专利名称：单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物纯化领域，具体涉及磺达肝癸钠的柱层析纯化领域。
背景技术：
磺达肝癸钠(Fondaparinux sodium)是戍聚糖钠最小重复片段的五糖物质，它是一种活化凝血因子X a的特异性抑制剂，主要用于血栓栓塞疾病防治，它的应用在很大程度上解决了抗凝药物一直以来困扰医师的两难问题——在抗凝强度和出血风险中找到ー个平衡支点。磺达肝癸钠由人工合成，一般合成方法都需要经历50个以上步骤，因此最后的粗品中杂质含量复杂，且磺达肝癸钠有效含量较低(一般为60-80%)，经过ー步提取到高纯度(98%以上)较困难。离子交换层析介质是生物分子分离纯化中最常用的方法之一，广泛应用于抗生素、核酸、多肽、蛋白质、以及天然产物的分离纯化。其主要由三部分组成，第一部分是骨架结构，即载体；第二部分是固定在母体结构上的带电功能基团；第三部分是与功能基团带相反电荷的离子对。与传统的离子交换树脂相比，用于生物大分子分离的离子交换层析介质除了具备高的离子密度、具有一定的耐压、耐酸碱性能外，还要求母体结构足够亲水以消除其与生物分子的非特异性吸附，并且要具备均匀的粒径。目前用于生物大分子分离的介质大多数不具备所有的以上特点，在实际应用中具有缺陷。J. Hradil 等(Reactive Polymers, 1990，13，43-53)分别使用甲基丙烯酸环氧丙酷/こニ醇ニ甲基丙烯酸酯共聚物(GMA/EDMA)和甲基丙烯酸羟こ酷/こニ醇ニ甲基丙烯酸酯共聚物(HEMA/EDMA)为基质，合成粒径分别为250-400 μ m和100-200 μ m强阴离子交换树脂，相比聚苯こ烯/ ニこ烯基苯基质，该方法后续修饰使用的试剂对环境的危害较小；但是，其合成的树脂颗粒较大，不均匀，很难做到高分辨率分离，而且，该基质虽然较为亲水，但应用在生物分子分离上，其亲水性还无法满足要求，限制了其在生物分离上的应用。Hongdeng Qiu 等(Journal of Chromatography A, 2006, 1103，265 - 270)使用硅胶为基质键合上了含强阴基团的硅烷偶联剂，合成的强阴型离子交换层析介质用于小分子的分离纯化。该介质具备很好的机械强度，对混合物的分离效果较好，但是硅胶基质的离子交换层析介质不耐碱性，在很大程度上限制了它的应用范围。美国专利20050020536公开了ー种以琼脂糖为基质的Q Sepharose Fast Flow (GEHealthcare)分离纯化磺达肝癸钠的方法，该方法以氯化钠水溶液为流动相，得到99%的纯 度。但是该方法使用的介质为琼脂糖骨架，其在不同流速下柱体积会发生变化，而且相对聚丙烯酸酯基质，其在较高压力条件下会发生变形，这限制了其在高流速分离中的应用。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种能达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速的层析介质。为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用，采用单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。优选的，用所述单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质作为色谱柱的固定相，将含磺达肝癸钠的样品上样于该色谱柱上，用盐的水溶液作为流动相洗脱吸附在固定相上的磺达肝癸钠。优选的，所述盐的水溶液是NaCl的水溶液。优选的，所述单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质是由苏州纳微生物科技有 限公司生产，产品型号为Uni Q-50S。将单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质Uni Q-50S作为填料转入色谱柱成为固定相，把含有待分离或分析含磺达肝癸钠的溶液流过该色谱柱，然后用盐的水溶液作为流动相流过色谱柱，洗脱吸附在固定相Uni Q-50S上的待分离或分析的含磺达肝癸钠溶液。本发明的有益效果是单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质Uni Q-50S不但利于以水溶液做流动相分离纯化磺达肝癸钠粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速，同时可使用低盐浓度将吸附在层析柱上的磺达肝癸钠洗脱下来。
图I是实施例I中使用的苏州纳微生物科技有限公司单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质Uni Q-50S扫描电镜照片。图2是实施例3、实施例4中使用的填料Uni Q-50S (苏州纳微生物科技有限公司)和 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)的压力-压カ曲线。图3是实施例I中提纯前的磺达肝癸钠粗品的HPLC分析图谱。图4是实施例I中提纯后的磺达肝癸钠的HPLC分析图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。实施例1，
磺达肝癸钠的纯化
采用26 X 310mm玻璃色谱柱，Uni Q-50S (苏州纳微生物科技有限公司生产)为层析填料装填层析柱，装柱体积164. 5mL，先用I. 5个柱体积(CV)的2M NaCl活化色谱柱，然后用
2.OCV超纯水以10mL/min的流速平衡色谱柱。磺达肝癸钠粗品(纯度70%)用超纯水溶解，粗品浓度4mg/mL，上样体积250mL。上样后，先用超纯水冲洗2. 0BV,然后用O. 3M NaCl洗脱3. 5BV以除去杂质，再用O. 44M NaCl洗脱井分管收集洗脱液，最后I. OM NaCl洗脱到无紫外吸收。收集液经检测，得到色谱纯度99%以上的回收率约30%，色谱纯度在97%以上的回收率约60%。实施例2，
磺达肝癸钠的纯化
米用 26X310mm 玻璃色谱柱，Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare,粒径范围45-165微米)为层析填料装填层析柱，装柱体积164. 5mL，先用I. 5个柱体积(CV)的2MNaCl活化色谱柱，然后用2. OCV超纯水以10mL/min的流速平衡色谱柱。磺达肝癸钠粗品(纯度70%)用超纯水溶解，粗品浓度4mg/mL，上样体积250mL。上样后，先用超纯水冲洗2. OBV,然后用O. 36M NaCl洗脱5BV以除去杂质，再用O. 6M NaCl洗脱井分管收集洗脱液，最后I. OMNaCl洗脱到无紫外吸收。收集液经检测，得到色谱纯度99%以上的回收率约28%，色谱纯度在97%以上的回收率约55%。实施例3，
填料耐压性能测试
采用10 X 220mm玻璃色谱柱，Uni Q-50S (苏州纳微生物科技有限公司)为层析填料，装柱完毕后用3CV超纯水以lmL/min流速平衡色谱柱并測定色谱柱反压，以此流速开始，逐渐增加流速，每升高lmL/min流速測定色谱柱反压，做成流速-压カ曲线图，如图3所示。实施例4，
填料耐压性能测试
米用 10X220mm 玻璃色谱柱，Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare,粒径范围45-165微米)为层析填料，装柱完毕后用3CV超纯水以lmL/min流速平衡色谱柱并測定色谱柱反压，以此流速开始，逐渐增加流速，姆升高lmL/min流速测定色谱柱反压,做成流速-压カ曲线图，如图3所示。将实施例一、三和实施例ニ、四性能进行对比，对比结果见表I。表I介质Uni Q-50S和介质Q Sepharose Fast Flow结果比较表
权利要求
1.单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用，其特征在于，采用单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。
2.如权利要求I所述的单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用，其特征在于，用所述单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质作为色谱柱的固定相，将含磺达肝癸钠的样品上样于该色谱柱上，用盐的水溶液作为流动相洗脱吸附在固定相上的磺达肝癸钠。
3.如权利要求2所述的单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用，其特征在于，所述盐的水溶液是NaCl的水溶液。
全文摘要
本发明公开了单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用，采用单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。本发明不但利于以水溶液做流动相分离纯化磺达肝癸钠粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速，同时可使用低盐浓度将吸附在层析柱上的磺达肝癸钠洗脱下来。
文档编号C07H1/06GK102659859SQ20121010357
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者吴俊成, 林生跃, 江必旺, 肖书霞, 陈荣姬 申请人:苏州纳微生物科技有限公司