一种生产莽草酸的重组菌株及其制备方法与应用与流程

文档序号:12346236阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重组大肠杆菌菌株,其特征在于,其自身不包含下述基因:aroK、aroL、tyrR与磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统操纵子(ptsHIcrr);其操纵子ptsHIcrr位点与基因tyrR位点包含了下述基因:aroG、aroB、tktA、aroE、glk、galP和ppsA,所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk、galP和ppsA转录表达由大肠杆菌内具有活性的启动子驱动,由大肠杆菌内具有活性的终止子终止。

2.如权利要求1所述重组大肠杆菌菌株,其特征在于,其出发菌株通过基因敲除的方法剔除基因aroK、aroL、tyrR与操纵子ptsHIcrr,所述出发菌株较佳地为基因aroL敲除菌株,更佳地为E.coli JW0379-1菌株。

3.如权利要求2所述重组大肠杆菌菌株,其特征在于,所述基因敲除的方法为通过在所述重组大肠杆菌菌株的出发菌株内表达重组系统进行敲除,所述重组系统为FLP/FRT和/或RED重组系统。

4.如权利要求1所述重组大肠杆菌菌株,其特征在于,所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk、galP和ppsA通过从生物体内分离或PCR扩增得到;和/或,所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk、galP和ppsA来自大肠杆菌;和/或,在所述ptsHIcrr位点整合有选自所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk、galP和ppsA中的任意1个、2个、3个、4个、5个或6个,在所述tyrR位点整合有剩下的基因。

5.如权利要求1所述重组大肠杆菌菌株,其特征在于,所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk和galP按该先后顺序排列位于所述ptsHIcrr位点,所述基因ppsA位于所述tyrR位点;和/或,所述大肠杆菌内具有活性的启动子为T7启动子;和/或,所述大肠杆菌内具有活性的终止子为T7终止子。

6.如权利要求1所述重组大肠杆菌菌株,其特征在于,其还包括含有所述基因aroG、aroB、tktA和aroE的载体。

7.一种制备如权利要求1-6中任一项所述重组大肠杆菌菌株的方法,其包括以下步骤:从所述重组大肠杆菌出发菌株中敲除基因aroK、aroL、tyrR和操纵子ptsHIcrr,在ptsHIcrr位点与tyrR位点整合基因aroG、aroB、tktA、 aroE、glk、galP和ppsA;所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk、galP和ppsA转录表达由大肠杆菌内具有活性的启动子驱动,由大肠杆菌内具有活性的终止子终止。

8.如权利要求7所述方法,其特征在于,所述ptsHIcrr位点整合有选自所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk、galP和ppsA中的任意1个、2个、3个、4个、5个或6个,在所述tyrR位点整合有剩下的基因。

9.如权利要求7或8所述方法,其特征在于,所述基因aroG、aroB、tktA、aroE、glk和galP按该顺序被整合到所述ptsHIcrr位点,所述基因ppsA被整合到所述tyrR位点。

10.如权利要求9所述方法,其特征在于,其包括下述步骤:

(1)从所述重组大肠杆菌出发菌株中敲除aroL与aroK基因,获得敲除菌株(△aroLaroK);所述重组大肠杆菌出发菌株较佳地为aroL基因被敲除的菌株,更佳地为大肠杆菌JW0379-1菌株;

(2)从步骤(1)所述敲除菌株(△aroLaroK)中敲除ptsHIcrr操纵子,得敲除菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr);

(3)将大肠杆菌内具有活性的启动子和终止子连同所述基因aroG、aroB、tktA和aroE整合到步骤(2)所述敲除菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr)的所述ptsHIcrr位点,得整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAE);

(4)将大肠杆菌内具有活性的启动子和终止子连同所述基因glk和galP整合到步骤(3)所述整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAE)的所述ptsHIcrr位点,得整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAEKP);

(5)从步骤(4)中所述整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAEKP)中敲除tyrR基因,得整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAEKP,△tyrR);

(6)将大肠杆菌内具有活性的启动子连同所述基因ppsA整合到步骤(5)所述整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAEKP,△tyrR)的所述tyrR位点,得整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAEKP,△tyrR::ppsA)。

11.如权利要求10所述方法,其特征在于,所述步骤(1)还包括:将 T7噬菌体基因组整合到所述敲除菌株(△aroLaroK)上,得敲除菌株(△aroLaroK,DE3);和/或,所述方法还包括步骤(7):将含有所述基因aroG、aroB、tktA和aroE的载体转化到步骤(6)所述整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAEKP,△tyrR::ppsA)中,得整合菌株(△aroLaroK,△ptsHIcrr::GBAEKP,△tyrR::ppsA)/pGBAE。

12.一种制备莽草酸的方法,其特征在于,其包括以下步骤:发酵培养如权利要求1-8任一项所述重组大肠杆菌菌株,从培养液获得莽草酸;所述发酵培养的培养基中葡萄糖与甘油的质量比为1∶5~5∶1,较佳地为2∶3~3∶2,更佳地为1∶1。

13.如权利要求12所述方法,其特征在于,其包括下述步骤:挑取如权利要求1-6任一项所述重组大肠杆菌菌株,接种LB培养基,37℃过夜培养,按1%接种量再接种LB培养基,所述百分比为占所述LB培养基体积的体积百分比,37℃培养8小时,再按5%接种量接种至含有2.5升所述发酵培养的培养基的5升发酵罐中进行发酵,所述百分比为占所述发酵培养的培养基体积的体积百分比,发酵温度为30℃,空气通量为4~6升/分钟,溶氧浓度为10~50%,较佳地为30%,发酵液pH为7.0;发酵6小时时加入5克/升甘油、10克/升酵母浸出粉FM888及5克/升胰蛋白胨FP318,8小时开始流加400克/升葡萄糖溶液使葡萄糖含量为5~15克/升。

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