明确地整体援引加入本文。然而,应当理解本文公开并要求保护的发明构思并不限于上文所述的处理方案，并且本领域技术人员已知的其他处理方案可以用于本文公开并要求保护的发明构思的方法。本文公开并要求保护的发明构思还包括全人单克隆抗体的用途。全人抗体主要涉及这样的抗体分子，其中包括CDR在内的轻链和重链的整个序列均从人基因产生。这类抗体在本文中称为“人抗体”或“全人抗体”。“人抗体”包括人抗体序列，并且不含来自非人动物的抗体序列。在某些实施方案中，人抗体还可以包含在天然抗体中未发现的合成序列。该术语并不受制备抗体的方式的限制。人单克隆抗体可以通过三体瘤(trioma)技术；人B-细胞杂交瘤技术(参见Kozbor et al. , Hybridoma, 2:7 (1983))以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole et al.，PNAS，82:859(1985))来制备。人单克隆抗体可以用于实施本文公开并要求保护的发明构思，并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote et al.PNAS，80:2026 (1983))或者通过在体外用埃巴病毒转化人B-细胞(参见Cole et al.，1985)来制备。此外，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物如小鼠来制备，其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。当攻击时，观察到人抗体产生，其在所有方面与人中看到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体谱。例如但不是通过限制的方式，这种方法描述于美国专利号 5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ；5,661,016，以及 Marks et al. , J Biol. Chem. , 267:16007 (1992) ; Lonberg et al. , Nature, 368:856(1994);Morrison, 1994;Fishwild et al. , Nature Biotechnol.,14:845(1996);Neuberger, Nat. BiotechnoI.,14:826 (1996);和 Lonberg and Huszar, IntRevImmunoI. , 13:65(1995)。人抗体可以利用转基因非人动物另外制备，所述转基因非人动物已被修饰以便对抗原攻击应答，产生全人抗体而不是动物的内源性抗体。(参见PCT公开第WO 94/02602号)。已使非人宿主中编码重和轻免疫球蛋白链的内源性基因丧失能力，并且已将编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入宿主基因组。例如，利用包含必需的人DNA片段的酵母人工染色体掺入人基因。然后通过杂交育种包含少于修饰的全部组分的中间转基因动物来获得作为子代的提供所有期望的修饰的动物。这样的非人动物的一实施方案为小鼠，并且如PCT公开第WO 96/33735号和第WO 96/34096号所公开的称为XEN0M0USE 。这种动物产生分泌全人免疫球蛋白的B细胞。用所关注的免疫原免疫之后可以直接从动物获得抗体，例如作为多克隆抗体制品，或者可选地从来源于动物的永生化B细胞如产生单克隆 抗体的杂交瘤获得抗体。此外，可以将编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因回收并表达以直接获得抗体，或者可以将其进一步修饰以获得抗体的类似物，例如单链Fv分子。产生缺少内源性免疫球蛋白重链表达的非人宿主如小鼠的方法的实例公开于1999年8月17日授予Kucherlapati等人的美国专利第5，939，598号，并且援引加入本文。其可以通过这样的方法获得，所述方法包括从胚胎干细胞中的至少一个内源性重链基因座缺失J片段基因以防止基因座的重排和防止重排的免疫球蛋白重链基因座的转录物的形成，缺失通过包含编码选择标记的基因的靶向载体进行；以及从胚胎干细胞产生转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞包含编码所述选择标记的基因。用于制备所关注的抗体如人抗体的方法公开于1999年6月29日授予Hori等人的美国专利第5，916，771号，并且援引加入本文。其包括将包含编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养中的一种哺乳动物宿主细胞，将包含编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入另一种哺乳动物宿主细胞，并且融合这两种细胞以形成杂交细胞。所述杂交细胞表达包含所述重链和所述轻链的抗体。术语“中和抗体”或“中和的抗体”指这样的抗体，其减少包含所述抗体特异性结合的表位的多肽的至少一种活性。在某些实施方案中，中和抗体在体外和/或体内减少活性。术语“抗原结合位点”指能够特异性结合抗原的抗体部分。在某些实施方案中，抗原结合位点由一个或多个抗体可变区提供。如本文所用，“基本上纯”表示对象种类是存在的优势种类(S卩，在摩尔基础上，在组合物中其比任何其他单独的种类更丰富)。一般来说，基本上纯的组合物会包含超过约50%的所有大分子种类存在于该组合物中，例如超过约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和99%。在一实施方案中，将对象种类纯化至基本同质性(污染种类在组合物中通过常规检测方法不可以检测)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。术语“物质”指化合物、化合物的组合物、生物大分子或从生物材料制备的提取物。在某些实施方案中，“物质”可以是本文公开并要求保护的发明构思的单克隆抗体。术语“拮抗剂”指减少蛋白/酶的活性的物质。术语“激动剂”指增加蛋白/酶的活性的物质。
术语“患者”包括人和兽医对象。在某些实施方案中，患者为哺乳动物。在某些其他实施方案中，所述患者为人。“治疗(Treatment)”指治疗性处理以及预防性或防范性措施。需要治疗的那些包括但不限于已患有特定疾病状况或病症的对象以及有风险获得特定疾病状况或病症的对象(例如，需要预防性/防范性措施的那些)。术语“治疗(treating) ”指为了治疗和/或预防/方法目的向患者施用物质。“治疗剂”指可以体内施用以带来治疗和/或预防/防范效果的物质。“治疗抗体”指可以体内施用以带来治疗和/或预防/防范效果的抗体。“病症”是会受益于用多肽治疗的任何疾病状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易于患有考虑的病症的那些病理状况。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理状况，通常其特征在于无节制的细胞生长。实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)以及各种类型的头部和颈部癌症。为了治疗的目的，“哺乳动物”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物、非人灵长类以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。术语“有效量”指生物活性分子或缀合物或者其衍生物的量，当以本文公开并要求保护的发明构思的方式使用时，足以表现出可检测的疗效而没有过多的有害副作用(如毒性、刺激性和变态反应)，与合理的益处/风险比相当。疗效可以包括，例如但不是通过限制的方式，抑制和/或中和LRP6的至少一种活性。患者的有效量取决于患者的类型、患者的大小和健康、待治疗的疾病状况的性质和严重程度、施用方法、治疗持续时间、同时疗法(如果有的话)的性质、采用的具体制剂等。因此，不可能提前指定确切的有效量。然而，给定情况的有效量可以由本领域技术人员利用基于本文提供的信息的常规实验来确定。如本文所用，术语“同时疗法”与术语“联合疗法”和“辅助疗法”可交换使用，并且理解为表示对需要治疗的患者治疗或施用疾病/病症的另一种药物联合本文公开并要求保护的发明构思的组合物。这种同时疗法可以是顺序疗法，其中将患者首先用一种药物然后用另一种治疗，或者将这两种药物被同时给予。术语“药学可接受”指化合物和组合物，其适合施用给人和/或动物而没有过多的有害副作用如毒性、刺激性和/或变态反应，与合理的益处/风险比相当。“生物活性”表示修改生物的生理系统的能力。分子可以通过其自身的功能性发挥生物活性，或者可以基于其激活或抑制具有它们自身的生物活性的分子的能力来发挥生物活性。本文公开并要求保护的发明构思的组合物可以通过本领域已知的任何方法施用给患者，包括但不限于口服、体表、透皮、肠胃外、皮下、鼻内、肌肉内、腹腔内、玻璃体内和静脉内途径，包括局部和全身施用。此外，本文公开并要求保护的发明构思的化合物可以设计为利用本领域公知的制剂技术提供延迟释放、控释或缓释。如本文所用，术语“Wnt”或复数“Wnts”理解为指分泌的富含半胱氨酸的糖蛋白组，其结合至frizzled (Fz)受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6(LRP5/6)的共同受体复合物，并且通过称为fct途径的细胞内信号传导途径调节许多靶基因的表达。在人中，Wnt 包括 WNTl、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B.WNT9A以及WNT9B。在Wnt配体不存在的情况下，经典Wnt途径的下游效应物P -联蛋白被包含糖原合酶激酶-3 0 (GSK-3 ^ )的蛋白复合物磷酸化。磷酸化的￠-联蛋白不断降解以防止其积累。当某些fct结合至FZ-LRP5/6共同受体时，抑制￠-联蛋白的磷酸化，这防止￠-联蛋白的降解并导致其积累。然后￠-联蛋白易位至核，在那里其与DNA结合的T细胞因子关联，并且因此调节包括但不限于VEGF的靶基因的表达。术语“LRP”理解为指“低密度脂蛋白受体相关蛋白”。人LRP6如SEQID NO: I所示。已知LRP5/6在Wnt/P -联蛋白信号传导中起至关重要的作用。当与Wnt配体结合时，LRP6与Fz受体二聚化，这是激活fct途径的第一和必不可少的步骤。LRP6的胞质域具有多个模块化磷酸化位点，并且LRP6的磷酸化是激活经典Wnt途径的必要事件，因为LRP6的磷酸化促进支架蛋白轴蛋白的募集，并且因此激活经典fct途径。
本文所述的单克隆抗体的特征部分在于抗体的功能和/或结构特征。本文公开并要求保护的发明构思涉及特异性结合LRP6蛋白的分离的单克隆抗体(或其抗原结合片段)，以及包含所述分离的单克隆抗体(或其抗原结合片段)的组合物。在一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合人LRP6蛋白；在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合SEQ ID NO: I的氨基酸序列中的表位。在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合LRP6的胞外域；在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合SEQ IDNO: 2的氨基酸序列中的表位。在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合LRP6的配体结合结构域。在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合LRP6的第一和第二 ￠-螺旋桨区(E1E2结构域)中的至少一个中的表位。在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合LRP6的E2结构域的至少部分中的表位；在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合SEQID NO:3的氨基酸序列中的表位。评价所述抗体的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹和RIA，并且合适的测定描述于实施例。所述抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)还可以通过本领域已知的标准测定来评价，例如通过Biacore分析。在一些实施方案中，本文所述的抗体以低于或等于IO-6MUO-7MUO-8M或KT9M的解离常数结合至SEQ ID NO: I、SEQIDN0:2和/或SEQ ID NO:3。在一实施方案中，所述抗体以低于或等于约KT7M的解离常数结合至LRP6胞外域。本文公开并要求保护的发明构思还涉及杂交瘤HLS2F1，ATCC保藏号PTA-10663，以及包含杂交瘤HLS2F1的组合物。所述杂交瘤根据BudapestTreaty的条款于2010年2月18日保藏于美国典型培养物保藏中心专利存放处(10801UniversityBoulevard, Manassas, VA 20110-2209)。保藏的材料的公开可用性的所有限制在授权涉及所述mAb的专利时不可改变地去除，并且保藏物会维持30年或在最近的请求后维持5年(以较迟者为准)。本文公开并要求保护的发明构思还涉及所述杂交瘤产生的分离的单克隆抗体。所述保藏的杂交瘤产生的mAb为小鼠IgG2抗体，并且此后称为抗LRP6-1。此外，本文公开并要求保护的发明构思还涉及杂交瘤HLS2F1的细胞，ATCC保藏号PTA-10663，以及包含所述细胞的组合物。
本文公开并要求保护的发明构思还涉及结合至与上文所述任何单克隆抗体相同的表位的分离的单克隆抗体(或其抗原结合片段)，以及包含所述分离的单克隆抗体(或其抗原结合片段)的组合物。在一实施方案中，所述mAb结合至与抗LRP6-1相同的表位。在另一实施方案中，所述mAb结合至与杂交瘤HLS2F1，ATCC保藏号PTA-10663产生的抗体相同的表位。这类抗体可以基于它们在标准LRP6胞外域结合测定中与抗LRP6-1交叉竞争的能力来鉴定。测试抗体抑制抗LRP6-1结合至LRP6胞外域的能力证实所述测试抗体可以与抗LRP6-1竞争结合至LRP6胞外域，并且因此结合至与抗LRP6-1相同的LRP6胞外域上的表位。本文公开并要求保护的发明构思还涉及分离的单克隆抗体以及包含所述分离的单克隆抗体的组合物，所述分离的单克隆抗体特异性结合至与SEQ ID NO: 1-3中的任一个至少80%相同的序列，包括与SEQ ID NO: 1-3中的任一个至少85%相同的序列，与SEQ IDNO: 1-3中的任一个至少90%相同的序列，以及与SEQ ID NO: 1-3中的任一个至少95%相同的序列。此外，本文公开并要求保护的发明构思还涉及分离的单克隆抗体，其具有与如上文详述的保藏于ATCC的杂交瘤所产生的单克隆抗体的氨基酸序列至少80%相同(例如至少85%相同、90%相同或95%相同)的氨基酸序列。抗LRP6-1 (如上文详述的保藏的杂交瘤所产生的mAb，还可交换地称为“mAb2Fl ”)包含由SEQ ID NO:4的核苷酸序列编码并具有如SEQ IDN0:5所示的氨基酸序列的重链可变结构域。抗LRP6-1还包含由SEQ IDN0:6的核苷酸序列编码并具有如SEQ ID N0:7所示的氨基酸序列的轻链可变结构域。重链包含3个互补性区(⑶R)，命名为⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3。轻链也包含3个⑶R，命名为⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3。⑶R的氨基酸序列以及编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如表I所示。表I
权利要求
1.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含 具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的轻链可变区⑶R3 ； 具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重链可变区⑶R3 ;并且 其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合至LRP6胞外域内的表位，其中所述LRP6胞外域具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
2.权利要求I所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其还包含 具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的轻链可变区⑶Rl ； 具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的轻链可变区⑶R2 ； 具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的重链可变区⑶Rl ;以及 具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链可变区⑶R2。
3.权利要求I所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有 与SEQ ID NO: 5至少90%相同的重链可变区氨基酸序列；以及 与SEQ ID NO: 7至少90%相同的轻链可变区氨基酸序列。
4.权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自全长免疫球蛋白分子、scFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、以及其组合。
5.权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
6.权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以低于或等于约10_7M的解离常数结合至所述LRP6胞外域。
7.权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与具有ATCC保藏号PTA-10663的杂交瘤所产生的抗体结合相同的表位。
8.权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制Wntl和Wnt3a对LRP6的结合。
9.药物组合物，其包含权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。
10.权利要求9所述的组合物，其还包含与所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有协同效应的第二物质。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述第二物质为抗血管生成剂。
12.权利要求10所述的组合物，其中所述第二物质为抗VEGF试剂。
13.具有ATCC保藏号PTA-10663的杂交瘤。
14.分离的单克隆抗体，其由权利要求13所述的细胞产生。
15.分离的核酸分子，其编码具有SEQID NO: 13的⑶R3的重链可变区。
16.权利要求15所述的核酸分子，其中所述重链可变区具有SEQIDNO:9的⑶Rl和SEQID NO:11 的 CDR2。
17.分离的核酸分子，其编码具有SEQID NO: 19的⑶R3的轻链可变区。
18.权利要求17所述的核酸分子，其中所述轻链可变区具有SEQIDNO: 15的⑶Rl和SEQ ID NO:17 的 CDR2。
19.载体,其包含权利要求15所述的核酸。
20.宿主细胞，其包含权利要求15所述的核酸分子。
21.权利要求20所述的宿主细胞，其还包含编码具有SEQID NO: 19的⑶R3的轻链可变区的核酸分子。
22.载体，其包含权利要求17所述的核酸。
23.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含 具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区⑶Rl ； 具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链可变区⑶R2 ;以及 具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重链可变区⑶R3 ； 其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合至具有SEQ ID顯:2的氨基酸序列的1^ 6胞外域。
24.权利要求23所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为NANOBODY'
25.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含 具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的轻链可变区⑶Rl ； 具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的轻链可变区⑶R2 ;以及 具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的轻链可变区⑶R3 ； 其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合至具有SEQ ID顯:2的氨基酸序列的1^ 6胞外域。
26.制备单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤 提供产生权利要求1-8、14和23-25中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的细胞；以及 在允许产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述细胞。
27.权利要求26所述的方法，其中所述细胞进一步定义为具有ATCC保藏号PTA-10663的杂交瘤。
28.对Wnt信号传导途径的激活进行抑制的方法，所述方法包括施用权利要求1-8、14和23-25中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
29.权利要求28所述的方法，其还包括施用与所述单克隆抗体具有协同效应的第二物质的步骤。
30.权利要求29所述的方法，其中所述第二物质为抗血管生成剂。
31.权利要求29所述的方法，其中所述第二物质为抗VEGF试剂。
32.抑制糖尿病性视网膜病变(DR)的至少一种血管生成、炎症和致纤维化因子的酶活性和/或酶产生的方法，所述方法包括向患有或易于患有DR的对象施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含权利要求1-8、14和23-25中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。
33.权利要求32所述的方法，其中所述DR的因子选自VEGF、ICAM-UTNF-a和CTGF。
34.权利要求32所述的方法，其还包括向所述对象施用第二物质的步骤，其中所述第二物质与所述单克隆抗体具有协同效应。
35.权利要求34所述的方法，其中所述第二物质为抗血管生成剂。
36.权利要求34所述的方法，其中所述第二物质为抗VEGF试剂。
37.权利要求32所述的方法，其中所述施用步骤进一步定义为将所述组合物注射入所述对象的眼的玻璃体。
38.调解/减弱至少一种视网膜疾病状况的方法，所述视网膜疾病状况选自视网膜白细胞淤滞、炎症、血管渗漏、纤维化、异常新血管形成以及视网膜中的癌发生，所述方法包括向患有或易于患有所述至少一种视网膜疾病状况的对象施用权利要求1-8、14和23-25中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学可接受的载体的步骤。
39.权利要求38所述的方法，其还包括向所述对象施用第二物质的步骤，其中所述第二物质与所述单克隆抗体具有协同效应。
40.权利要求39所述的方法，其中所述第二物质为抗血管生成剂。
41.权利要求39所述的方法，其中所述第二物质为抗VEGF试剂。
42.权利要求38所述的方法，其中所述施用步骤进一步定义为将所述组合物注射入所述对象的眼的玻璃体。
43.权利要求38所述的方法，其中异常新血管形成进一步定义为视网膜新血管形成和脉络膜新血管形成中的至少一种。
44.抑制和/或减少至少一种疾病状况的发生和/或严重程度的方法，所述疾病状况选自糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、黄斑变性、癌症以及眼的其他炎症和新生血管病症，所述方法包括向患有或易于患有所述至少一种疾病状况的对象施用药物组合物的步骤，其中所述药物组合物抑制fct信号传导途径的激活，由此抑制和/或减少所述至少一种疾病状况的发生和/或严重程度，并且其中所述药物组合物包含权利要求1-8、14和23-25中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。
45.权利要求44所述的方法，其还包括向所述对象施用第二物质的步骤，其中所述第二物质与所述单克隆抗体具有协同效应。
46.权利要求45所述的方法，其中所述第二物质为抗血管生成剂。
47.权利要求45所述的方法，其中所述第二物质为抗VEGF试剂。
48.权利要求44所述的方法，其中所述施用步骤进一步定义为将所述组合物注射入所述对象的眼的玻璃体。
全文摘要
本发明公开抗LRP6并阻断Wnt信号传导途径的单克隆抗体。本发明还公开其制备和使用方法。
文档编号C07K16/18GK102985441SQ201180019858
公开日2013年3月20日 申请日期2011年2月18日 优先权日2010年2月19日
发明者J-X·马, K·李, Y·陈 申请人:俄克拉何马大学董事会