专利名称：抗人mCRP蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞系和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种抗人mCRP蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞系和试剂盒。
背景技术：
C-反应蛋白(CRP)有两种存在形式五聚体CRP (pCRP)和CRP异构体(monomeric CRP，mCRP)。pCRP由肝细胞分泌，作为炎症反应的一个重要标志，它还参与并加重了动脉粥样硬化形成、粥样斑块破裂及心肌梗死等炎症反应的过程。mCRP是由pCRP转变而来，这一转变过程出现在急性心梗、不稳定心绞痛等一些局部缺血缺氧导致的低PH和氧自由基富集或血小板活化等情况，具体过程如下细胞损伤或血小板活化后其局部胞膜内侧磷脂酰胆碱外翻暴露于细胞膜表面，pCRP随后与PC结合。在短时间内(<处)，结合的？0^迅速解聚形成mCRP,其空间构象发生改变,N端35 47位氨基酸(与公认的胆固醇结合序列一致)和C端199 206位氨基酸暴露形成新的抗原识别位点。研究发现，pCRP与细胞膜结合后经过空间构象改变形成mCRP是pCRP发挥生物学功能的先决条件，PCRP的致炎及致细胞损伤作用可能均来源于mCRP的形成。最近研究指出pCRP与活化的血小板膜表面结合后迅速转变为mCRP，mCRP的出现促进了血小板的进一步 聚集以及其与动脉内皮细胞的相互作用，加重了局部血管的炎症反应，加速了动脉粥样硬化斑块不稳定过程。研究还发现mCRP可以促进巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白，这对于动脉粥样硬化过程中泡沫细胞的形成极为关键。此外，mCRP还可以作用于中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞，促进IL-8，MCP-I及细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1以及E-选择素等的表达升高，进而加重局部细胞和组织的炎症状态。因此，mCRP不但可以作为炎症反应的标志，它也作为重要参与者参与了炎症反应过程及血小板的活化。在pCRP转变为mCRP过程中，mCRP分子C端199 206表位8个氨基酸暴露形成新的抗原识别位点是mCRP发挥生物学作用的重要靶点。该抗原识别表位只出现在mCRP 上，而在pCRP分子中它被包裹在分子结构内部不能被识别，因而，针对该抗原表位的单克隆抗体不但可以特异性识别mCRP，还可以为我们正确识别及区分mCRP和pCRP功能提供方便。因此，如果可以成功制备得到针对mCRP C端199 206氨基酸表位并且具有中和mCRP 不良生物学作用的功能性抗人mCRP单克隆抗体，不仅可以更好的研究mCRP的生物学功能及其具体致病机制，还可以为mCRP抗原检测试剂盒的开发和应用提供便利。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗人mCRP的单克隆抗体以及能产生所述抗体的杂交瘤细胞株，本单克隆抗体识别序列为mCRP的C末端199 206八肽氨基酸表位。它是一种具有中和功能的高亲和力功能性抗人mCRP单克隆抗体；可用于检测游离mCRP抗原水平定量及定性检测试剂盒的开发，并用于临床疾病诊断和病情预后判断。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是
一种杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)，该细胞系的保藏编号为CCTCC NO: C201243，其具有分泌抗人mCRP蛋白的单克隆抗体的能力。本发明的另一目的在于提供一种所述的杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines) 的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(I)合成人mCRP C末端199 206八肽，将人mCRP C末端199 206八肽分别与血蓝蛋白KHL及BSA偶联形成抗原肽，分别作为免疫原免疫BALB/c小鼠；(2)获取融合细胞生长克隆步骤从免疫合格小鼠无菌取其脾脏细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，利用常规的HAT筛选方法筛选，获取融合细胞生长克隆；(3)经常规ELISA或竞争ELISA或免疫印迹技术筛选和鉴定，获取杂交瘤细胞系。本发明的又一目的在于提供一种抗人mCRP蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)所分泌,其识别位点为mCRP 的C端199 206八肽的表位；所述mCRP的C端199 206八肽的氨基酸序列为Phe-Thr -Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro。
本发明的又一目的在于提供一种mCRP抗原检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含有效量的所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。本发明的又一目的在于提供一种所述的mCRP抗原检测试剂盒在检测mCRP抗原方面的应用。优选的，所述检测mCRP抗原包括定量检测和定性检测。优选的，所述检测mCRP抗原方法为酶联免疫吸附检测法。本发明的又一目的在于提供一种治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物，其特征在于所述药物包含药学上有效量的所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。本发明中抗人mCRP蛋白的单克隆抗体，其特征是它是由保藏号为CCTCC NO C201243的抗人mCRP单克隆抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞系，优选的是杂交瘤细胞株2C7所分泌，其识别位点为mCRP的C端199 206八肽氨基酸序列表位。本发明提供了该单克隆抗体在制备治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物中的应用。优选的，本发明还提供了该单克隆抗体在制备定量和定性mCRP抗原检测试剂盒及含有权利要求I所述的单克隆抗体在mCRP抗原检测中的应用。所述的抗人mCRP单克隆抗体制备的治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物，抗mCRP单克隆抗体具有中和mCRP不良生物学作用的功能。所述的抗mCRP单克隆抗体在制备mCRP抗原检测试剂盒及含有所述的单克隆抗体在定量和定性检测mCRP抗原的试剂盒中的应用，所述检测mCRP抗原方法为酶联免疫吸附检测法。分泌所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为CCTCC NO C201243的抗人 mCRP单克隆抗体的杂交瘤细胞系，优选的是杂交瘤细胞株2C7。本发明抗人C反应蛋白异构体(mCRP)单克隆抗体制备方法及其应用涉及生物医学领域，具体涉及一种能识别人mCRP的单克隆抗体的制备及其应用。本发明的杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤(I)合成人mCRP C末端199 206八肽氨基酸，与血蓝蛋白KHL及BSA偶联形成抗原肽作为免疫原免疫BALB/c小鼠；
(2)获取融合细胞生长克隆从免疫合格小鼠无菌取其脾脏细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，利用常规的HAT筛选方法筛选，获取融合细胞生长克隆；(3)应用常规及竞争ELISA以及免疫印迹技术筛选和鉴定，获取高分泌抗体的杂交瘤细胞株。BALB/c小鼠腹腔内接种上述高分泌抗体杂交瘤细胞株，收获小鼠腹水后分离纯化得到所需单克隆抗体。本发明得到的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系的保藏信息为保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址是湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心；保藏日期是 2012年4月20日；保藏号是CCTCC No :C201243。杂交瘤细胞系的分类命名为杂交瘤细胞株2C7。具体的可以是杂交瘤细胞株1D9，杂交瘤细胞株2C7或杂交瘤细胞株1D6都能满足分泌类似抗体的要求。本发明得到的所述抗人mCRP单克隆抗体可以定量和定性检测人mCRP抗原，方便研究与mCRP相升高关疾病如急性心梗、不稳定性心绞痛等诊断和预后的试剂盒。进一步的技术方案中，本发明提供一种能减轻mCRP所致心肌损伤，尤其是急性心梗心肌缺血时保护心肌细胞，减少心肌细胞凋亡及炎症程度的药物，所述药物的主要成分为上述抗人mCRP单克隆抗体。 由于上述技术方案的合理运用，相对于现有技术中的方案，本发明的优点是1)ELISA及Western blot分析表明，本发明所述单克隆抗体可以很好的识别人 mCRP抗原分子，并且与pCRP抗原无交叉反应。2)本发明所述单克隆抗体可以用于定量和定性检测人血循环中mCRP抗原，从而为临床研究与mCRP有关疾病如急性心梗、不稳定性心绞痛等诊断和预后提供依据。3)本发明所述单克隆抗体具有良好的生物学功能，可以中和mCRP所致的不良反应，抵抗mCRP所致心肌细胞凋亡，并可以减少mCRP升高所致炎性因子TNF- α的分泌，从而为临床急性心肌梗死及其他mCRP升高所致疾病的治疗提供手段。综上所述，本发明公开了一种抗人mCRP单克隆抗体的制备工艺，筛选能高特异性产生抗人mCRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明单克隆抗体经酶联免疫法筛选,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和免疫印迹分析等方法鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力等特性。本发明还提供了抗人mCRP单克隆抗体在检测心梗患者外周血液循环中mCRP抗原的应用实例，并评价了该抗体对mCRP所致心肌细胞凋亡的保护作用，证明该抗体可以作为一种保护性分子阻断mCRP升高所致的心肌细胞凋亡及炎症因子的分泌，从而避免心肌梗死时梗死范围的扩大。因此,本发明的抗人mCRP单克隆抗体可应用于人mCRP的抗原的多种检测方法中，也可应用于制备人mCRP检测试剂盒，它还可以作为中和抗体抵抗心肌缺血时mCRP所致的心肌细胞凋亡及炎性细胞因子的分泌。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图I为mCRP蛋白经SDS-PAGE后与抗mCRP杂交瘤细胞株2C7细胞上清反应 Western-Blot 结果。
图2为抗CRP单抗(可识别CRP及mCRP分子，左图)及2C7细胞株分泌单抗与 pCRP及mCRP的非变性低还原凝胶电泳SDS-PAGE后Western_blot结果，其中商品化抗pCRP 抗体可以识别mCRP和pCRP，而本发明制备的抗mCRP单克隆抗体只能识别mCRP分子，图中可见发明所述抗人mCRP单抗可以特异性识别mCRP而不识别pCRP分子。图3为2C7细胞株分泌抗mCRP单抗包被，检测心梗、感染致升高pCRP患者及正常健康对照组患者血浆mCRP水平；其中M、匪和C分别表示心梗组、非心梗CRP > 3mg/l患者组和健康志愿者，图中可见心梗组患者血浆mCRP水平显著高于对照组；图4为采用Tunnel法检测缺氧组(A)、缺氧+mCRP组(B)及缺氧+mCRP+mCRP单抗组(C)细胞凋亡情况。其中A、B和C分别表示单纯缺氧组、缺氧+mCRP组和缺氧+mCRP+抗 mCRP单抗组，蓝色为DAPI染细胞核，绿色为FITC标记断裂DNA反映细胞凋亡情况，图中可见mCRP可导致心肌细胞凋亡明显增加(B组)，而加入mCRP单抗后(C组)细胞凋亡明显减少；图5为缺氧组⑷、缺氧+mCRP组⑶及缺氧+mCRP+mCRP单抗组(C)心肌细胞分泌TNF- α及VEGF情 况；其中A和B分别表示为缺氧组、缺氧+mCRP组和缺氧+mCRP+抗 mCRP单抗组，图中可见mCRP可以促进细胞分泌TNF- α并抑制VEGF的分泌，而mCRP单抗则可以部分逆转这一现象。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例I免疫原准备与免疫(I)免疫原的制备采用化学合成方法合成mCRP的C端199 206氨基酸序列表位，为 Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro,肽段经 RP-HPLC 色谱纯化，纯度为 93. 5 %，然后分别与血蓝蛋白KHL及牛血清白蛋白BSA偶联,形成KHL-Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro 和BSA-Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro八肽复合物(由杭州中肽生化有限公司合成、 纯化并偶联)，色谱纯化，干燥。(2)动物免疫将上述合成KHL偶联肽采用PBS稀释为lmg/ml，按I : I加入弗氏完全佐剂混合，振荡乳化半小时，皮下按50 μ g/鼠免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以同样方法进行再次免疫；免疫共4次后，尾静脉采血检测免疫效果，融合前3天，取 50ug KLH-肽抗原尾静脉加强免疫，三天后融合。实施例2杂交瘤细胞的融合按常规方法进行杂交瘤细胞的融合。在融合前摘眼球法取阳性血备用。取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用PEG-2000融合。同时，分别从BALB/c免疫小鼠、提供饲养细胞的ICR小鼠采血，作为筛选单抗时对照用的阳性、阴性血清。融合后的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37°C，5% CO2培养箱内培养，5-7d换加新鲜HAT，经常观察，适时换液和检测。
实施例3杂交瘤细胞的检测(I)酶标板的包被在酶标板上，做方阵试验，即以合成的BSA-偶联肽段为抗原，横向用PBS倍比稀释包被ELISA板，以阳性血清为一抗，加入纵向以100倍、200倍、400倍、800倍稀释，根据反应结果选择包被浓度。酶标板的包被简述如下取纯化的BSA-抗原肽，以碳酸盐缓冲液，即 O. 2mol/L Na2C038mL,0. 2mol/L NaHC0317mL，加去离子水至 lOOmL，pH9. 6，稀释至包被浓度， 同时设阴性对照；以100 μ L/孔加入ELISA板中，37°C，3小时;PBST，即O. 01mol/L，ρΗ7· 3， PBS+0. 5% Tween-20，洗涤 3 次，5 分钟 / 次；加 PBS/FCS,即 O. 01mol/L，pH7. 3,PBS+10% FCS 或I % BSA, 200 μ L/孔，37°C封闭3小时或4°C过夜；PBST洗3次，5分钟/次，晾干，_20°C 或4 °C存放备用。(2)杂交瘤细胞的检测用上述包被的ELISA板，常规间接ELISA及竞争ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，在常规间接ELISA法中，以待检杂交瘤细胞上清和抗原肽反应的值，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，P/N ^ 2. I为阳性判定标准；在筛选的阳性判定细胞上清中采用竞争 ELISA法，即在细胞上清中加入IOng裸肽竞争孵育，采用竞争前后OD值比值> 2，且竞争后 OD值< O. 20为阳性判断标准。
根据所设定的判定标准，分别经过三次亚克隆后，经常规间接及竞争ELISA检测， 得到三株符合条件的杂交瘤细胞株仍保持了分泌抗人mCRP抗体的能力，分别命名为1D9， 2C7,1D6。结果显示，本研究制备杂交瘤细胞株有三株，分别为1D9，2C7和1D6符合研究设定要求。表I竞争ELISA结果
权利要求
1.一种杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)，该细胞系的保藏编号为CCTCC No:C201243，其具有分泌抗人mCRP蛋白的单克隆抗体的能力。
2.一种权利要求I所述的杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)的制备方法,其特征在于所述方法包括以下步骤 (1)合成人mCRPC末端199 206八肽，将人mCRP C末端199 206八肽分别与血蓝蛋白KHL及BSA偶联形成抗原肽，分别作为免疫原免疫BALB/c小鼠； (2)获取融合细胞生长克隆步骤从免疫合格小鼠无菌取其脾脏细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，利用常规的HAT筛选方法筛选，获取融合细胞生长克隆； (3)经常规ELISA或竞争ELISA或免疫印迹技术筛选和鉴定，获取杂交瘤细胞系。
3.一种抗人mCRP蛋白的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体由权利要求I所述的杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)所分泌，其识别位点为mCRP的C端199 206八肽的表位；所述mCRP的C端199 206八肽的氨基酸序列为Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro。
4.一种mCRP抗原检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含有效量的权利要求3所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。
5.一种权利要求4所述的mCRP抗原检测试剂盒在检测mCRP抗原方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测mCRP抗原包括定量检测和定性检测。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测mCRP抗原方法为酶联免疫吸附检测法。
8.一种治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物，其特征在于所述药物包含药学上有效量的权利要求3所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种抗人mCRP蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNOC201243的杂交瘤细胞系(Hybridomacelllines)所分泌，其识别位点为mCRP的C端199~206八肽的表位；所述mCRP的C端199~206八肽的氨基酸序列为Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro。该单克隆抗体经酶联免疫法筛选，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和免疫印迹分析等方法鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力等特性。
文档编号C07K16/18GK102703388SQ20121012026
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者卢新政, 吴鑫, 唐波, 杜攀, 王俊宏, 许迪, 郭妍 申请人:卢新政, 吴鑫, 唐波, 杜攀, 王俊宏, 许迪, 郭妍