抗人xcr1抗体的制作方法

抗人xcr1抗体的制作方法
【专利摘要】本发明的一个目的是提供一种结合至人XCR1的单克隆抗体，其中该抗体结合至包含选自下组的至少三个氨基酸的线性或非连续表位，该组由SEQ?ID?NO：91的氨基酸序列中的第8、第11、第12、第13、第14、第16、第17、第22、第23、第176、和第177个氨基酸组成。
【专利说明】抗人XCR1抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及与人XCRl结合的抗体。
【背景技术】
[0002]趋化因子是对白细胞趋化性和白细胞活化具有影响的碱性肝素结合蛋白的集合术语。基于各种趋化因子的一级结构的比较，根据保留性半胱氨酸残基的位置将趋化因子分类为CXC、CC、C、和CX3C亚家族。XCLl (也被称为淋巴细胞趋化因子(Ltn)或淋巴细胞趋化因子α (Ltn-α ))和XCL2 (也被称为淋巴细胞趋化因子β (Ltn-β ))是被分类为如上所述的亚家族C的趋化因子。XCRl (也被称为GPR5、SCM-1 α、或ATAC)是一种G蛋白偶联趋化因子受体，其特异性地结合至XCLl和CXL2。
[0003]已经在mRNA水平检测了 XCRl在各种人组织中的表达。报道了 XCRl在胎盘中的高表达，但是在胰脏和胸腺中的表达是低的(非专利文献I)。此外，CXRl主要在树突细胞中表达。CXRl在小鼠中尤其在⑶8 α +树突细胞中高表达(非专利文献2 ;和非专利文献3)。⑶8 a +树突细胞一般呈现在二级淋巴组织中，例如胰脏和淋巴结，并且已知进行“交叉呈递”，其在抗感染和对肿瘤细胞的免疫应答的反应中起重要作用。还已知XCRl在人CD141+树突细胞中高表达，这些树突细胞被认为是小鼠⑶8 α +树突细胞的同源物(非专利文献4)。
[0004]从细胞外部吸收到抗原呈递细胞中的抗原通常被降解为肽，呈现在II类主要组织相容性抗原(MHC II类)上，并且被CD4+T细胞识别。相反，存在着其中从细胞外部吸收的抗原通过不同于以上描述的常规路径的一条路径呈现在I类主要组织相容性抗原(MHCI类)的情况。这种抗原呈递过程被称为“交叉呈递”。在这个过程中，呈现在MHC I类上的抗原被CD8+T细胞识别，然后被分化为起防御和消除宿主中的肿瘤细胞作用的细胞毒性T细胞(CTL)(非专利文献5)。
[0005]各种免疫相关细胞的迁移发生在炎症反应过程中。具体地说，树突细胞迁移至局部炎症部位发生抗原吞噬。趋化因子和趋化因子受体在引起树突细胞的这种迁移中起重要作用。在迁移至局部炎症部位之后，这些树突细胞呈现针对T细胞的抗原，并且激活T细胞。随后，该信息从T细胞传输到更多的免疫相关细胞，从而扩大了免疫反应(非专利文献6)。
[0006]在抗原呈递细胞中，这些树突细胞具有特别优异的抗原呈递能力，并且在T细胞活化中起非常重要的作用。已经表明，由于T细胞涉及各种免疫性疾病，包括自身免疫性疾病的发展和恶化，控制树突细胞就是控制T细胞活化，这将会导致各种免疫性疾病的改善(非专利文献6 ;和非专利文献7)。
[0007]此外，已经显示来源于兔子的抗人XCRl多克隆抗体具有抑制正常口腔角质形成细胞和口腔癌细胞的XCL诱导的迁移的作用(非专利文献8)。
[0008]引用清单
[0009]非专利文献 [0010]非专利文献1:Yoshida T, Imai T, Kakizaki M, Nishimura M, Takagi S，Yoshie0.“Identification of Single C Motif-l/lymphotactin receptor XCRl (单个C基序-1/淋巴细胞趋化因子受体XCRl的鉴定)，”J.Biol.Chem.(生物化学杂志)273:16551-16554(1998)
[0011]非专利文献2:Crozat K，Guiton R，Contreras V, Feuillet V, Dutertre CA, VentreEj Vu Manh TPj Baranek T，Storset AKj Marvel Jj Boudinot P，Hosmalin A,Schwartz-CornilI，Dalod M “The XC chemokine receptorlis a conserved selective marker ofmammalian cells homologous to mouse CD8 a +dendritic cells (XC 趋化因子受体 I 是与小鼠CD8a +细胞同源的哺乳动物细胞的保守性选择标记)，”J Exp Med (实验医学杂志)，207:1283-1292(2010)
[0012]非专利文献3:Dorner BGj Dorner MB, Zhou X，Opitz C，Mora A, Guttler S，HutloffA，Mages HWj Ranke K，Schaefer M，Jack RS，Henn Vj Kroczek RA iiSelective expressionof the chemokine receptor XCRlon cross-presenting dendritic cells determinescooperation with CD8+T_cells (趋化因子受体XCRl在交叉呈递树突细胞上的选择性表达决定了与 CD8+T 细胞的合作)，” Immunity (免疫)，31:823-833 (2009)<
[0013]非专利文献4:Bachem A，Guttler S，Hartung E，Ebstein F，Schaefer Mj TannertA，Salama A,Movassaghi Kj Opitz C，Mages HWj Henn Vj Kloetzel PM，Gurka Sj KroczekRA， “Superior antigen cross-presentation and XCRlexpression define humanCDllc+CD141+cells as homologues of mouse CD8+dendritic cells (优越的抗原交叉呈递和XCRl表达将人⑶IIc+⑶141+细胞定义为小鼠⑶8+树突细胞的同源物)，”实验医学杂志，207:1273-1281 (2 010) <
[0014]非专利文献5:Kurts C，Robinson BWj Knolle PA，“Cross-priming in health anddisease (健康和疾病中的交叉引发)，’"Nat Rev Immunol (自然免疫学评论)，10:403-414 (2010) <
[0015]非专利文献6:Kurts C，Robinson BWj Knolle PA，“Cross-priming in healthand disease (健康和疾病中的交叉引发)，”自然免疫学评论，10:403-414(2010)
[0016]非专利文献7:Waldner H，“The role of innate immune response in autoimmunedisease development (天然免疫应答在自身免疫性疾病发展中的作用)，”Autoimmun, Rev (自身免疫评论)8:400-404 (2009)
[0017]非专利文献8:Khurram SA, Whawell SA, Bingle L, Murdoch C，McCabe BM, FarthingPM, “Functional expression of the chemokine receptor XCRlon oral epithelialcells (趋化因子受体XCRl在口腔上皮细胞上的功能性表达)，”J Pathol (病理学杂志)，221:153-63(2010)
[0018]发明概述
[0019]技术问题
[0020]使用疾病动物模型已经积累了很多关于树突细胞涉及在免疫性疾病的发展、恶化等等的知识。然而，目前对于很多免疫性疾病既没有有效的治疗方法也没有预防方法。此外，虽然已经知道抗人XCRl抗体具有抑制细胞迁移作用(Khurram SA1Whawell SA1BingleL,Murdoch C，McCabe BM, Farthing PM, “Functional expression of the chemokinereceptor XCRlon oral epithelial cells (趋化因子受体XCRl在口腔上皮细胞上的功能性表达)，”病理学杂志221:153-63 (2010)),因为这样一种抗体是来源于兔子的多克隆抗体，它不太可能直接作为一种临床适用的药品。另外，上述文献没有表明这样的抗体抑制树突细胞的细胞迁移，不可能还预测这样的抗体在治疗或预防免疫性疾病中是有效的。
[0021]本发明的一个目的是提供选择性地结合至人XCRl的单克隆抗体；优选地，选择性地结合至人XCRl并且抑制细胞迁移的单克隆抗体；进一步优选地，基于以上描述的作用，在治疗或预防免疫性疾病尤其是皮肤免疫性疾病中有效的抗体。
[0022]问题的解决方案
[0023]诸位本发明人进行了大量研究，试图解决以上问题。结果，他们开发了结合至人XCRl的抗体，并且发现这些抗体具有抑制细胞迁移的作用并且具有治疗或预防免疫性疾病例如皮肤免疫性疾病的显著作用，这与树突细胞的迁移相关。
[0024]在下文的本说明书中，以上描述的抗体有时简单地被称为“抗体”、“本发明的抗体”、或“抗人XCRl抗体”。
[0025]本发明的有益效果
[0026]本发明的抗体结合至人XCRl。本发明的抗体包括抑制人XCRl和人XCLl之间的结合的抗体。这样一种抗体具有作为添加至人XCRl-人XCLl结合抑制剂的活性成分的可能。
[0027]本发明的抗体还包括抑制细胞迁移尤其是树突细胞迁移的抗体。这样一种抗体具有作为添加至细胞迁移抑制剂尤其是树突细胞迁移抑制剂中的活性成分的可能。此外，本发明的抗体还包括特异性地识别BDCA3 (也被称为⑶141)阳性细胞的抗体。因此，包含本发明的抗体的药物组合物具有作为用于治疗与细胞迁移尤其是树突细胞迁移相关的免疫性疾病的治疗剂的可能。具体地说，该药物组合物具有可能作为一种治疗剂用于治疗皮肤免疫性疾病，例如迟发型超敏反应、银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免`疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、系统性硬皮病、妊娠期疱疹、线性IGA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、和荨麻疹。
[0028]除了这些皮肤免疫性疾病之外，本发明的抗体还具有可能作为治疗剂用于治疗免疫性疾病、例如I型糖尿病、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、甲状腺炎、移植物排斥、克罗恩病、类风湿性关节炎、炎性肠病、前葡萄膜炎、韦格纳肉芽肿病、或贝赫切特病。
[0029]附图简要说明
[0030]图1显示了小鼠抗人XCRl抗体(2H6、5G7、和11H2)对表达人XCR1-EGFP的B300.19细胞的反应性的FACS分析结果。
[0031]图2显示了小鼠抗人XCRl抗体(2H6、5G7、和11H2)对人淋巴细胞趋化因子诱导的表达人XCR1-EGFP的B300.19细胞的迁移的中和活性的趋化性试验的分析结果。
[0032]图3显示了人源化抗人XCRl抗体(HK1L2和HK5L5)对表达人XCR1-EGFP的B300.19细胞的反应性的FACS分析结果，与它们的亲本小鼠抗人XCRl抗体(5G7)及其嵌合抗体的反应性平行。
[0033]图4显示了小鼠抗人XCRl抗体(5G7)和人源化抗人XCRl抗体(HK1L2和HK5L5)对人BDCA3+树突细胞的反应性的FACS分析结果。
[0034]图5显示了人源化抗人XCRl抗体(HK1L2和HK5L5)对人淋巴细胞趋化因子诱导的表达人XCR1-EGFP的B300.19细胞的迁移的中和活性的趋化性试验的分析结果，与它们的亲本小鼠抗人XCRl抗体(5G7)及其嵌合抗体的中和活性平行。
[0035]图6显示了人源化抗人XCRl抗体(HK1L2和HK5L5)和嵌合抗体对人淋巴细胞趋化因子诱导的人BDCA3+树突细胞的迁移的中和活性的跨内皮迁移试验的分析结果，与同种型对照抗体平行(人IgG2，K)。
[0036]图7显示了本发明的抗体的重链⑶Rsl至3和轻链⑶Rsl至3的氨基酸序列的比较。 [0037]该图还显示了重链⑶Rsl至3和轻链⑶Rsl至3的普遍的氨基酸序列。
[0038]图8显示了本发明的小鼠抗人XCRl抗体(5G7)对迟发型接触性皮炎(DTH)的小鼠模型的药理效应。
[0039]图8A和SB分别显示了通过比较在本发明的小鼠抗人XCRl抗体(5G7)和对照抗体之间用DNFB诱导之后在24小时和48小时的耳肿胀的程度(mm)获得的结果。
[0040]图9显示了本发明的小鼠抗人XCRl抗体(5G7)对各种人趋化因子受体的结合专一性。在该图中，曲线图的横坐标轴显示了藻红蛋白(PE)的荧光强度。
[0041]图10显示了本发明的抗体结合的人XCRl的氨基酸序列。
[0042]图11显示了使用本发明的抗体的对于表达人XCRl的细胞的细胞毒性。
[0043]图12显示了本发明的小鼠抗人XCRl抗体(5G7)的细胞毒性T淋巴细胞试验结果的分析。
[0044]图13显示了本发明的小鼠抗人XCRl抗体(2H6、5G7、和11H2 )对嵌合人/小鼠XCRl表达细胞的反应性。
[0045]图14显示了通过肽ELISA的小鼠抗人XCRl抗体(2H6，和5G7)结合部位对人XCRl胞外结构域作图的结果的分析。
[0046]图15显示了通过使用丙氨酸突变体的抗人XCRl多克隆抗体结合部位对人XCRl胞外结构域作图的结果的分析。
[0047]图16显示了使用丙氨酸突变体的小鼠抗人XCRl抗体(2H6)结合部位对人XCRl胞外结构域作图的结果的分析。
[0048]图17显示了小鼠抗人XCRl抗体(5G7)结合部位对人XCRl胞外结构域作图的结果的分析。
[0049]图18显示了使用丙氨酸突变体的小鼠抗人XCRl抗体(11H2)结合部位对人EXRl胞外结构域作图的结果的分析。
[0050]图19显示了使用丙氨酸突变体的人源化抗人XCRl抗体(HK1L2)结合部位对人XCRl胞外结构域作图的结果的分析。
[0051]图20显示了使用丙氨酸突变体的人源化抗人XCRl抗体(HK5L5)结合部位对人XCRl胞外结构域作图的结果的分析。
[0052]图21显示了在结合至人XCRl表达细胞的小鼠抗人XCRl抗体(2H6、5G7、和11H2)之间竞争的结果的分析。
[0053]图22显示了小鼠抗人XCRl单克隆抗体(5G7)和商业山羊抗人XCRl多克隆抗体对各种人趋化因子受体的结合专一性。在该图中，曲线图的横坐标轴显示了藻红蛋白(PE)的荧光强度。[0054]图23显示了小鼠抗人XCRl单克隆抗体(5G7)和人源化抗人XCRl单克隆抗体(HK1L2和HK5L5)对各种人趋化因子受体的结合专一性。在该图中，曲线图的横坐标轴显示了藻红蛋白(PE)的荧光强度。
[0055]图24显示了本发明的小鼠抗人XCRl单克隆抗体(5G7)对由乳酪分枝杆菌诱导的迟发型接触性皮炎(DTH)的小鼠模型的药理效应。
[0056]图25显示了本发明的小鼠抗人XCRl抗体(5G7)对通过实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)进行的多发性硬化(MS)的小鼠模型的药理效应。
[0057]图26显示了本发明的小鼠抗人XCRl抗体的竞争性配体结合试验的结果的分析。实施例说明
[0058]基于已知的文献和类似物，用于实践本发明的各种技术对于本领域的技术人员是容易和可靠地实现的，除了那些在此明确鉴定其来源的那些技术之外。例如，关于基因工程和分子生物技术，可以参考以下文献:例如Sambrook and Russell (桑布鲁克和拉塞尔)，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆实验指南)，”Cold SpringHarbor Laboratory Press (美国冷泉港实验室出版社)，New York (纽约)，(2001);以及Ausubel, F M 等人，“Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，” John ffiley&Sons (约翰.威利父子出版公司)，纽约，NY。
[0059]此外，关于抗体工程技术，可以参考以下文献:例如Kabat (卡巴特)等人，“Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，’U.S.Department of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部)，(1983);以及 Konterman(孔特曼)和 Dubel(迪贝尔)，“Antibody Engineering(抗体工程)，”Springer(施普林格)。
`[0060]术语解释
[0061]术语“核酸”包括，例如核糖核苷酸类、脱氧核糖核苷酸类、以及它们的修饰形式。核酸可以是单链或双链的，也可以是多核苷酸或寡聚核苷酸。
[0062]术语“蛋白质”指的是其中两种或更多种氨基酸通过肽键连接的化合物。
[0063]术语“单克隆抗体”指的是从基本上同质的抗体群获得的抗体。换句话说，包括在这个群中的单独的抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高度特异性的，并且针对单个抗原部位。此外，不同于包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势还在于它们可以被合成而不被其他抗体污染。修饰语“单克隆”指的是从基本上同质的抗体群获得的抗体特征，不应该被解释为表示抗体必须通过任何特定方法制备。
[0064]例如，应当按照本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，该方法首次被 Kohler G 和 Milstein C 描述，“Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity (分泌具有预定义特异性的抗体的融合细胞的连续培养)，” Nature (自然)，256:495_7 (1975)，或者通过重组DNA方法制备(参见美国专利号4816567)。
[0065]此外，可以使用一种技术从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”，例如由ClacksonT>Hoogenboom HR、Griffiths AD 以及Winter G描述的技术，’^taking antibody fragmentsusing phage display libraries (使用卩遼菌体展示库制备抗体片段)，” Nature (自然)，352:624-8 (1991);或 Marks JD、Hoogenboom HR、以及 Bonnert TP> McCafferty J、Griffiths AD、Winter G, “By-passing immunization:Human antibodies from V-genelibraries displayed on phage (旁路免疫:来自展示在卩遼菌体上的V-基因库的人类抗体)，”分子生物学杂志，222:581-97 (1991)。
[0066]在氨基酸序列或核苷酸序列之间的“一致性”指的是在两个或更多个可比较的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相同氨基酸序列或核苷酸序列的程度。因此，当在两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的一致性高时，这些序列的一致性或相似性是高的。在氨基酸序列或核苷酸序列之间的一致性水平是例如使用FASTA确定的，FASTA是一种基于默认参数的序列分析工具。
[0067]可替代地,可以使用Karlin (卡林)和Altschul (阿尔丘尔)BLAST算法来确定(Karlin S, Altschul SF,，，Methods for assessing the statistical significance ofmolecular sequence features by using general scoring schemes(通过使用一般评分方案评价分子序列特征的统计显著性的方法)，"Proc Natl Acd Sci USA (美国国家科学院院干Ij), 87:2264-2268 (1990);以及 Karlin S, Altschul SF,，，Applications and statisticsfor multiple high-scoring segments in molecular sequences (分子序列中的多个高得分段的应用和统计学)，”美国国家科学院院刊，90:5873-7 (1993))。已经开发了例如基于以上描述的 BLAST 算法的 BLASTN和 BLASTX 程序(Altschul SF, Gish ff, Miller W，MyersEff, Lipman DJ, “Basic local alignment search tool (基本局部比对搜索工具)，”分子生物学杂志，215:403-10 (1990))。例如，当分析核苷酸序列时可以使用BLASTN，通过设置例如分数至100以及字长至12作为参数。
[0068]另外，当分析氨基酸序列时可以使用BLASTX，通过设置例如分数至50和字长至3作为参数。
[0069]当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用每个程序的默认参数。这些分析方法的特定技术是已知的。抗人XCRl抗体
[0070]本发明的抗体是分离抗体。
[0071]本发明的抗体结合至人XCRl。人XCRl的氨基酸序列是由NCBI参考序列显示的氨基酸序列:NP_001019815.1或NP_005274.1。本发明的第一个实施例中的特异性抗体是包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含
[0072]在以下(A)或(a)中描述的重链CDRl
[0073]在以下(B)或(b)中描述的重链⑶R2，和
[0074]在以下(C)或(C)中描述的重链⑶R3 ;以及
[0075]该轻链可变区包含
[0076]在以下(D)或(d)中描述的轻链⑶R1，
[0077]在以下(E)或(e)中描述的轻链⑶R2，和
[0078]在以下(F)或(f)中描述的轻链CDR3。
[0079](A)由SEQ ID NO: 53的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0080](B)由SEQ ID NO: 54的氨基酸序列组成的重链CDR2，[0081](C)由SEQ ID NO:55的氨基酸序列组成的重链CDR3，
[0082](D)由SEQ ID NO: 56的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0083](E)由SEQ ID NO: 57的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
[0084](F)由SEQ ID NO: 58的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0085](a)由SEQ ID N0:41的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0086](b)由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0087](c)由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成的重链CDR3，
[0088]Cd)由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0089]Ce)由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
[0090]Cf)由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的轻链CDR3。 [0091 ] 相对于本发明的抗体定义的术语“Q)R”是互补决定区(ComplementarityDetermining Region)的缩写，也被称为互补性决定区(complementarity determiningregion)。⑶R呈现在免疫球蛋白的可变区中，深入地涉及抗体到抗原的特异性结合。此外，“轻链⑶R”指的是呈现在免疫球蛋白轻链可变区中的⑶R，“重链⑶R”指的是呈现在免疫球蛋白重链可变区中的CDR。
[0092]另外，“可变区”指的是包含以上描述的⑶Rl至⑶R3的一个区域(下文简单地称为“CDR1至3”)。虽然CDRl至3的排列顺序没有特别限定，优选地，CDR1、CDR2和CDR3以顺序方式为从N端到C端的顺序或相反的顺序排列或者通过其他称作框架区(FRs)的其他氨基酸序列排列。此外，“重链可变区”是以上描述的重链CDRl至3所在的区域，“轻链可变区”是以上描述的轻链⑶Rl至3所在的区域。
[0093]如上所述，除了以上描述的在每个可变区中的CDRl至3以外的区域被称为框架区(FR)。具体地说，在每个可变区中的N端和⑶Rl之间的区域被定义为FRl，在⑶Rl和⑶R2之间的区域被定义为FR2，在⑶R2和⑶R3之间的区域被定义为FR3，并且在每个可变区中的⑶R3和的C端之间的区域被定义为FR4。
[0094]FR还具有作为用于连接⑶Rl至3的连接序列的功能，这种连接序列作为抗原识别序列尤其重要。FR是促成形成整个可变区的三维结构的区域。
[0095]根据本发明的第一个实施例的优选抗体是包含以下项的一种抗体:
[0096]重链可变区,该重链可变区包含
[0097]以下(g)、以下(m)或以上(a)的重链CDR1，
[0098]以下(h)、以下(η)或以上(b)的重链CDR2，
[0099]以下(i)、以下(O)或以上(C)的重链⑶R3 ;以及
[0100]轻链可变区,该轻链可变区包含
[0101]以下(j)、以下(P)或以上(d)的轻链CDR1，
[0102]以下(k)、以下(q)或以上(e)的轻链CDR2，
[0103]以下(I)、以下(r)或以上(f)的轻链CDR3。
[0104](g)由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0105](h)由SEQ ID NO: 18的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0106](i)由SEQ ID NO: 19的氨基酸序列组成的重链CDR3，
[0107](j)由SEQ ID NO: 20的氨基酸序列组成的轻链CDRl，[0108](k)由SEQ ID N0:21的氨基酸序列组成的轻链CDR2，
[0109](I)由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ；
[0110](m)由SEQ ID NO: 29的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0111](η)由SEQ ID NO: 30的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0112](ο)由SEQ ID NO: 31的氨基酸序列组成的重链CDR3，
[0113](P)由SEQ ID NO: 32的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0114](q)由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
[0115]Cr)由SEQ ID NO: 34的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0116](i)中描述的重链⑶R3和在(O)中描述的重链⑶R3包含相同的氨基酸序列。
[0117]本发明的第二个实施例的抗体是包含以下项的一种抗体
[0118]包含以上(A)-(C)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，或
[0119]包含上面(a)-(c)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区；以及
[0120]包含上面(D)-(F)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区，或
[0121]包含上面(d)-(f)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区。
[0122]第二个实施例的更优选的抗体是包含以下项的任何之一的一种抗体
[0123]包含上面(g)_⑴中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，
[0124]包含上面(m)-(o)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，和
[0125]包含上面(a)-(c)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区；以及
[0126]以下项的任何之一:包含上面(j)-(l)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区，
[0127]包含上面(p)-(r)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区，
[0128]包含上面(d)-(f)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区。
[0129]本发明的第三个实施例的抗体是包含以下项的一种抗体
[0130]包含上面(A)-(C)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，和
[0131]包含上面(D)-(F)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区，或
[0132]包含以下项的一种抗体
[0133]包含上面(a)-(c)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，和
[0134]包含上面(d)-(f)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区。
[0135]第三个实施例的更优选的抗体是包含以下项的一种抗体
[0136]包含上面(g)_（i）中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，和
[0137]包含上面(j)-(l)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区；
[0138]包含以下项的一种抗体
[0139]包含上面(m)-(o)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，和
[0140]包含上面(p)-(r)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区；或
[0141]包含以下项的一种抗体
[0142]包含上面(a)-(c)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区，和
[0143]包含上面(d)-(f)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区。
[0144]本发明的抗体的分子结构不限于免疫球蛋白的分子结构，只要抗体具有以上描述的重链和轻链可变区。特异性结构的实例包括不包含Fe区的F(ab’)2的分子结构；通过免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化形成的并且由CHl和CL结构域以及重链和轻链可变区组成的Fab ;不包含免疫球蛋白恒定区的Fv ;以及为单链Fv抗体的scFv。
[0145]本发明的抗体还可以是多价的，其中结合了以上分子结构。这样一种多价抗体是通过积累scFv构建体的技术形成的，如通过结合Fe区和以上描述的scFv构建体形成的scFv-Fc构建体；以及被称为微抗体的构建体，通过结合恒定区的CH3区域和以上描述的scFv构建体形成。术语“多价”指的是存在多个抗原结合部位。关于本发明的抗体，该术语是以与存在结合至人XCRl的多个部位相同的含义而被使用的。
[0146]本发明的抗体还具有人恒定区加上以上描述的重链和轻链可变区。
[0147]在免疫球蛋白中，重链的“恒定区”包含叫做CH1、CH2和CH3的区域；轻链的“恒定区”包含叫做CL的区域。
[0148]如上所述，当本发明的抗体具有恒定区时，优选的是该重链可变区至少与CH1、CH2和CH3区域之一连接，并且轻链可变区与CL连接。此外，重链可变区优选地与CHl直接连接。
[0149]本发明的抗体的恒定区是源自人免疫球蛋白的恒定区，优选地，源自人免疫球蛋白IgG的恒定区。人免疫球蛋白IgG的亚型没有被特别限制，并且可以适当选择，例如，根据是否向抗体赋予ADCC活性、CDC活性、以及以下所描述的等等。
[0150]术语“ADCC活性”是抗体依赖性细胞的细胞毒性活性的缩写。它是在细胞例如NK细胞中的一种活性，这些细胞表达对抗体Fe区特异的受体,这些受体结合至这些抗体并且破坏出现在这些抗体附近的细胞。另外，术语“CDC活性”是补体依赖性细胞毒性活性的缩写。在人的情况下，具有高ADCC和/或⑶C活性的IgG亚型是IgGl，并且具有低ADCC和/或CDC活性的IgG亚型是IgG2或IgG4。
[0151]本发明的抗体的Fe区中的氨基酸残基可以突变，以便诱导ADCC和/或CDC活性的改变。引入的突变没有被特别限制，并且已知的突变可以被引入。例如，下面的突变可以被引入IgGl的恒定区中，目的是增强ADCC活性:S239D、I332E、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L，以及类似物(Lazar GA, Dang ff, Karki S，Vafa O, Peng JS, Hyun L,Chan C, Chung HS, Eivaz A, Yoder SC, Vielmetter J, Carminchael DF, Hayes RJ, DahiyatBI, “Engineered antibody Fe variants with enhanced effector function (具有提高的效应子功能的工程抗体Fe变体)”，美国国家科学院院刊，103:4005-10 (2006));以及 S298A，K334A, S298A/K334A, S298A/E333A/K334A 等等，(Shields RL, Namenuk AK, HongK, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG, “Highresolution mapping of the binding site on human IgGlfor Fe gamma RI, Fe gammaRH,Fe gamma RI11, and FcRn and design of IgGlvariants with improved binding tothe Fe gamma R(对于Fe Y R1、Fc YRI1、Fc Y RII1、和FcRn在人IgGl上的结合部位的高分辨率作图以及具有改善的与Fe Y R结合的IgGl变体的设计)，”生物化学杂志，276:6591-604(2001))。
[0152]增强CDC 活性的突变的实例包括 S267E、H268F、S324T、S267E/H268F、S267E/S324T、 H268F/S324T、 S267E/H268F/S324T(Moore GL,Chen H,Karki S，LazarGA, “Engineered Fe variant antibodies with enhanced ability to recruitcomplement and mediate effector functions”(具有添补补充和介导效应子功能的提高能力的工程Fe 变体抗体)MAbs, 2:181-9 (2010))。[0153]另外，为了降低ADCC活性，可以引入已知的突变；例如V234A/G237A (ColeMs,Anasetti C，Tso JY, “Human IgG2variants of chimeric anti_CD3are nonmitogenicto T cells (嵌合的抗⑶3的人IgG2变体对T细胞是非促有丝分裂的)”，免疫学杂志(JImmunol)，159:3613-21 (1997)) , H268Q/V309L/A330S/P331S (An Z, Forrest G, MooreR, Cukan M, Haytko P, Huang L, Vitelli S, Zhao JZ, Lu P, Hua J, Gibson CR, HarveyBR, Montgomery D, Zaller D, Wang F, Strohl W，“IgG2m4，an engineered antibody isotypewith reduced Fe function”，(IgG2m4,一种具有降低的Fe功能的工程抗体同种型)MAbs, 1:572-9 (2009))，等等
[0154]有待突变的以上描述的氨基酸的编号遵循Eu编号(参见免疫学感兴趣的蛋白质的序列，NIH出版号91-3242)。
[0155]嵌合抗体
[0156]在本发明的抗体中，其中重链和轻链可变区包含来自非人类物种的氨基酸序列并且恒定区包含来自人类的氨基酸序列的抗体被定义为“嵌合抗体”。
[0157]本发明的嵌合抗体的第一个实施例是包含由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成的重链和SEQ ID NO: 14的轻链的一种嵌合抗体。
[0158]如在表5中所示，SEQ ID NO: 13的氨基酸序列包含在重链可变区中在上述的重链CDRl至3中的SEQ ID NO: 17至19的重链CDRl至3。此外，如在表5中所示，SEQ ID NO: 14的氨基酸序列包含在轻 链可变区中在上述的轻链⑶Rl至3中的SEQ ID N0:20至22的轻链CDRl至3。
[0159]本发明的嵌合抗体包含由突变引起的变体，这些突变为由SEQ ID NO: 13的氨基酸组成的重链中的突变和/或由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成的轻链中的突变，只要这些突变不消除该嵌合抗体对人XCRl的结合能力。
[0160]优选地通过将突变引入可变区的FRl至FR4 (下文简单地称为“FR1至4”)中至少之一或在SEQ ID NOs: 13和14的对应氨基酸序列的恒定区中的至少一个部位引入突变而获得在重链和轻链中的变体。
[0161]引入到重链和轻链中的突变的具体数目没有特别限制。通常引入突变来获得与突变之前的氨基酸序列具有85%或更高一致性、优选90%或更高一致性、更优选95%或更高一致性、以及最优选99%或更高一致性的变体。
[0162]在此使用的“突变”包括置换、缺失、插入，等等。可以使用没有特别限制的一种已知的方法作为一种特定的方法用于引入突变。例如，在置换的情况下，可以使用保守性置换。术语“保守性置换”指的是将一个氨基酸残基用具有相似侧链的另一个氨基酸残基置换。
[0163]例如，在具有碱性侧链的氨基酸残基(例如赖氨酸、精氨酸、和组氨酸)之间的置换符合保守性置换。另外，在氨基酸残基之间的下列置换也符合保守性置换:在具有酸性侧链的氨基酸残基例如天冬氨酸和谷氨酸之间的置换；在具有非带电的极性侧链的氨基酸残基，例如甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸之间的置换；在具有非极性侧链的氨基酸残基例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、和色氨酸之间的置换；在具有分支的侧链的氨基酸残基例如苏氨酸、缬氨酸、和异亮氨酸之间的置换；以及在具有芳香族侧链的氨基酸残基例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和组氨酸之间的置换。
[0164]人源化抗体
[0165]在本发明的抗体中，在重链和轻链可变区中包含上述⑶Rl至3，其中FR1-4包含源自人类的氨基酸序列的抗体或其变体，被定义为“人源化抗体”。
[0166]包含一种源自人类的氨基酸序列的这些FR没有被特别限制，并且可以基于已知的技术来确定。
[0167]这些FR的实例包含完全人框架区或亚区，其中源自人种系序列的FR是优选的。可以适当参考，例如NCBI网站，该网站显示了一列目前已知的FR序列作为完全人框架区或亚区的实例。
[0168]人重链可变区序列的非限制实例包括VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、和 VH7-81。
[0169]人轻链可变区序列的非限制实例包括VL1-11、VL1-13、VL1-16、VL1-17、VL1-18、VL1-19、VL1-2、VL1-20、VL1-22、VL1-3、VL-4、VL1-5、VL1-7、VL1-9、VL2-1、VL2-11、VL2-13、VL2-14、VL2-15、VL2-17、VL2-19、VL2-6、VL2-7、VL-8、VL3-2、VL3-3、VL3-4、VL4-1、VL4-2、VL4-3、VL4-4、VL4-6、VL5-1、VL5-2、VL5-4、和 VL5-6。
[0170]完全人FR选自这些功能性的胚系基因。由于这些氨基酸的有限数目的修饰，通常这些FR中的每一个是不同的。这些FR可以与本说明书中描述的⑶R组合使用。用于与上述CDR组合使用的人FR的非限制`的其他实例包括KOL、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY、和Ρ0Μ。关于这些人FR的实例，可以参考以下文献:卡巴特等人，〃免疫学感兴趣的蛋白质的序列〃，美国卫生和人类服务部，NIH(1991)USA;Wu TT, Kabat EA, "An analysis of the sequencesof the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains andtheir implications for antibody complementarity (本周蛋白的可变区和骨髓瘤轻链的序列的分析以及它们对于抗体互补性的含义)，〃实验医学杂志，132:211-50 (1970);等
坐寸O
[0171]本发明的人源化抗体的第一个实施例是包括包含SEQ ID N0:60或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区以及SEQ ID N0:68或SEQ ID NO: 72的轻链可变区的人源化抗体。
[0172]一个更优选的实施例是包括包含SEQ ID N0:60的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:68的氨基酸序列的轻链可变区的人源化抗体，或者包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区的人源化抗体。
[0173]分别如在表11-1和12-1中所示，SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:64的氨基酸序列包含在重链可变区中在上述重链⑶Rl至3中的SEQ ID NO: 17至19的重链⑶Rl至3。分别如在表13-1和14-1中所示，SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:72的氨基酸序列包含在轻链可变区中在上述轻链⑶Rl至3中的SEQ ID NO:20至22的轻链⑶Rl至3。
[0174]本发明的人源化抗体包括由包含SEQ ID NO:60或64的氨基酸序列的重链可变区中和/或包含SEQ ID N0:68或72的氨基酸序列的轻链可变区中的突变引起的变体，只要这种突变不消除结合至人XCRl的能力。重链和轻链可变区中的这些变体优选地是通过将突变引入至对应的FRl至4中获得的。
[0175]引入至重链和轻链可变区中的突变的具体数目没有特别限制。通常引入突变以获得与突变之前的氨基酸序列具有85%或更高一致性、优选90%或更高一致性、更优选95%或更高一致性、并且最优选99%或更高一致性的变体。
[0176]在此使用的术语“突变”包括置换、缺失、插入，等等。如同在以上描述的嵌合抗体的情况下，可以使用保守性置换以及类似物作为引入突变的具体方法。
[0177]本发明的人源化抗体的第二个实施例包括包含人恒定区的抗体。它们的实例包括包含SEQ ID NO: 59或63的氨基酸序列的重链以及包含SEQ ID NO:67或71的氨基酸序列的轻链的人源化抗体。
[0178]—个更优选的实施例为包括包含SEQ ID N0:59的氨基酸序列的重链以及包含SEQID NO:67的氨基酸序列的轻链的人源化抗体，或者包括包含SEQ ID N0:63的氨基酸序列的重链以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链的人源化抗体。
[0179]如在表11-1中所示，SEQ ID NO: 59的氨基酸序列包括相应于SEQ ID NO: 60的重链可变区的氨基酸序列，并且因此包含在上述重链⑶Rl至3中的SEQ ID N0:17-19的重链CDRl至3。此外，如在表13-1中所示，SEQ ID NO: 67的氨基酸序列包含相应于SEQ ID NO: 68的轻链可变区的氨基酸序列，并且因此包含在上述轻链⑶Rl至3中的SEQ ID N0:20-22的轻链CDRl至3。
[0180]上述重链和/或轻链包含由突变引起的变体，只要这些突变不消除结合至人XCRl的能力。在重链和轻链中的这样的变体优选地是通过将突变引入FRl至4或者至恒定区中而获得的。
[0181]引入重链和轻链的突变的具体数目没有特别限制。通常引入突变而获得与突变之前的氨基酸序列具有85%或更高一致性、优选90%或更高一致性、更优选95%或更高一致性、并且最优选99%或更高一致性的变体。
[0182]在此使用的术语“突变”包括置换、缺失、插入，等等。在上述嵌合抗体的情况下，可以使用保守性置换以及类似物作为引入突变的一种具体方法。
[0183]抗体的功能
[0184]本发明的抗体结合至人XCRl。在此使用的术语“结合”的含义至少涵盖通过如在蛋白质类之间的相互作用的情况下所见的疏水键以及类似键的结合。换句话说，至少通过疏水结合而结合至人XCRl的抗体足以作为本发明的抗体。此外，本发明的抗体和人XCRl可以或不可以在结合之后解离。
[0185]本发明的抗体优选地特异性结合至人XCR1。如在此使用的术语“特异性结合”指的是特异性结合至人XCRl，表示当人XCRl与除了人XCRl之外的分子(具体地说，具有类似于人XCRl结构的分子，例如人XCRl的同源物或人XCRl的直向同源物)同时存在时抗体优先结合至人XCRl。
[0186]本发明的抗体特异性地结合至人XCRl不表示排除结合至上述人XCRl的同源物或直向同源物的能力。
[0187]可以通过反应速率常数，例如Kd、Koff、或Kon值来评价本发明的抗体结合至人XCRl的程度。通过用Koff值除以Kon值获得Kd值。[0188]在本发明的抗体和人XCRl之间的反应速率常数没有特别限制。
[0189]本发明的抗体结合至人XCRl的胞外结构域。具体而言，抗体结合至氨基酸区域I至31、90至103、168至190、以及251至267的一个或多个，相应于上述NCBI参考序列:NP_001019815.1或ΝΡ_005274.I的氨基酸序列(SEQ ID NO::91 ;图10)的胞外结构域。
[0190]更优选地，在SEQ ID Ν0:91的氨基酸序列中，抗体结合至选自下组的至少三个氨基酸，该组由以下各项组成:第8、第11、第12、第13、第14、第16、第17、第22、第23、第176、以及第177个氨基酸。
[0191]所述“至少三个氨基酸”包括，例如，三个或更多个氨基酸、四个或更多个氨基酸、五个或更多个氨基酸、六个或更多个氨基酸、七个或更多个氨基酸、八个或更多个氨基酸、九个或更多个氨基酸、十个或更多个氨基酸、或者十一个氨基酸。
[0192]请注意本发明的“表位”还被称为“抗原决定簇”，并且包括“线性表位”和“非连续表位”。“线性表位”是通过氨基酸序列的一级结构而不是通过其构象结构被抗体识别的表位。“非连续表位” 是通过氨基酸序列的构象结构(基于较高级的结构)被抗体识别的表位。
[0193]请注意本领域的技术人员可以通过适当修改本发明的实例中描述的方法来确定本发明的抗体的表位。例如，可以使用一种已知的方法通过合成由落在人XCRl的氨基酸序列的胞外结构域内的所希望的氨基酸序列组成的一种蛋白质或肽、并且通过一种已知的方法证实在所获得的蛋白质或肽与抗体之间的结合来确定表位。可替代地，可以通过一种已知的方法通过将一个适当的所希望的氨基酸突变引入人XCRl的氨基酸序列中来制备一种突变体，并且证实在所制备的突变体和抗体之间的结合是否被减弱来确定表位。
[0194]如上所述，由于本发明的抗体结合至人XCR1，本发明的抗体也包括抑制人XCRl和人XCLl之间结合的抗体。人XCLl抗体还被称为人淋巴细胞趋化因子(Ltn)或人淋巴细胞趋化因子a (Ltn-α )0这种抑制活性有时还被称为由本发明的抗体诱导的“中和活性”。因为人XCRl在体内作为一种受体蛋白质呈现在细胞表面，在人XCRl和人XCLl之间的结合被本发明的抗体的抑制优选地是在细胞表面进行的。本发明的抗体是否具有对人XCRl和人XCL2之间的结合的抑制活性并不要紧，只要抗体具有至少抑制人XCRl和XCLl之间的结合的活性。因此，本发明的抗体还包括不仅抑制人XCRl和XCLl之间的结合，还抑制人XCRl和XCL2之间结合的抗体。
[0195]优选的细胞的实例包括与通过激活人XCRl和人XCLl之间结合的免疫系统相关的细胞，特别优选树突细胞。具体地说，通过后面描述的实例所示，由于本发明的抗体特异性地识别BDCA3+树突细胞，这些树突细胞是表达大量的人XCRl蛋白的树突细胞，优选的是这些抗体具有抑制在BDCA3+树突细胞上的人XCRl和人XCLl之间的结合的作用。
[0196]人XCRl和人XCLl之间的结合被本发明的抗体抑制。这样的抑制形式的非限制性实例包括:
[0197](I)本发明的抗体在人XCLl最初应该结合的部位结合至XCRl，弓丨起结合至人XCLl的空间阻抑，并且导致在人XCRl和人XCLl之间的结合的抑制。
[0198](2)本发明的抗体结合至人XCR1，引起人XCRl的三维结构的改变，结果引起人XCLl应该结合至其上的人XCRl的结构的变化，因此导致人XCRl和人XCLl之间的结合的抑制。
[0199](3)本发明的抗体结合至XCR1，引起受体的内化，这导致在人XCRl和人XCLl之间的结合的抑制。
[0200]本发明的抗体对人XCRl和人XCLl之间的结合的抑制活性是基于IC5tl或IC9tl值评价的。例如可以在本发明的抗体存在下使用表达人XCRl蛋白的那些细胞通过进行人XCLl结合至人XCRl的竞争性抑制实验或类似实验获得这些值。可以使用一种已知的方法作为这种竞争性抑制实验的一种具体方法。
[0201]本发明的抗体包括具有抑制细胞迁移作用的抗体。术语“细胞迁移”指的是由于给予细胞的外部刺激以及刺激诱导的细胞内信号转导机制的活化而造成细胞主动迁移的现象。由主动细胞迁移产生的作用依赖于细胞的功能而变化。例如，在树突细胞的细胞迁移的情况下，这样的细胞迁移是作为免疫系统机制之一的一种现象。在本发明中，对细胞迁移的抑制活性有时被称为“中和活性”。 [0202]如上所述，由于本发明的抗体适当抑制在树突细胞尤其是BDCA3+树突细胞中的人XCRl和人XCLl之间的结合，抗体特别优选地抑制树突细胞尤其是BDCA3+树突细胞的迁移。
[0203]人XCRl是七跨膜G蛋白偶联受体。当人XCLl结合至人XCRl时，人XCRl的三维结构改变；并且，因此释放偶联至人XCRl的胞内结构域的G蛋白，并且信号被转导至细胞。
[0204]G蛋白被本发明的抗体根据上述形式(I)、(2)或类似形式抑制人XCRl和XCLl之间的结合而被阻止释放。结果，没有信号被转导，由此抑制细胞迁移的现象。
[0205]可替代地，作为本发明的抗体与人XCRl的结合加强人XCRl与偶联至人XCRl细胞内区域的G蛋白之间的结合的机制的结果，细胞迁移的现象可以被抑制，结果没有发生G蛋白的释放，由此抑制细胞内信号转导。
[0206]本发明的抗体对人细胞的细胞迁移的抑制活性是基于IC5tl或IC9tl值而评价的。具体的值没有特别限制。例如，IC5tl值通常为大约0.36nM或更低，优选大约0.27nM或更低，并且更优选大约0.16nM或更低。例如，IC9tl值通常为大约2.38nM或更低，优选大约1.52nM或更低，并且更优选大约0.86nM或更低。
[0207]本发明的抗体包括，作为一种实施例，具有降低细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的作用的抗体。降低CTL活性的机制为，例如，本发明的抗体抑制在树突细胞中的人XCRl和人XCLl之间的相互作用。在这些树突细胞中，上述BDCA3+树突细胞是优选的。
[0208]制备本发明的抗体的方法
[0209]可以通过包含以下三个步骤的方法制备本发明的抗体，虽然没有限制于此。
[0210](i)步骤1，将载体引入到宿主以转化该宿主，该载体包含含有编码本发明抗体的核苷酸序列的核酸；
[0211](ii)步骤2，培养在步骤I中获得的转化宿主，收集含有结合至人XCRl的抗体的部分；以及
[0212](iii)步骤3，从步骤2中获得的部分分离或纯化以上抗体。
[0213]步骤I
[0214]在步骤I中所使用的核酸是编码本发明的抗体的核酸。可以使用基于本发明的抗体的氨基酸序列信息的计算机技术(in silico technique)来确定以上核酸的核苷酸序列。此时，优选的是参考步骤2中使用的宿主中的密码子频率来确定核苷酸序列。核苷酸序列的具体实例包括具有SEQ ID N0:3、4、7、8、ll、12、15、16、61、62、65、66、69、70、73、或74的核苷酸序列；或其变体。
[0215]优选地通过在抗体的FR或恒定区引入突变(缺失、置换、插入，等等)而产生以上变体。
[0216]引入到该变体的突变的具体数目没有特别限制。通常引入突变而获得与突变之前的氨基酸序列具有85%或更高一致性、优选90%或更高一致性、更优选95%或更高一致性、以及最优选99%或更高一致性的变体。
[0217]此外，以上核酸可以包含编码在5’ -端的分泌信号肽的核苷酸序列。编码分泌信号肽的具体核苷酸序列优选地是在步骤2中使用的在宿主细胞中作为分泌信号肽起作用的核苷酸序列。术语“分泌信号肽”指的是包含作为将宿主中产生的蛋白质或肽引入到蛋白质或肽向宿主外部分泌的途径中的识别序列的氨基酸序列的一种肽。
[0218]编码分泌信号肽的核苷酸序列的实例包括:
[0219]
[0220]ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTMCTACAGGTGTCCACTCC(SEQ ID NO:75)，
[0221]
[0222]ATGMGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGCTGTTCTGGTTTCCTGCTTCCMCACT(SEQ ID NO:76)，
[0223]
[0224]ATGGMTGGTCATGGGTCTTTCTGTTCTTTCTGAGTGTCACMCCGGGGTGCATAGC(SEQ ID NO:77)，
[0225]
[0226]ATGGMTGGTCTTGGGTCTTTCTGTTCTTTCTGTCCGTCACTACCGGGGTCCACTCT(SEQ ID NO:78)，
[0227]
[0228]ATGTCOGTGCCTACTCAGGTGCTGGGGCTGCTGCTGCTGTGGCTGACOGATGCTOGTTGC (SEQ ID NO: 79)，以及
[0229]
[0230]ATGTCOGTGCCTACTCAGGTGCTGGGGCTGCTGCTGCTGTGGCTGACOGATGCTOGTTGT(SEQ ID NO::80)。
[0231]在步骤I中在所使用的载体包含以上核酸的至少之一。
[0232]这种载体可以是以下载体之一:
[0233](I)包含这样一种核酸的载体，该核酸含有编码选自下组的至少一个成员的核苷酸序列，该组由重链、重链可变区、以及本发明的抗体的重链CDRl至3组成；
[0234](II)包含这样一种核酸的载体，该核酸含有编码选自下组中的至少一个成员的核苷酸序列，该组由轻链、轻链可变区、以及本发明的抗体的轻链CDRl至3组成；或
[0235](III)包含一种核酸和另一种核酸的载体，一种核酸含有编码选自下组中的至少一个成员的核苷酸序列，该组由重链、重链可变区、和本发明的抗体的重链CDRl至3组成，另一种核酸含有编码选自下组中的至少一个成员的核苷酸序列，该组由轻链、轻链可变区、和本发明的抗体的轻链⑶Rl至3组成。
[0236]以上载体可以是基因表达载体。“基因表达载体”是具有引起以上核酸的核苷酸序列表达的功能的载体。该基因表达载体可以包含一个启动子序列、增强子序列、阻抑序列、隔离序列、以及类似 物，以便控制该核苷酸序列的表达。这些序列没有特别限制，只要它们在上述宿主中起作用。
[0237]在步骤I中所使用的宿主没有特别限制，只要以上基因被表达。它们的实例包括昆虫细胞、真核细胞、和哺乳动物细胞。在这些细胞中，HEK细胞、CHO细胞、NSO细胞或SP2/0细胞，这些都是哺乳类动物细胞，在更有效表达编码抗体的核苷酸序列方面是特别优选的。
[0238]将以上载体引入步骤I中的宿主中的技术没有特别限制。可以使用已知的技术。以上(I)至(III)中所示的载体可以单一地或者以两种或更多种组合地引入宿主中。
[0239]带有以上载体的宿主可以通过这样一种技术产生。该载体可以像这样维持在宿主中或者以这样的方式维持:包含编码载体中的抗体的核苷酸序列的核酸被结合到宿主的基因组中。使用一种已知的技术维持所制备的宿主，如果需要的话，可以长时期保存。
[0240]步骤2
[0241]步骤2是培养在步骤I中获得的上述宿主以及收集含有结合人XCRl的本发明的抗体的部分的步骤。培养维持上述载体的宿主允许该宿主基于载体中的核酸表达编码本发明的抗体的核苷酸序列，导致本发明的抗体的产生。所产生的抗体被储存在宿主中或在用于培养该宿主的介质中。
[0242]在步骤2中，可以使用一种已知的方法作为收集含有本发明的抗体的部分的技术。例如，为了从该宿主收集含有本发明的抗体的部分，通过物理或化学手段将该宿主破坏，通过破坏获得的溶液经受固液分离处理，由此获得液体部分。所获得的液体部分可以被用作含有本发明的抗体的部分。
[0243]另一方面，为了从用于培养该宿主的介质收集含有本发明的抗体的部分,该介质，也就是在步骤I中所获得的宿主的培养液，经受固液分离处理，由此获得液体部分。所获得的液体部分可以被用作含有本发明的抗体的部分。
[0244]鉴于简化后续步骤3中的分离或纯化步骤，优选的是从宿主的培养液收集含有本发明的抗体的部分。
`[0245]在步骤2中用于培养的介质没有特别限制，只要该媒介允许该宿主表达编码本发明的抗体的核苷酸序列，由此产生本发明的抗体。然而，当从如上所述的宿主的培养液收集含有本发明的抗体的部分时，为了尽可能地在后续步骤3中简化分离或纯化步骤，优选使
用无血清培养基。
[0246]关于培养该宿主过程中使用的各种条件，例如容器、温度、时间、在介质中的宿主浓度、以及培养条件，可以使用在已知方法中用于产生抗体所用的条件。
[0247]步骤3
[0248]步骤3是从步骤2中获得的部分分离或纯化结合至人XCRl的本发明的抗体的步骤。用于分离和纯化本发明的抗体的方法没有特别限制。通常所用的用于分离或纯化蛋白质的方法是广泛适用的。
[0249]本发明的抗体的药用用途
[0250](I)作为用于免疫性疾病的治疗剂的用途
[0251]如上所述，本发明的抗体具有抑制与免疫系统相关的树突细胞的细胞迁移现象的作用。基于这种作用，本发明的抗体(尤其是人源化抗体)具有作为临床上适用于人的药物组合物的活性成分的可能。
[0252]本发明的抗体适用的疾病解释如下。
[0253]适用的疾病(免疫性疾病)
[0254]XCRl在人的情况下在⑶141+树突细胞中高度表达，在小鼠情况下在⑶8 α +树突细胞中高度表达。这些树突细胞使用被称为交叉呈递的上述抗原呈递方法活化T 细胞(Bachem A, Giittler S，Hartung E, Ebstein F, Schaefer M, Tannert A, SalamaA, Movassaghi K, Opitz C, Mages HW, Henn V, Kloetzel PM, Gurka S, Kroczek RA, "Superiorantigen cross-presentation and XCRlexpression define human CDllc+CD141+cellsas homologues of mouse CD8+dendritic cells (优越的抗原交叉呈递和XCRl表达将人⑶Ilc+CDHl+细胞定义为小鼠⑶8+树突细胞的同源物)，〃实验医学杂志，207:1273-1281(2010))。
[0255]另外，由于XCLl(是人XCRl的配体)产生的来源包含T细胞尤其是⑶8+T细胞，其中涉及XCL1-XCR1的趋化因子系统控制树突细胞诱导的CD8+T细胞的活化(Crozat K, GuitonR, Contreras V, Feuillet V, Dutertre CA, Ventre E, Vu Manh TP, Baranek T, StorsetAK, Marvel J, Boudinot P, Hosmalin A, Schwartz-Cornil I, Dalod M, 〃The XC chemokinereceptorlis a conserved selective marker of mammalian cells homologous to mouse⑶8 a +dendritic cells(XC趋化因子受体I是与小鼠⑶8 a +树突细胞同源的哺乳动物细胞的保守性选择标记)，〃实验医学杂志，207:1283-1292 (2010);以及Dorner BG, DornerMB, Zhou X, Opitz C，Mora A, Giittler S, Hutloff A, Mages HW, Ranke K, Schaefer M, JackRS, Henn V, Kroczek RA, "Selective expression of the chemokine receptor XCRloncross-presenting dendritic cells determines cooperation with CD8+T_cells (趋化因子受体XCRl在交叉呈递树突细胞上的选择性表达决定与CD8+T细胞的合作)，"Immunity(免疫)，31:823-833 (2009))。 [0256]如上所述,本发明的抗体包括,作为一个实施例，显示出抑制在树突细胞尤其是BDCA3+树突细胞中的人XCLl和人XCRl之间结合的作用的一种抗体。因此，本发明的抗体具有作为治疗免疫性疾病的治疗剂的可能，其中涉及由树突细胞的迁移所活化的T细胞。具体地说，这些抗体具有作为用于治疗与控制⑶8+T细胞的活化相关的疾病的治疗剂的可倉泛。
[0257]如上所述，本发明的抗体包括，作为一个实施例，显示出降低CTL活性的作用的抗体。CTL具有通过攻击细胞或组织来激活免疫系统的机制。已知各种免疫性系统疾病具有加速的CTL活性；因此，本发明的抗体具有作为通过降低CTL活性用于治疗免疫性疾病的治疗剂的可能。
[0258]这些疾病的非限制实例包括I型糖尿病、银屑病、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、甲状腺炎、移植物排斥、迟发型超敏反应、克罗恩病、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、前葡萄膜炎、韦格纳肉芽肿病、移植物抗宿主病、以及贝赫切特病(Kurts C, Robinson Bff, Knolle PA, ^Cross-priming inhealth and disease (健康和疾病中的交叉引发)，〃Nat Rev Immunol (自然免疫学评论)，10:403-414(2010);Kehren J, Desvignes C, Krasteva M, Ducluzeau MT, AssossouO, Horand F，Hahne Μ, Kiigi D, Kaiserlian D, Nicolas JF0 "Cytotoxicity is mandatoryfor CD8 (+) T cell-mediated contact hypersensitivity (细胞毒性对 CD8 ( + ) T 细胞介导的接触过敏是必须的)，〃实验医学杂志.189:779-786(1999) ;Middel P, ThelenP,Blaschke S，Polzien F，Reich K, Blaschke V, Wrede A, Hummel KM,Gunawan B, RadzunHJ, "Expression of the T-cell chemoattractant chemokine lymphotactin in Crohn'sdisease (在克罗恩病中的T细胞化学吸引剂趋化因子淋巴细胞趋化因子的表达)，"Am JPathol(美国病理学杂志)，159:1751-1761 (2001) ; Sugihara T，Sekine C，Nakae Tj KohyamaK，Harigai MjIwakura Y，Matsumoto Y, Miyasaka N，Kohsaka H，〃A new murine model todefine the critical pathologic and therapeutic mediators of polymyositis (定义多肌炎的关键病理学和治疗介质的一种新的鼠模型)，"Arthritis Rheum (类风湿性关节炎)，56:1304-1314(2007);Wang CR, Liu MFj Huang YHj Chen HC，"Up-regulation ofXCRlexpression in rheumatoid joints(类风湿关节中 XCRl 表达的上调)，"Rheumatology(风湿病学)(Oxford) 43:569-573 (2004) ; Muroi Ej Ogawa F，Shimizu K, Komura K, HasegawaM，Fujimoto M，Sato S，"Elevation of serum lymphotactin levels in patients withsystemic sclerosis (患有系统性硬化病的患者中血清淋巴细胞趋化因子水平的升高)，〃J Rheumatol (风湿病学杂志)，35:834-838 (2008) ; Torrence AEj Brabb Tj Viney几，Bielefeldt-Ohmann H，Treuting P，Seamons A, Drivdahl Rj Zeng W，Maggio-PriceLj"Serum biomarkers in a mouse model of bacterial-1nduced inflammatory boweldisease (细菌诱导的炎性肠病的小鼠模型中的血清生物标记)，〃Inflamm Bowel Dis (炎性肠病)，14480-490(2008) ; Yeh PT, Lin FAj Lin CPj Yang CM，Chen MS, Yang CH，"Expressionsof lymphotactin and its receptor, XCRj in Lewis rats with experimental autoimmuneanterior uveitis (在实验性自身免疫前葡萄膜炎的路易鼠中的淋巴细胞趋化因子和其受体XCR的表达)，"Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol (格拉芙临床与实验眼科学文献)，248:1737-1747 (2010) ; Blaschke S，Brandt P，Wessels JTj Miiller GA，"Expressionand function of the C-class chemokine lymphotactin (XCLl) in Wegener’sgranulomatosis (韦格纳肉芽肿病中的C类趋化因子淋巴细胞趋化因子(XCL1)的表达和功能)，〃J Rheumatol (风湿病学杂志)，36:2491-2500 (2009) ; Asuoka H，Okazaki Y, KawakamiY，Hirakata Mj Inoko H，Ikeda Y, Kuwana M，"Autoreactive CD8+cytotoxic T lymphocytesto major histocompatibili ty complex class I chain-related gene A in patientswith Behiet1S disease (在患有贝赫切特病的患者中的针对主要组织相容性复合物I类链相关基因A的自身反应性⑶8+细胞毒性T淋巴细胞)，"Arthritis Rheum (类风湿性关节炎)，50:3658-3662(2004);Serody JSj Burkett SE,Panoskaltsis-Mortari A，Ng-CashinJ，McMahon E，Matsushima GKj Lira SA，Cook DNj Blazar BR, ^T-1ymphocyte productionof macrophage inflammatory protein—lalpha is critical to the recruitment ofCD8 (+)T cells to the liver, lung, and spleen during graft-versus-host disease(T淋巴细胞产生巨噬细胞炎性蛋白-1a对于移植物抗宿主病过程中向肝脏、肺、和脾脏募集 CD8 (+) T 细胞是关键的)，"Blood (血液)，96:2973-2980 (2000) ; Sugihara Tj SekineC，Nakae Tj Kohyama K，Harigai Mj Iwakura Y，Matsumoto Y, Miyasaka N，KohsakaH，〃A new murine model to define the clinical pathologic and therapeuticmediators of polymyositis，"(定义多肌炎的临床病理学和治疗介质的一种新的鼠模型)Arthri tis&Rheumat ism (关节炎与风湿病)。56:1304-1314(2007))；以及 DalakasMCj "Review:—An update on inflammatory and autoimmune myopathies, 〃(综述:炎性肌病和自身免疫性肌病的更新)Neuropathol Appl Neurobiol (神经病理学和应用神经生物学)，37:226-242(2011)。
[0259]还揭示了本发明的抗体(抗人XCRl小鼠单克隆抗体(5G7))显著抑制了后面描述的使用迟发型超敏反应的小鼠模型的实验中的DTH反应(在下文有时被称为“DTH”)。如上所述，迟发型超敏反应是已知为一种免疫性疾病的疾病，其中涉及被树突细胞的迁移活化的CD8+T细胞。本发明的抗体在治疗迟发型超敏反应中有效的事实提供了本发明的抗体具有抑制细胞迁移(尤其是树突细胞迁移)的活性的证据，因为本发明的影响CD8+T细胞。
[0260]此外，除了迟发型超敏反应之外，特应性皮炎反应和接触性皮炎也被称为皮肤免疫性疾病，其中涉及 DTH 反应(Fabrizi G, Romano A, Vultaggio P, BellegrandiS，Paganelli R, Venuti A, "Heterogeneity of atopic dermatitis defined by theimmune response to inhalant and food allergy (通过对吸入剂和食物过敏的免疫应答定义的特应性皮炎的异质性)，〃Eur J Dermatol(欧洲皮肤病学杂志)，9:380-384(1999);以及 Fonacier LS, Dreskin SC, Leung DYM, "Allergic skin diseases (过敏性皮肤疾病)，〃JAllergy Clin Immunol (变态反应与临床免疫学杂志)，125S138-149 (2010)。
[0261]基于上述内容，本发明的抗体具有作为用于治疗皮肤免疫性疾病例如特应性皮炎或接触性皮炎的治疗剂的可能。
[0262]已经指出CD8+T细胞的活化还可以涉及DTH反应(Mody CH, Pain IIIR,Jackson C，Chen G-H, Toews GB, 〃CD8Cells play a critical role in delayed-typehypersensitivity to intact Cryptococcus neoformans (CD8 细胞在迟发型超敏反应中对未受损的新型隐球菌起关键作用)，〃J Immunol (免疫学杂志)，152:3970-3979 (1994)，等等。
[0263]在银屑病中观察到CD8+T细胞侵入到表皮中，银屑病是一种影响很多病人的自身免疫皮肤疾病，尤其是慢性银屑病损害。这些细胞被认为是主要的引起银屑病损伤的效应细胞(Gudjonsson JE, Johnston A, Sigmundsdottir H, ValdimarssonH, ^Immunopathogenic mechanisms in psoriasis (银屑病中的免疫致病机制)，"Clin ExpImmunol (临床与实验免疫学)，135:1-8 (2004))。
[0264]基于以上内容，本发明的抗体具有作为用于治疗其中涉及CD8+T细胞活化的皮肤免疫性疾病的治疗剂的可能。
[0265]除了迟发型超敏反应、特应性皮炎、和接触性皮炎之外，涉及CD8+T细胞的皮肤免疫性疾病的非限制性实例还包括皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、银屑病、副银屑病、自身免疫性大疱性疾病(例如天疱疮、类天疱疮、和获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、以及混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、和荨麻疹。
[0266]以下文，描述了本发明的抗体和各种免疫性疾病(多发性硬化、人类I型糖尿病、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、甲状腺炎、移植物抗宿主病、皮肌炎、多肌炎、和包涵体肌炎)之间的关系。本发明的抗体对其有效的疾病并不限于以下具体的疾病。
[0267]多发性硬化
[0268]最近报道了在人类中除了⑶4+T细胞之外还有⑶8+T细胞侵入多发性硬化中的中枢神经系统损害。此外，已经报道，在使用小鼠的实验中，通过源自中枢神经中的髓鞘的抗原激活的CD8+T细胞的移植诱导了实验性自身免疫性脑膜脑炎，这是人类多发性硬化的模型。与常规模型相比，上述模型更接近地模拟人类多发性硬化的病理学(反复的加剧和缓解、显著的脱髓鞘、脱髓鞘损害部位中侵入许多CD8+T细胞和巨噬细胞/小胶质细胞)。如上所述，已经表明CD8+T细胞在人类多发性硬化和其小鼠模型中起重要作用(FrieseMA, Fugger L, ^Authoreactive CD8+cells in multiple sclerosis:a new target fortherapy?(在多发性硬化中的自身反应性⑶8+细胞:一种新的治疗祀点？)”Brain (脑)，128:1747-1763 (2005))。
[0269]因此，控制CD8+T细胞活化的本发明的抗体具有作为用于治疗多发性硬化的治疗剂的可能。
[0270]人类I型糖尿病
[0271]代表人类I型糖尿病模型的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠显示，CD8+T细胞的消耗抑制糖尿病的发作(Wang B, Gonzales A, Benoist C，Mathis D, "The role CD8+T_cells in theinitiation of insulin-dependent diabetes mellitus (CD8+T 细胞在膜岛素依赖型糖尿病起始中的作用)，〃Eur J Immunol (欧洲免疫学杂志)，26:1762-1769 (1996))。这表明⑶8+T细胞还涉及I型糖尿病的病理学的发展。
[0272]因此，控制CD8+T细胞活化的本发明的抗体具有作为用于治疗人类I型糖尿病的治疗剂的可能。
[0273]肾小球肾炎
[0274]在肾小球肾炎小鼠模型中，已经显示出⑶8+T细胞涉及肾脏病变的形成过程(Heymann F, Meyer-Schwesinger C, Hamilton-ffilliams EE, Hammerich L, Panzer W，KadenS，Quaggin SE, Floege J, Grdne H-J，Kurts C，〃Kidney dendritic cell activationis required for progr ession of renal disease on a mouse model of glomerularinjury (在肾小球损伤小鼠模型上的肾脏疾病的进展需要肾脏树突细胞活化)，〃J ClinInvest (临床研究杂志)，119:1286-1297 (2009))。在重度自身免疫性狼疮肾炎的患者中观察到许多⑶8+T细胞侵入肾脏。已经报道这些⑶8+T细胞的数目与肾脏活动指数(renalactivity score)以及血清肌酸酐水平的增加(指示肾功能的恶化)之间的关联(CouziL, Merville P, Deminiere C，Moreau J-F, Combe C，Pellegrin J-L, Viallard J-F, BlancoP,"Predominance of CD8+T lymphocytes among periglomerular infiltrating cellsand link to the prognosis of class III and class IV lupus nephritis (在球旁浸润细胞中⑶8+T淋巴细胞的优势以及与III类和IV类狼疮肾炎预后的联系)，"ArthritisRheum (类风湿性关节炎),56:2362-2370 (2007))。如上所述，CD8+T细胞被认为涉及在人和小鼠模型中的自身免疫性肾小球肾炎的发作或其病理学进展。
[0275]因此，控制CD8+T细胞活化的本发明的抗体具有作为用于治疗肾小球肾炎的治疗剂的可能。
[0276]自身免疫性肝炎
[0277]已经表明丙型肝炎病毒(HCV)感染涉及自身免疫性肝炎的发展进程。也已经表明关于HCV诱导的CD8+CTL通过消除HCV和损伤感染的肝细胞而涉及自身免疫性肝炎的发展(Kammer AR, van der Burg SH，Grabscheid B, Hunziker IP,Kwappenberg KMCj ReichenJ，Melief CJMj Cerny A，"Molecular mimicity of human cytochrome P450by hepatitisC virus at the level of cytotoxic T cell recognition (在细胞毒性 T 淋巴细胞识别的水平经由丙型肝炎病毒的人细胞色素P450的分子模拟)，〃实验医学杂志，190:169-175(1999))。
[0278]因此，控制CD8+T细胞活化的本发明的抗体具有作为用于治疗自身免疫性肝炎的治疗剂的可能。
[0279]甲状腺炎
[0280]已知⑶8+CTL涉及实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)中，这是人甲状腺炎的小鼠模型(例如桥本氏病)。已经报道该模型中的小鼠显示出与人甲状腺炎相似的损伤(在外周血中发现抗甲状腺球蛋白抗体，并且观察到⑶8+T细胞和⑶4+T细胞侵入甲状腺)。如上所述，已经表明⑶8+T细胞涉及人和小鼠模型中的甲状腺炎的发展(Brazillet M-P, BatteuxF，Abehsira-Amar 0，Nicoletti F，Charreire J，"Induction of experimentalautoimmune thyroiditis by heat-denatured porcine thyroglobulin:a Tcl—mediateddisease (通过热变性的猪甲状腺球蛋白诱导的实验性自身免疫性甲状腺炎:一种Tcl介导的疾病)，〃Eur J Immunol (欧洲免疫学杂志)，29:1342-1352 (1999))。
[0281]因此，控制CD8+T细胞活化的本发明的抗体具有作为用于治疗人甲状腺炎的治疗剂的可能。
[0282]类风湿性关节炎
[0283]如以下实例中所描述，本发明的抗体之一，5G7，在治疗乳酪分支杆菌诱导的DTH实验中的类风湿性关节炎中显示出显著效果。因此，本发明的抗体具有作为用于治疗类风湿性关节炎的治疗剂的可能。
[0284]移植物排斥
[0285]CD8+T细胞在人器`官移植之后的移植物排斥中起重要作用。移植物被在宿主中的识别表达在移植物的细胞中的MHC I类的⑶8+T细胞排斥。此外，已经报道在经历排斥的肾脏移植患者中许多⑶8+T细胞侵入肾脏。如上所述，已经表明⑶8+T细胞在人器官移植之后在移植物排斥中起重要作用(Bueno V, Pestana J0M, ^The role of CD8+T_cells duringallograft rejection(Q)8+T细胞在同种异体移植排斥过程中的作用)，"Braz J Med BiolRes,35:1247-1258 (2002))。
[0286]因此，控制CD8+T细胞活化的本发明的抗体具有作为用于治疗移植物抗宿主病的治疗剂的可能。
[0287]皮肌炎、多肌炎、和包涵体肌炎
[0288]当侵入皮肌炎和多肌炎患者的损伤部位的淋巴细胞被建立为细胞系时，⑶8+T细胞系显示出对他们自身的培养的肌细胞的细胞毒性。这表明患有以上描述的肌炎的患者中肌细胞损伤是由具有抗原特异性细胞毒性的⑶8+T细胞引起的(Hohlfeld R, EngelAG，"Coculture with autologous myotubes of cytotoxic T cells isolated frommuscle in inflammatory myopathies (与从炎性肌病中的肌肉分离的细胞毒性T细胞的自体肌管的共培养)，〃Ann Neurol (神经病学年鉴)，29:498-507 (1991))。此外，在患有包涵体肌炎的患者中已经观察到⑶8+T细胞侵入损伤部位(Dalakas MCj “Review:An updateon inflammatory and autoimmune myopathies (综述:炎性肌病和自身免疫性肌病的更新)，〃神经病理学和应用神经生物学，37:226-242 (2011))。因此，控制⑶8+T细胞活化的本发明的抗体具有作为用于治疗皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎的治疗剂的可能。
[0289]如上所述，由于本发明的抗体具有潜力作为用于治疗免疫性疾病尤其是皮肤免疫性疾病的治疗剂，本发明提供了包含本发明的抗体的药物组合物。
[0290]这种药物组合物具有作为用于治疗免疫性疾病的治疗剂的可能，目的是治疗免疫性疾病尤其是皮肤免疫性疾病。
[0291]在此使用的术语“治疗”表示达到所希望的药理学和/或生理学效果。这些效果包括部分或完全治愈疾病和/或由该疾病引起的不良作用(病状和症状)的效果。以上效果还包括抑制或延迟疾病和/或由该疾病引起的不良作用的进展(病状和症状)的效果；减轻病状和症状的效果(即，改善疾病或症状，或引起症状进展的逆转)；以及预防疾病复发的效果。以上效果还包括，在可能具有对疾病的倾向和/或由该疾病引起的不良作用(病状和症状)但是没有被诊断为具有该倾向的个体中，部分或完全预防该疾病和/或由该疾病引起的不良作用的发作(病状和症状)的效果。因此，术语“治疗”还表示“缓解”、“防止复发”、和“预防疾病”。
[0292]在本发明中，包含本发明的抗体的药物组合物可以被恰当地用于治疗人类免疫性疾病尤其是皮肤免疫性疾病。应当理解的是，该药物组合物能够提供例如部分或完全治愈免疫性疾病的各种症状的效果；部分或完全抑制免疫性疾病的各种症状的效果(即，抑制或延迟进展)；减轻免疫性疾病的各种症状的效果(即，改善疾病或症状，或者引起症状进展的逆转)；或者防止免疫性疾病的各种症状的复发的效果。
[0293]目标疾病的具体实例如上所述，其中皮肤免疫性疾病是优选的。
[0294]在以上药物组合物中的本发明的抗体的含量没有特别限制，只要该药物组合物包含有效量的本发明的抗体。该含量可以例如以以下方式被恰当地确定:本发明的抗体包含在该药物组合物中的量为相对于100wt%的该组合物的0.001至99.99wt%，考虑目标免疫性疾病的类型、剂型、给药方法，等等。
[0295]在此使用的术语“有效量”指的是允许本发明的抗体显示出抑制树突细胞的细胞迁移的作用的量，或者允许这些抗体显示出以上描述的所希望的药理学和/或生理学效果(针对免疫性疾病的治疗效果)的量。
[0296]药学上可接受的载体或添加剂可以与本发明的抗体组合添加至该药物组合物中。在此使用的术语“药学上可接受的载体或添加剂”指的是任选的载体、稀释剂、赋形剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、媒介物、递送系统、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、芳香剂、或甜味剂。可以使用已知的载体或添加剂。
[0297]该药物组合物的剂型的非限制实例包括片剂、糖浆、搽剂、注射剂、和输液，优选注射剂或输液。这些注射剂和输液可以是含水、非水、或悬浮液形式。另外地，该药物组合物可以是在给药之前即刻制备的剂型。
[0298]本发明的药物组合物，具体而言，一种用于免疫性疾病的治疗剂，在免疫性疾病的治疗方法中具有可能，这些治疗方法包括将该组合物给予患有免疫性疾病尤其是皮肤免疫性疾病的人类受试者的步骤。如上所述，该药物组合物还在预防免疫性疾病的方法中具有可能，这些方法包括将该组合物给予还没有产生免疫性疾病尤其是皮肤免疫性疾病的病状或症状但是可能具有对该免疫性疾病的倾向的人类受试者。
[0299]根据免疫性疾病的类型、受试者的性别、人种、年龄、和一般状况、疾病的严重程度等等，该药物组合物(用于免疫性疾病的治疗剂)的剂量和给药方法可以恰当地被确定在0.001至100mg/kg/天的范围内。[0300]本发明的抗体可以按上述剂量一天给药一次，或者每天以分开的剂量给药几次。此外，在这些抗体对上述疾病具有治疗效果的范围内，给药间隔可以是每天、每隔一天、每周、每隔一周、每2至3周、每月、或者每2至3个月。给药方法的非限制实例包括口服、肌肉注射、静脉注射、动脉内给药、硬膜内给药、真皮内给药、腹膜内给药、鼻内给药、肺内给药、眼内给药、阴道内给药、宫颈管内给药、直肠内给药、以及皮下给药。
[0301]作为免疫毒素的应用
[0302]本发明的抗体可以结合至细胞毒性的分子。由于这些抗体结合至人XCRl蛋白，该蛋白在与免疫系统相关的树突细胞中大量表达，这些抗体可以被用作靶向树突细胞的免疫毒素。
[0303]在此使用的术语“细胞毒性分子”指的是显示例如细胞凋亡和/或坏死效应的分子，这些效应引起细胞死亡。
[0304]这样的分子的实例包括皂草素、蓖麻蛋白、假单胞菌外毒素、白喉毒素、和化疗剂。可以通过用于制备常规免疫毒素的方法进行抗体和毒性物质之间的结合。
[0305](3)本发明的抗体的其他应用
[0306]由于本发明的抗体还包括,作为一个实施例，结合至在树突细胞中大量表达的XCRl的抗体，这些抗体在用于检测树突细胞的方法中具有可能。在这种情况下，优选的是针对该用途标记本发明的这些抗体。在此使用的术语“标记”指的是使这些抗体结合至标记的分子，例如突光分子、发光分子、生色分子和放射性同位素分子。
[0307]结合方式没有限制，只要在检测步骤中键没有被解离。可以使用一种已知的方法作为一种具体的检测方法。例如，可以使用流式细胞术技术。
[0308]此外，本发明的抗体还可以恰当地适用于在检测树突细胞后之分离和/或移除树突细胞的方法中。对于这些方法，还可以使用已知的方法。例如，已知的细胞分选设备可以恰当地与流式细胞术技术结合使用。
[0309]本发明涉及以上解释的抗体，宽泛地包括以下描述的本发明的实施例。
[0310]条目I
[0311]结合至XCRl的抗体,其中该抗体结合至线性或非连续表位,这些表位包括选自下组的至少三个氨基酸，该组由以下各项组成:在SEQ ID N0:91的氨基酸序列中的第8、11、12、13、14、16、17、22、23、176、和 177 个氨基酸。
[0312]条目2
[0313]根据以上条目I所述的抗体，其中该抗体为:
[0314]包含含有以下(g)至(i)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(j)至(I)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0315]包含含有以下(m)至(O)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(P)至Cr)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0316]包含含有以下(a)至(C)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(d)至Cf)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0317]Ca)由SEQ ID N0:41的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0318](b)由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0319](c)由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成的重链CDR3 ；[0320](d)由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0321](e)由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的轻链CDR2和
[0322](f)由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ；
[0323](g)由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成的重链CDR1，
[0324](h)由SEQ ID NO: 18的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0325](i)由SEQ ID NO: 19的氨基酸序列组成的重链CDR3 ； [0326](j)由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的轻链CDR1，<0
[0327](k)由SEQ ID N0:21的氨基酸序列组成的轻链CDR2，
[0328](I)由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ；
[0329]Cm)由SEQ ID NO: 29的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0330](η)由SEQ ID NO: 30的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0331](ο)由SEQ ID Ν0:31的氨基酸序列组成的重链CDR3，
[0332](P)由SEQ ID NO: 32的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0333](q)由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的轻链CDR2和
[0334]Cr)由SEQ ID NO: 34的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0335]条目3
[0336]根据以上条目I或2所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:60或64的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID N0:68或72的氨基酸序列的轻链可变区。
[0337]条目4
[0338]根据以上条目I至3中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变区。
[0339]条目5
[0340]根据以上条目I至3中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区。
[0341]条目6
[0342]根据以上条目I至5中任一项所述的抗体，其中该抗体包含人恒定区。
[0343]条目7
[0344]根据以上条目I至6中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID N0:67的氨基酸序列的轻链。
[0345]条目8
[0346]根据以上条目I至6中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链。
[0347]条目9
[0348]根据包含Fe区的以上条目I至8中任一项所述的抗体，其中该Fe区被突变以诱导ADCC活性的变化。
[0349]条目10
[0350]根据以上条目9所述的抗体，其中该Fe区被突变以降低ADCC活性。
[0351]条目11
[0352]根据以上条目I至10中任一项所述的抗体，其中该抗体结合至细胞毒性分子。[0353]条目12
[0354]根据以上条目I至11中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制人XCRl和人XCLl之间的相互作用。
[0355]条目13
[0356]根据以上条目I至12中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制树突细胞的细胞迁移。
[0357]条目14
[0358]根据以上条目I至13中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制细胞毒性T淋巴细胞的活性。
[0359]条目15
[0360]一种包含根据以上条目I至14中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体或添加剂的药物组合物。
[0361]条目16
[0362]根据以上条目15所述的药物组合物，其中该药物组合物是一种用于免疫性疾病的治疗剂。
[0363]条目17`[0364]根据以上条目16所述的药物组合物，其中该免疫性疾病是一种皮肤免疫性疾病。
[0365]条目18
[0366]根据以上条目17所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、或荨麻疹。
[0367]条目19
[0368]根据以上条目17所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎。
[0369]条目20
[0370]根据以上条目17所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病为特应性皮炎或接触性皮炎。
[0371]条目21
[0372]根据以上条目16所述的药物组合物，其中该免疫性疾病是甲状腺炎、类风湿性关节炎、I型糖尿病、或多发性硬化。
[0373]条目22
[0374]一种包含编码根据以上条目I至14中任一项所述的抗体的核苷酸序列的核酸。
[0375]条目23
[0376]一种治疗免疫性疾病的方法，包括将有效量的根据以上条目I至14中任一项所述的抗体或根据以上条目15所述的药物组合物给予患有免疫性疾病的人。
[0377]条目24[0378]根据以上条目23所述的方法，其中该免疫性疾病是皮肤免疫性疾病。
[0379]条目25
[0380]根据以上条目24所述的方法，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、或荨麻疹。
[0381]条目26
[0382]根据以上条目24所述的方法，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎。
[0383]条目27
[0384]根据以上条目23所述的方法，其中该免疫性疾病是甲状腺炎、类风湿性关节炎、I型糖尿病、或多发性硬化。
[0385]本发明还包括以下描述的实施例
[0386]条目1-A
[0387]包含含有以下 (g)至(i)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(j)至(I)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0388]包含含有以下(m)至(O)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(P)至Cr)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；或
[0389]包含含有以下(a)至(C)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(d)至Cf)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0390]Ca)由SEQ ID N0:41的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0391](b)由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0392](c)由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成的重链CDR3 ；
[0393]Cd)由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0394]Ce)由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的轻链CDR2和
[0395]Cf)由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ；
[0396](g)由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0397](h)由SEQ ID NO: 18的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0398](i)由SEQ ID NO: 19的氨基酸序列组成的重链CDR3 ；
[0399](j)由SEQ ID NO: 20的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0400](k)由SEQ ID N0:21的氨基酸序列组成的轻链CDR2，
[0401](I)由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链⑶R3 ；
[0402]Cm)由SEQ ID NO: 29的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0403](η)由SEQ ID NO: 30的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0404](ο)由SEQ ID Ν0:31的氨基酸序列组成的重链CDR3 ；
[0405](P)由SEQ ID NO: 32的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0406](q)由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的轻链CDR2和[0407](r)由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0408]条目2-A
[0409]根据以上条目1-A所述的抗体，包含含有SEQ ID NO:60或64的氨基酸序列组成的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:68或72的氨基酸序列的轻链可变区。
[0410]条目3-A
[0411]根据以上条目1-A或2-A所述的抗体，包含含有SEQ ID N0:60的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变区。
[0412]条目4-A
[0413]根据以上条目1-A或2-A所述的抗体，包含含有SEQ ID N0:64的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区。
[0414]条目5-A
[0415]根据以上条目1-A至4-A中任一项所述的抗体，包含人恒定区。
[0416]条目6-A
[0417]根据以上条目1-A至5-A中任一项所述的抗体，包含含有SEQ ID N0:59的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID N0:67的氨基酸序列的轻链。
[0418]条目7-A
[0419]根据以上条目1-A至5-A中任一项所述的抗体，包含含有SEQ ID N0:63的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链。
[0420]条目8-A
[0421]根据包含Fe区的以上条目1-A至7-A中任一项所述的抗体，其中该Fe区被突变以诱导ADCC活性的改变。
[0422]条目9-A
[0423]根据以上条目8-A所述的抗体，其中该Fe区被突变以降低ADCC活性。
[0424]条目IO-A
[0425]根据以上条目1-A至9-A中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制人XCRl和人XCLl之间的相互作用。
[0426]条目Il-A
[0427]根据以上条目1-A至IO-A中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制树突细胞的细胞迁移。
[0428]条目12-A
[0429]一种包含根据以上条目1-A至Il-A中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体或添加剂的药物组合物。
[0430]条目13-A
[0431]根据以上条目12-A所述的药物组合物，其中该药物组合物是一种用于免疫性疾病的治疗剂。
[0432]条目14-A
[0433]根据以上条目13-A的药物组合物，其中该免疫性疾病是一种皮肤免疫性疾病。
[0434]条目15-A
[0435]根据以上条目14-A所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、或荨麻疹。
[0436]条目16-A
[0437]根据以上条目14-A所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎。
[0438]条目17-A
[0439]根据以上条目14-A所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病为特应性皮炎或接触性皮炎。
[0440]条目18-A
[0441]一种包含编码根据以上条目1-A至Il-A中任一项所述的抗体的核苷酸序列的核酸。
[0442]条目19-A
[0443]—种免疫性疾病治疗方法，包括将有效量的根据以上条目1-A至Il-A中任一项所述的抗体给予患有免疫性疾病的人的步骤。
[0444]本发明进一步包含`以下描述的实施例。
[0445]条目1-B
[0446]包含含有以下(g)至(i)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(j)至
(I)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0447]包含含有以下(m)至(O)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(P)至Cr)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0448]包含含有以下(a)至(C)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(d)至Cf)中描述的轻链⑶Rl至3的轻链可变区的抗体；
[0449]Ca)由SEQ ID N0:41的氨基酸序列组成的重链CDRl，
[0450](b)由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0451](c)由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成的重链CDR3 ；
[0452]Cd)由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0453]Ce)由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
[0454]Cf)由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的轻链⑶R3 ；
[0455](g)由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成的重链⑶R1，
[0456](h)由SEQ ID NO: 18的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0457](i)由SEQ ID NO: 19的氨基酸序列组成的重链CDR3 ；
[0458](j)由SEQ ID NO: 20的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0459](k)由SEQ ID N0:21的氨基酸序列组成的轻链CDR2，
[0460](I)由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ；
[0461]Cm)由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成的重链⑶R1，
[0462](η)由SEQ ID NO: 30的氨基酸序列组成的重链CDR2，[0463](ο)由SEQ ID N0:31的氨基酸序列组成的重链CDR3 ；
[0464](P)由SEQ ID NO: 32的氨基酸序列组成的轻链CDRl，
[0465](q)由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
[0466](r)由SEQ ID NO: 34的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0467]条目2-B
[0468]根据条目1-B所述的抗体，包含含有SEQ ID NO:60或64的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:68或72的氨基酸序列的轻链可变区。
[0469]条目3-B
[0470]根据以上条目1-B或2-B所述的抗体，包含含有SEQ ID N0:60的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变区。
[0471]条目4-B
[0472]根据以上条目1-B或2-B所述的抗体，包含含有SEQ ID N0:64的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区。
[0473]条目5-B
[0474]根据以上条目1-B或4-B中任一项所述的抗体，包含人恒定区。
[0475]条目6-B
[0476]根据以上条目1-B至5-B中任一项所述的抗体，包含含有SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID N0:67的氨基酸序列的轻链。
[0477]条目7-B
[0478]根据以上条目1-B至5-B中任一项所述的抗体，包含含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链。
[0479]条目8-B
[0480]根据包含Fe区的以上条目1-B至7-B中任一项所述的抗体，其中该Fe区被突变以诱导ADCC活性的改变。
[0481]条目9-B
[0482]根据以上条目8-B所述的抗体，其中该Fe区被突变以降低ADCC活性。
[0483]条目IO-B
[0484]根据以上条目1-B至9-B中任一项所述的抗体，其中该抗体结合至细胞毒性分子。
[0485]条目Il-B
[0486]根据以上条目1-B至IO-B中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制人XCRl和人XCLl之间的相互作用。
[0487]条目12-B
[0488]根据以上条目1-B至Il-B中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制树突细胞的细胞迁移。
[0489]条目13-B
[0490]一种包含根据以上条目1-B至12-B中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体或添加剂的药物组合物。
[0491]条目14-B
[0492]根据以上条目13-B所述的药物组合物，其中该药物组合物是一种用于免疫性疾病的治疗剂。
[0493]条目15-B
[0494]根据以上条目14-B所述的药物组合物，其中该免疫性疾病是一种皮肤免疫性疾病。
[0495]条目16-B
[0496]根据以上条目15-B所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、或荨麻疹。
[0497]条目17-B
[0498]根据以上条目15-B所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎。
[0499]条目18-B
[0500]根据以上条目15-B所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是特应性皮炎或接触性皮炎。
[0501]条目19-B`
[0502]一种包含编码根据以上条目1-B至12-B中任一项所述的抗体的核苷酸序列的核酸。
[0503]条目20-B
[0504]一种治疗免疫性疾病的方法，包括将有效量的根据以上条目1-B至12-B中任一项所述的抗体或根据以上条目13-B的药物组合物给予患有免疫性疾病的人。
[0505]条目21-B
[0506]根据以上条目20-B所述的方法，其中该免疫性疾病是皮肤免疫性疾病。
[0507]条目22-B
[0508]根据以上条目21-B所述的方法，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、或荨麻疹。
[0509]条目23-B
[0510]根据以上条目21-B所述的方法，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎。
[0511]条目24-B
[0512]根据以上条目21-B所述的方法，其中该皮肤免疫性疾病是特应性皮炎或接触性皮炎。
[0513]实例[0514]在下文，基于实例更详细地描述本发明。不用说，本发明并不限制于这些实例。
[0515]实例I
[0516]( I)制备小鼠抗人XCRl单克隆抗体
[0517]为了获得抗人XCRl的单克隆抗体，用表达人XCRl的B300.19细胞的膜部分免疫XCRl敲除小鼠。该膜部分按照以下步骤制备:首先，用氮气细胞破碎容器(Parr仪器公司)，将悬浮于Ho缓冲液(0.25M蔗糖，IOmM Hepes(pH7.4), ImM EGTA，0.5mM MgCl2, Ix Completemini无EDTA (罗氏应用科学部))中的表达人XCRl的B300.19细胞破碎(800psi持续30分钟，在冰上)，然后离心(2，OOOg, 10分钟)。收集上清液并再离心(100，OOOg, 30分钟)。将沉淀悬浮在50mM Hepes (pH7.4)缓冲液中，并且将其指定为膜部分。
[0518]将160 μ g或260 μ g的这种膜部分与等体积的GERBU佐剂混合(GERBU BiotechnikGmbH),然后皮下注射到XCRl敲除的小鼠(Deltagen)的足垫中。然后给予五或六次另外的注射，隔周一次。在最后免疫之后的三或四天，将这些小鼠处死，使外周淋巴结细胞与P3U1骨髓瘤细胞以 2:1 或 5:1 比例在 GenomeONE-CF (Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.(石原产业株式会社))的存在下融合。然后将融合的细胞在96孔的塑料板中培养。
[0519]为了初步筛选，进行FACS分析。将亲本CHO细胞和表达人XCR1-EGFP的CHO细胞以1:1比率混合，悬浮于FACS缓冲液中(ImM EDTA,含有1%FBS的PBS—(西格玛))。将细胞与来自每个杂交瘤的培养上清液在冰上孵育20分钟。用FACS缓冲液将细胞洗涤三次，然后用PE标记的抗小鼠IgG多克隆抗体在冰上孵育20分钟(杰克逊，#715-116-151，在FACS缓冲液中以1:100稀释)。用FACS缓冲液将细胞洗涤三次，然后悬浮在FACS缓冲液中。使用FACSCanto II细胞分析仪测量荧光强度(BD Bioscience (BD生物科学公司))。结果，从三个孔收集的上清液显示出对表达人XCR1-EGFP的CHO细胞的高反应性。
[0520]使用标准有限稀释法从这三个阳性孔获得克隆(2H6、5G7、和11H2)。通过上述FACS分析确定每个克隆的反应性。
[0521]随后，进行体外趋化性试验来评价这三个克隆对人淋巴细胞趋化因子诱导的表达人XCRl的BaF3细胞或B300.19细胞的迁移的中和活性。趋化性试验在24孔转孔培养载体(transwell culture support) (3μηι 孔,Costar (科斯塔)，#3399)或 96 孔转孔培养皿(Multiscreen, 5 μ m 孔，Millipore (密理博)，#MAMIC5S10)中进行。
[0522]在24孔转孔培养载体的情况下，将表达人XCRl的BaF3细胞(IxlO6细胞)悬浮于50 μ L 的趋化缓冲液(含有 0.5%BSA、0.5%FBS、和 20mM HEPES (ρΗ7.4)的 RPMI1640 培养基(Invitrogen(英杰公司))和50 μ L的每种培养上清液的混合物中，并且在室温下孵育30分钟。随后，将溶解于浓度为I μ g/mL的趋化缓冲液中的重组人淋巴细胞趋化因子(Genzyme(基因酶公司)，#2695)以600μ L/孔加到较低的孔中，将孵育的细胞加到较高的孔中。在5%C02培养箱中在37°C下孵育4小时之后，将转孔(transwell)在1，350rpm离心5分钟，并且将迁移的细胞收集在较低的孔中。将收集的细胞用多聚甲醛固定(终浓度:1%)，将3(^1^的每个样品施用于FACSCanto II细胞分析仪，从而计数细胞的数目。
[0523]在96孔转孔培养载体的情况下，将表达人XCRl的B300.19细胞(2xl05细胞)悬浮于 25 μ L 的趋化缓冲液(含有 0.5%BSA、0.5%FBS、和 20mM HEPES (ρΗ7.4)、和 50 μ M 的 2-巯基乙醇的RPMI1640培养基(英杰公司))和50 μ L的每种培养上清液的混合物中，在室温下孵育30分钟。随后，将溶解于浓度为I μ g/mL的趋化缓冲液中的重组人淋巴细胞趋化因子(基因酶公司，#2695)加到150 μ L/孔的较低的孔中，并且将孵育的细胞加到较高的孔中。在5%C02培养箱中在37°C下孵育4小时之后，将转孔(transwell)在1，350rpm离心5分钟，并且将迁移的细胞收集在较低的孔中。将30 μ L的每个样品施用于FACSCanto II细胞分析仪，从而计数细胞的数目。
[0524]由三个杂交瘤克隆(2H6、5G7、和11H2)产生的培养上清液显示出对人淋巴细胞趋化因子诱导的表达人XCRl的BaF3细胞B300.19的细胞的迁移的中和活性。
[0525](2)小鼠杭人XCRl杭体(2H6、5G7、和11H2)对表汰人XCRl的细朐的反应件
[0526]为了评价从这三个克隆纯化的抗体的反应性和中和活性，将这些抗体用来自每个克隆的培养上清液的重组蛋白A (GE Healthcare (通用医疗集团)，#17-5080-01)纯化。使用单克隆抗体同种型试剂盒(361'0丨60，#丽1'1)确定每个克隆的同种型。2册和5G7为IgG2b、K，并且 11H2 为 IgG2a, κ。
[0527]通过FACS分析评价纯化的抗体对人XCRl的反应性。将亲本Β300.19细胞和表达人XCR1-EGFP的Β300.19细胞以1:1的比率混合，并且悬浮在FACS缓冲液中(含有1%FBS的PBS_ (西格玛))。在冰上用含有100 μ g/mL的人免疫球蛋白的FACS缓冲液将细胞封闭10分钟。然后在冰上用从O至10 μ g/mL不同浓度的纯化的抗体(2H6、5G7和11H2)或用浓度为10 μ g/mL的小鼠同种型对照抗体IgG2a (eBioscience, #14-4724-82)或IgG2b(ebioscience, #14-4732-82)将细胞孵育20分钟。用FACS缓冲液将细胞洗涤三次，然后在冰上用PE标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(杰克逊，#715-116-151，以1:50稀释在FACS缓冲液中)孵育20分钟。用FACS缓冲液将细胞洗涤三次，然后悬浮在FACS缓冲液中。用FACSCanto II细胞分析仪测量荧光强度。
[0528]这三种纯化的抗体(2H6、5G7、和11H2)显示出对表达人XCR1-EGFP的B300.19细胞的反应性，但是对亲本B300.19细胞则没有(图1)。相比之下，该小鼠同种型对照抗体既没有与表达人XCR1-EGFP的B300.19细胞反应，也没有与亲本细胞反应(数据未显示)。
[0529](3)小鼠杭人XCRl杭体(2H6、5G7、和11H2)对人淋巴细朐趋化闵子诱导的表汰人XCRl的细胞的迁移的中和活性
[0530]通过体外趋化性试验评价来自这些克隆的纯化的抗体的中和活性。使用96孔的转孔培养皿(MultiScreen，5 μ m孔，密理博，#MAMIC5S10)进行趋化性试验。将表达人XCRl的B300.19细胞(2xl05个细胞)悬浮于含有浓度从O至10 μ g/mL的每种纯化的抗体(2H6、5G7、和 11H2)的 75 μ L 的趋化缓冲液中(含有 0.5%BSA、0.5%FBS、20mM HEPES (ρΗ7.4)和50 μ M2-巯基乙醇的RPMI1640培养基(英杰公司))中；然后在室温下孵育30分钟。此外，将重组人淋巴细胞趋化因子(R&D，#695-LT/CF)溶解于终浓度为I μ g/mL的趋化缓冲液中，其中纯化的抗体被溶解为从O至10 μ g/mL的不同浓度。将淋巴细胞趋化因子和纯化的抗体添加至150 μ L/孔的较低的孔，然后在室温下孵育30分钟。30分钟之后，将孵育的细胞加到较高的孔，并且在5%C02培养箱中在37°C孵育4小时。随后，将30 μ L的每个样品施用于FACSCanto II细胞分析仪，从而计数细胞的数目。2H6、5G7、和llH2mAbs在大约3 μ g/mL浓度下完全抑制了细胞迁移。图2显示了浓度依赖性抑制的典型形式。从这三个独立的实验计算IC5tl和IC9tl值。表1以平均值土标准误差显示了这些值。
[0531][表 I]
[0532]诵讨趋化件试骀的2H6、5G7、和11H2的IC=和IC^倌[0533]
【权利要求】
1.一种与人XCRl结合的抗体，其中该抗体结合至包含选自下组的至少三个氨基酸的线性或非连续表位，该组由SEQ ID NO:91的氨基酸序列中的第8、第11、第12、第13、第14、第16、第17、第22、第23、第176、和第177个氨基酸组成。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中该抗体是: 包含含有以下(g)至(i)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(j)至(I)中描述的轻链CDRl至3的轻链可变区的抗体； 包含含有以下(m)至(ο)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(P)至(r)中描述的轻链CDRl至3的轻链可变区的抗体；或 包含含有以下(a)至(c)中描述的重链⑶Rl至3的重链可变区和含有以下(d)至(f)中描述的轻链CDRl至3的轻链可变区的抗体: Ca)由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的重链CDRl，
(b)由SEQID NO:42的氨基酸序列组成的重链CDR2， (c)由SEQID NO:43的氨基酸序列组成的重链CDR3 ； Cd)由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成的轻链CDRl， Ce)由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和 Cf)由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ； (g)由SEQID NO:17的氨基酸序列组成的重链⑶R1， (h)由SEQID NO:18的氨基酸序列组成的重链CDR2， (i)由SEQID NO:19的氨基酸序列组成的重链⑶R3 ； (j)由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的轻链⑶R1， (k)由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链CDR2， (I)由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链⑶R3 ； Cm)由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成的重链CDRl， (η)由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成的重链CDR2， (ο)由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的重链CDR3 ； (P)由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成的轻链CDR1， (q)由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的轻链⑶R2，和 Cr)由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQID NO:60或64的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:68或72的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQID N0:60的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变区。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQID N0:64的氨基酸序列的重链可变区、以及含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中该抗体包含人恒定区。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQID N0:59的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中该抗体包含含有SEQID N0:63的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID N0:71的氨基酸序列的轻链。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的包含Fe区的抗体，其中该Fe区被突变以诱导ADCC活性的改变。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中该Fe区被突变以降低ADCC活性。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中该抗体被结合至细胞毒性分子。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制人XCRl和人XCLl之间的相互作用。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制树突细胞的细胞迁移。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制细胞毒性T淋巴细胞的活性。
15.一种包含根据权利要求1至14中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体或添加剂的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中该药物组合物是一种用于免疫性疾病的治疗剂。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中该免疫性疾病是一种皮肤免疫性疾病。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接 触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、或荨麻疹。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎。
20.根据权利要求17所述的药物组合物，其中该皮肤免疫性疾病是特应性皮炎或接触性皮炎。
21.根据权利要求16所述的药物组合物，其中该免疫性疾病是甲状腺炎、类风湿性关节炎、I型糖尿病、或多发性硬化。
22.一种包含编码根据权利要求1至14中任一项所述的抗体的核苷酸序列的核酸。
23.一种治疗免疫性疾病的方法，包括将有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或者根据权利要求15所述的药物组合物给予患有一种免疫性疾病的人。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该免疫性疾病是一种皮肤免疫性疾病。
25.根据权利要求24所述的方法，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、副银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、自身免疫性大疱性疾病(例如，天疱疮、类天疱疮、或获得性大疱性表皮松解症)、脓疱病、妊娠期疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、斑秃、寻常型白癜风、与胶原性疾病相关的皮肤疾病(例如系统性红斑狼疮、干燥综合征、或混合性结缔组织病)、与阿狄森病相关的皮肤疾病、与移植物抗宿主病(GVHD)相关的皮肤疾病、湿疹、或荨麻疹。
26.根据权利要求24所述的方法，其中该皮肤免疫性疾病是银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、皮肌炎、多肌炎、或包涵体肌炎。
27.根据权利要求23所述的方法，其中该免疫性疾病是甲状腺炎、类风湿性关节炎、I型糖尿病、或多发性硬 化。
【文档编号】C07K16/28GK103764680SQ201280041366
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年8月30日 优先权日:2011年9月1日
【发明者】坂本佳正, 西村美由希, 河野铁, 泽幸久, 今井俊夫 申请人:卫材R&D管理有限公司