本发明涉及具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的新的黄酮类衍生物及其非毒性的药学上可接受的盐，以及含有这些化合物作为活性成分的药物组合物，以及该黄酮类衍生物及其非毒性的药学上可接受的盐以及含有这些化合物作为活性成分的药物组合物在制备降尿酸药物方面的应用。
背景技术：
芹菜素是研究最广泛的黄酮化合物之一，具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用等。体外研究表明，芹菜素还具有黄嘌呤氧化酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。
但是，芹菜素的药理学作用的选择性有待提高。
技术实现要素：
本发明提供式I所示的具有选择性黄嘌呤氧化酶抑制作用的新的芹菜素类衍生物，或其药学上可接受的盐类：
其中，R为H，或C1-C5的直链或支链烷基；n为1-10的整数。
本发明还提供式I所示的具有选择性黄嘌呤氧化酶抑制作用的新的芹菜素类衍生物，或其药学上可接受的盐类；所述的药学上可接受的盐为，但不限于钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、锌盐或镁盐。
本发明还提供式药物组合物，其含有式I所示的芹菜素类衍生物或其药学上可接受的盐类以及一种或多种药用载体或赋形剂。
最后，本发明还提供式I所示的芹菜素类衍生物或其药学上可接受的盐类用于制备降尿酸药物的应用。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明目标化合物可通过如下合成路线制备：
芹菜素在碳酸钾存在下，与氯甲基甲醚反应，经分离纯化得到7-甲氧基亚甲氧基-5，4’-二羟基黄酮(i)。i在碳酸钾存在下与溴代羧酸酯反应，生成7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-O-烷酸酯黄酮(ii)。ii在盐酸作用下回流反应，得到4’-O-烷酸酯取代的芹菜素(iii)。iii在甲醇水的混合溶剂中，经碳酸钾碱水解，得到4’-O-烷羧基取代的目标化合物。
实施例1 5，7-二羟基-4’-(1-羧基甲氧基)黄酮(I-1)的合成
1.1 7-甲氧基亚甲氧基-5，4’-二羟基黄酮(i)的制备
在250mL三口烧瓶中加入50mL无水DMF，冰浴搅拌下，加入芹菜素10g(37mmol)，无水碳酸钾4.1g(29.6mmol)。氩气保护下，向反应体系中缓慢滴加2.97g(37mmol)氯甲基甲基醚，滴加完毕后移除冰浴，室温反应12小时。TLC监测反应。反应结束后，过滤除去碳酸钾，加50mL水，用稀盐酸调pH至中性。加乙酸乙酯萃取(100mL×3)。乙酸乙酯层依次用饱和氯化钠溶液洗、水洗，无水硫酸钠干燥。过滤除去无水硫酸钠，减压蒸除溶剂，得黄色固体粗品。粗品用硅胶拌样，用200-300目硅胶进行柱层析分离提纯，洗脱剂V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝8∶1，最终得到黄色固体4.5g，即7-甲氧基亚甲氧基-5，4’-二羟基黄酮(i)，产率：39％。熔点：226-228℃，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝3.41(3H，s)，5.33(2H，s)，6.45(1H，d，J＝1.96Hz)，6.83(1H，d，J＝1.96Hz)，6.88(1H，s)，6.93(2H，d， J＝8.72Hz)，7.97(2H，d，J＝8.72Hz)，10.41(1H，s)，12.96ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M+H]+C17H15O6计算值：315.0790，测量值：315.0863
1.2 7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黄酮(ii-1)的制备
在250mL三口烧瓶中加入50mL无水DMF，室温搅拌，加入化合物i 1g(3.18mmol)，无水碳酸钾0.35g(2.54mmol)。氩气保护下，向反应体系中缓慢滴加0.67g(3.18mmol)2-溴乙酸乙酯，滴加完毕后60℃反应12小时。TLC监测反应。反应结束后，过滤除去碳酸钾，加50mL水，用稀盐酸调pH至中性。加乙酸乙酯萃取(100mL×3)。乙酸乙酯层依次用饱和氯化钠溶液洗、水洗，无水硫酸钠干燥。过滤除去无水硫酸钠，减压蒸除溶剂，得黄色固体粗品。粗品用硅胶拌样，用200-300目硅胶进行柱层析分离提纯，洗脱剂V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝6∶1，最终得到黄色固体0.56g，即7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黄酮(ii-1)，产率：44％。
1.3 5，7-二羟基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黄酮(iii-1)的制备
在250mL圆底烧瓶中加入50mL甲醇，加入0.3g(0.75mmol)ii-1，磁力搅拌完全溶解，加入3N稀盐酸6mL。滴加完毕后，加热回流3小时。TLC监测反应。反应结束后，冷却至室温，加水50mL，静置，析出黄色絮状沉淀。过滤，真空干燥，得黄色固体0.23g，即5，7-二羟基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黄酮(iii-1)，产率86％。
1.4 5，7-二羟基-4’-(1-羧基甲氧基)黄酮(I-1)的制备
在250mL圆底烧瓶中加入50mL甲醇/水(4：1)混合溶剂，加入0.2g(0.61mmol)iii-1，磁力搅拌完全溶解后，加入0.84g(6.1mmol)碳酸钾，加热回流2小时。TLC监测反应。反应结束后，冷却至室温， 加水50mL。用2N的稀盐酸调pH至3-4，静置，析出黄色絮状沉淀。过滤，真空干燥，得黄色固体0.15g，即5，7-二羟基-4’-(1-羧基甲氧基)黄酮(I-1)，产率75％。熔点：292-294℃，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝4.82(2H，s)，6.20(1H，d，J＝2.24Hz)，6.51(1H，d，J＝2.24Hz)，6.89(1H，s)，7.10(2H，d，J＝8.96Hz)，8.03(2H，d，J＝8.96Hz)，10.88(1H，s)，12.92(1H，s)，13.15ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M+H]+C17H13O7计算值：329.0583，测量值：329.0657.
实施例2 5，7-二羟基-4’-(3-羧基丙氧基)黄酮(I-2)的合成
参照实施例1.2，用4-溴丁酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，与化合物i反应，得到7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-(3-乙氧羰基丙氧基)黄酮(ii-2)，产率：43％。
参照实施例1.3，将ii-2用3N盐酸脱去甲氧基亚甲基，得到5，7-二羟基-4’-(3-乙氧羰基丙氧基)黄酮(iii-2)，产率85％。
参照实施例1.4，iii-2用碳酸钾碱水解，得到I-2的黄色固体0.18g，即5，7-二羟基-4’-(3-羧基丙氧基)黄酮，产率90％。熔点：232-233℃，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝1.95-1.99(2H，m)，2.41(2H，t)，4.10(2H，t)，6.20(1H，d，J＝2.24Hz)，6.51(1H，d，J＝2.24Hz)，6.88(1H，s)，7.11(2H，d，J＝8.96Hz)，8.03(2H，d，J＝8.96Hz)，10.87(1H，s)，12.19(1H，s)，12.93ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]-C19H15O7计算值：355.0896，测量值：355.0827.
实施例3 5，7-二羟基-4，-(4-羧基丁氧基)黄酮(I-3)的合成
参照实施例1.2，用5-溴戊酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，与化合物i反应，得到7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-(4-乙氧羰基丁氧基)黄酮(ii-3)，产率：46％。
参照实施例1.3，将ii-3用3N盐酸脱去甲氧基亚甲基，得到5，7-二羟基-4’-(4-乙氧羰基丁氧基)黄酮(iii-3)，产率95％。
参照实施例1.4，iii-3用碳酸钾碱水解，得到I-3的黄色固体0.18g，即5，7-二羟基-4’-(4-羧基丁氧基)黄酮，产率90％。点：202-204℃， 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝1.64-1.68(2H，m)，1.74-1.78(2H，m)，2.30(2H，t)，4.09(2H，t)，6.20(1H，d，J＝2.24Hz)，6.51(1H，d，J＝2.24Hz)，6.88(1H，s)，7.11(2H，d，J＝8.96Hz)，8.03(2H，d，J＝8.96Hz)，10.87(1H，s)，12.00(1H，s)，12.94ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]-C20H17O7计算值：369.1053，测量值：369.0973.
实施例4 5，7-二羟基-4’-(5-羧基戊氧基)黄酮(I-4)的合成
参照实施例1.2，用6-溴己酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，与化合物i反应，得到7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-(5-乙氧羰基戊氧基)黄酮(ii-4)，产率：40％。
参照实施例1.3，将ii-4用3N盐酸脱去甲氧基亚甲基，得到5，7-二羟基-4’-(5-乙氧羰基戊氧基)黄酮(iii-4)，产率92％。
参照实施例1.4，iii-4用碳酸钾碱水解，得到I-4的黄色固体0.19g，即5，7-二羟基-4’-(5-羧基戊氧基)黄酮，产率95％。熔点：211-213℃，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝1.37-1.41(2H，m)，1.51-1.55(2H，m)，1.69-1.73(2H，m)，2.20(2H，t)，4.03(2H，t)，6.16(1H，d，J＝2.24Hz)，6.47(1H，d，J＝2.24Hz)，6.84(1H，s)，7.06(2H，d，J＝8.96Hz)，7.98(2H，d，J＝8.96Hz)，10.89(1H，s)，11.97(1H，s)，12.90ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]-C21H19O7计算值：383.1209，测量值：383.1138.
实施例5 5，7-二羟基-4，-(6-羧基己氧基)-黄酮(I-5)的合成
参照实施例1.2，用7-溴庚酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，与化合物i反应，得到7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-(6-乙氧羰基己氧基)黄酮(ii-5)，产率：36％。
参照实施例1.3，将ii-5用3N盐酸脱去甲氧基亚甲基，得到5，7-二羟基-4’-(6-乙氧羰基己氧基)黄酮(iii-5)，产率77％。
参照实施例1.4，iii-5用碳酸钾碱水解，得到I-5的黄色固体0.19g，即5，7-二羟基-4’-(6-羧基己氧基)黄酮，产率95％。熔点：192-193℃，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝1.29-1.35(2H，m)，1.36-1.40(2H，m)，1.46-1.50(2H，m)，1.68-1.69(2H，m)，2.18(2H，t)，4.03(2H，t)，6.16(1H，d，J＝2.24Hz)，6.47(1H，d，J＝2.24Hz)，6.83(1H，s)，7.06(2H，d，J＝8.96Hz)，7.98(2H，d，J＝8.96Hz)，10.81(1H，s)，11.99(1H，s)，12.90ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]-C22H21O7计算值：397.1366，测量值：397.1295.
实施例6 5，7-二羟基-4’-(7-羧基庚氧基)黄酮(I-6)的合成
参照实施例1.2，用8-溴辛酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，与化合物i反应，得到7-甲氧基亚甲氧基-5-羟基-4’-(7-乙氧羰基庚氧基)黄酮(ii-6)，产率：42％。
参照实施例1.3，将ii-6用3N盐酸脱去甲氧基亚甲基，得到5，7-二羟基-4’-(7-乙氧羰基庚氧基)黄酮(iii-6)，产率84％。
参照实施例1.4，iii-6用碳酸钾碱水解，得到I-6的黄色固体0.18g，即5，7-二羟基-4’-(7-羧基庚氧基)黄酮，产率90％。熔点：205-207℃，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝1.25-1.31(4H，m)，1.33-1.38(2H，m)，1.43-1.49(2H，m)，1.66-1.72(2H，m)，2.17(2H，t)，4.03(2H，s)，6.16(1H，d，J＝2.24Hz)，6.47(1H，d，J＝2.24Hz)，6.83(1H，s)，7.06(2H，d，J＝8.96Hz)，7.99(2H，d，J＝8.96Hz)，10.85(1H，s)，11.97(1H，s)，12.91ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]-C23H25O7计算值：413.1522，测量值：413.1598.
实施例7 对黄嘌呤氧化酶抑制活性的测定
在96孔酶标板上依次加入磷酸盐缓冲液(pH＝7.4，50mM，35μl)、黄嘌呤氧化酶(溶于上述磷酸盐缓冲液中，1U/L，30μl)以及被测样品(溶于含1％DMSO的上述磷酸盐缓冲液中，浓度0.02-200uM， 50μl)，37℃孵育15分钟。随后加入底物黄嘌呤(溶于上述磷酸盐缓冲溶液中，150mM，60μl)引发反应，37℃反应30分钟。加入稀盐酸(3N，25μl)以终止反应。用酶标仪测290nm波长下各孔吸光度。根据下列公式计算被测化合物在不同浓度下对酶的抑制率，用软件Origin 9.0计算被测化合物对酶的半数抑制浓度，亦即IC50.
样品组和空白对照组各分两小组，该两小组的区别在于黄嘌呤氧化酶孵育前加入酶或是终止反应后加入酶。每组重复三次。对照组以相同体积上述磷酸盐缓冲液替换被测样品。
式(1)
实施例8 对α-糖苷酶抑制活性的测定
在96孔酶标板上依次加入α-葡萄糖苷酶(溶于0.1M的pH＝6.8的磷酸盐缓冲液中，0.1U/mL，50μl)、被测样品(溶于含0.5％吐温-80的上述磷酸盐缓冲液中，50μl)，37℃孵育15分钟。随后加入底物4-硝苯基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷(溶于上述磷酸盐缓冲液中，5mM，50μl)引发反应，37℃10分钟。加入碳酸钠溶液(1.5M，50μl)以终止反应。用酶标仪测405nm波长下各孔吸光度。先测200uM浓度下，各化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，活性较好者进一步测IC50。同样根据公式3-1计算被测化合物在不同浓度下对酶的抑制率，以软件Origin 9.0计算拟合出被测化合物对酶的半数抑制浓度，亦即IC50。
样品组和空白对照组各分两小组，该两小组的区别在于黄嘌呤氧化酶孵育前加入酶或是终止反应后加入酶。每组重复三次。对照组以相同体积上述磷酸盐缓冲液替换被测样品。
式(2)
表1化合物对黄嘌呤氧化酶及α-糖苷酶的抑制作用
a半数抑制浓度
b每个值是三次重复试验的平均值。