本发明通常涉及包含一个或多个热不稳定的部分的化合物，包含所述化合物的组合物，制备所述化合物和组合物的方法以及使用所述化合物和组合物的方法。
发明背景
可以在温和条件下被去除的分子部分对于宽范围的化合物的合成和作用是重要的。因此，科学家已经进行了针对此类化合物的发现和使用的大量研究，包括针对复杂的合成方法中使用的保护基团的工作。
例如，标题为“作为核苷-氨基保护基团的5-戊烯酰基部分、4-戊烯酰基-受保护的核苷酸合成子及相关寡核苷酸合成”的USP5,614,622，在1997年3月25日公布。专利的讨论的发明据称涉及下述：“本发明提供合成寡核苷酸的新方法，其允许在比现有方法更温和的条件下进行寡核苷酸的脱保护。本发明还提供了核苷碱基保护基团以及具有此类碱基保护基团的核苷合成子，所述核苷碱基保护基团在寡核苷酸合成条件下是稳定的，但其可以在比现有保护基团更温和的条件下被去除。”说明书摘要。
另一实例，标题为“热不稳定的磷保护基团、相关中间体及使用方法”的USP 6,762,298，在2004年7月13日公布。专利的讨论的发明据称涉及下述：“本发明提供热脱保护寡核苷酸的核苷间磷键合的方法，所述方法包括在基本中性pH下，在流体介质中加热受保护的寡核苷酸，以便使寡核苷酸脱保护。本发明还提供了使用上述热脱保护方法合成寡核苷酸的方法，以及并入根据本发明使用的热不稳定保护基团的新的寡核苷酸和中间体。”说明书摘要。
另一实例，标题为“热不稳定的羟基保护基团及使用方法”的USP 7,355,037，在2008年4月8日公布。专利的讨论的发明据称涉及下述：“提供了式R--O—Pg的羟基-受保护的醇，其中Pg为下式的保护基团：
其中Y、Z、W、R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、a、b、c、d、e和f在本文进行定义，以及R为核苷基、具有2至约300个核苷的寡核苷酸基或者具有2至约300个核苷的寡聚物。还提供了脱保护方法，其包括在从羟基-受保护的醇有效热裂解羟基-保护基团的温度下，加热所述羟基-受保护的醇。“说明书摘要。
另一实例，标题为“热引发核酸扩增的化学修饰的核苷5'-三磷酸”的USP 8,133,669，在2012年3月13日公布。专利的讨论的发明据称涉及下述：“本文提供了用于核酸复制的方法和组合物。这些方法涉及在核酸复制反应中使用3'-取代的核苷5'-三磷酸或3'-取代的终止引物。在某些方面，该方法通过使用在核酸复制中提供实用性的3'-取代的NTP和/或3'-取代的终止引物来实现。在优选的实施方案中，用特定的热不稳定的化学基团，如醚、酯或碳酸酯取代NTP和/或引物的3'-位。”说明书摘要。
尽管已经对可以在温和条件下去除的分子部分进行了研究，但本领域仍需要新的分子部分以及相关的组合物和方法。
发明概述
在一方面，本发明涉及结构XO-CH2-SM-B-A的化合物。取代基X为H、酸不稳定的保护基团、固体载体、-P(O-R1)NR2R3、-P(O)(OH)H、-P(O)(OR1)H、-P(O)(OH)2、-P(O)(OH)O-P(O)(OH)OP(O)(OH)2或它们的盐。取代基R1为CNE、烷基或杂烷基，以及R2和R3独立地为烷基。取代基SM为不是天然呋喃糖基的糖部分或其类似物，B为碱基部分或其类似物，以及A为与结构–C(O)OR4的碱基部分之上或之内的氮连接的部分，其中R4为叔烷基。
附图简述
图1为用于合成聚合物(例如，DNA寡聚物)的仪器的示意图。
发明详述
本发明通常涉及包含一个或多个热不稳定的保护基团的化合物，包含所述化合物的组合物，制备所述化合物和组合物的方法以及使用所述化合物和组合物的方法。
“连接物”通常为使用亲电或亲核官能团在两端终止的烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。此类官能团的非限制性实例包括：-C(O)-、-C(O)N(H)-、-C(O)N(R21)-、-C(O)O-、-N(R22)-、-O-、-S-，其中R21和R22独立地为烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。连接物的非限制性实例包括：-C(O)CH2OC6H5OCH2C(O)-；-C(O)-(CH2)n-C(O)，其中n为0、1、2、3、4或5；-C(O)-(CH2)n-N(H)-，其中n为1、2、3、4或5；-C(O)-(CH2)n-O-，其中n为1、2、3、4或5；以及-N(H)-(CH2)n-N(H)-，其中n为1、2、3、4或5。
“标签”为能够被检测(例如，光学地、电子地、磁力地和化学地)的部分。标签类别的非限制性实例包括：荧光染料；荧光淬灭分子；用于金属配位的螯合剂；膜溶性剂(例如，胆固醇)；嵌入剂(例如，吖啶)；DNA小沟结合剂；以及叠氮化物和炔烃(例如，点击化学)。
荧光染料类型的非限制性实例包括：吖啶染料；花菁染料(例如，SYBR green)；荧光酮染料(例如，荧光素)；噁嗪染料(例如，尼罗蓝、尼罗红)；菲啶染料；和罗丹明染料(例如，德克萨斯红(Texas Red))。荧光染料的非限制性实例包括：FAM；TET；Alexa Fluor 488；CAL Fluor Gold 540；HEX；CAL Fluor Orange 560；Quasar 470；5-TAMRA；CA L Fluor Red 590；Cy3；T(Rox)；CAL Fluor Red 610；CAL Fluor Red 635；T(JOE)；Cy5；Quasar 670；Quasar 705。
荧光淬灭分子的非限制性实例包括：BHQ-1；BHQ-2；DABCYL；Pulsar 650。
“固体载体”为固相聚合物合成中使用的材料。通常，将单体与固体载体直接地或通过连接物共价结合，以及通过随后添加其它单体使聚合物链在该固体载体上生长。寡核苷酸合成在非膨润性或低膨润性的固体载体上进行地最好。寡核苷酸合成最常用的固体载体为可控孔度玻璃(CPG)和聚苯乙烯(例如，多孔的聚苯乙烯)。
“含磷部分”为包含至少一个磷原子的化学基团。含磷部分的非限制性实例包括：-P(OR23)NR24R25；-P(＝O)(OR23)NR24R25；-P(OH)2；-P(OR23)OH；-P(O)(OR23)OH；-P(O)(OH)2；-P(O)(OH)OP(O)(OH)2；-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2；-P(S)(OH)2；以及前述化合物的盐。R23为烷基(例如，-CH3)、取代的烷基(例如，-CH2CH2-EWG，其中“EWG”为吸电子基团，如-CN或-Ph-NO2)、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。R24和R25独立地为烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；或组合以形成环状、稠合、稠合环状或杂环状环。
对于磷试剂的讨论，参见：Beaucage,S.L.；Caruthers M.H.(1981)."Deoxynucleoside phosphoramidites—A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis".Tetrahedron Letters 22:1859–1862；Lin,K.-Y.,Matteucci,M.D.(1998)."A cytosine analog capable of clamp-like binding to a guanine in helical nucleic acids".J.Amer.Chem.Soc.120(33):8531–8532；Nielsen,J.；Marugg,J.E.；Taagaard,M.；Van Boom,J.H.；Dahl,O.(1986)."Polymer-supported synthesis of deoxyoligonucleotides using in situ prepared deoxynucleoside2-cyanoethyl phosphoramidites".Rec.Trav.Chim.Pays-Bas 105(1):33–34；Nielsen,J.；Taagaard,M.；Marugg,J.E.；Van Boom,J.H.；Dahl,O.(1986)."Application of 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite for in situ preparation of deoxyribonucleoside phosphoramidites and their use in polymer-supported synthesis of oligodeoxyribonucleotides".Nucl.Acids Res.14(18):7391–7403；Nielsen,J.；Marugg,J.E.；Van Boom,J.H.；Honnens,J.；Taagaard,M.；Dahl,O.(1986)."Thermal instability of some alkyl phosphorodiamidites".J.Chem Res.Synopses(1):26–27；Nielsen,J.；Dahl,O.(1987)."Improved synthesis of 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite(iPr2N)2POCH2CH2CN)".Nucl.Acids Res.15(8):3626；Beaucage,S.L.(2001)."2-Cyanoethyl Tetraisopropylphosphorodiamidite".e-EROS Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis；Sinha,N.D.；Biernat,J.；Koester,H.(1983)."β-Cyanoethyl N,N-dialkylamino/N-morpholinomonochloro phosphoamidites,new phosphitylating agents facilitating ease of deprotection and work-up of synthesized oligonucleotides".Tetrahedron Lett.24(52):5843–5846；Marugg,J.E.；Burik,A.；Tromp,M.；Van der Marel,G.A.；Van Boom,J.H.(1986)."A new and versatile approach to the preparation of valuable deoxynucleoside 3'-phosphite intermediates".Tetrahedron Lett.24(20):2271–22274；Guzaev,A.P.；Manoharan,M.(2001)."2-Benzamidoethyl group-a novel type of phosphate protecting group for oligonucleotide synthesis".J.Amer.Chem.Soc.123(5):783–793；Sproat,B.；Colonna,F.；Mullah,B.；Tsou,D.；Andrus,A.；Hampel,A.；Vinayak,R.(1995年2月)."An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides".Nucleosides&Nucleotides 14(1&2):255–273；Stutz,A.；Hobartner,C.；Pitsch,S.(2000年9月)."Novel fluoride-labile nucleobase-protecting groups for the synthesis of3'(2')-O-amino-acylated RNA sequences".Helv.Chim.Acta 83(9):2477–2503；Welz,R.；Muller,S.(2002年1月)."5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazole as activator for 2'-O-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis".Tetrahedron Letters43(5):795–797；Vargeese,C.；Carter,J.；Yegge,J.；Krivjansky,S.；Settle,A.；Kropp,E.；Peterson,K.；Pieken,W.(1998).Nucl.Acids Res.26(4):1046–1050；Gacs-Baitz,E.；Sipos,F.；Egyed,O.；Sagi,G.(2009)."Synthesis and structural study of variously oxidized diastereomeric5'-dimethoxytrityl-thymidine-3'-O-[O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl]-p hosphoramidite derivatives.Comparison of the effects of the P＝O,P＝S,and P＝Se functions on the NMR spectral and chromatographic properties.".Chirality 21(7):663–673；M.J.；Ogilvie,K.K.(1980)."Phosphoramidate analogs of diribonucleoside monophosphates.".Tetrahedron Lett.21(43):4153–4154；Wilk,A.；Uznanski,B.；Stec,W.J.(1991)."Assignment of absolute configuration at phosphorus in dithymidylyl(3',5')phosphormorpholidates and-phosphormorpholidothioates.".Nucleosides&Nucleotides 10(1-3):319–322。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
“保护基团”为在合成操作期间通常用于掩蔽反应性官能团的化学部分。保护基团的非限制性类别包括：酸不稳定的保护基团；碱不稳定的保护基团；还原不稳定的保护基团；对光不稳定的保护基团；以及热不稳定的保护基团。
酸不稳定的保护基团的非限制性实例包括：三苯甲基；单甲氧基三苯甲基；4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)；β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)；甲氧基甲基醚(MOM)；甲硫基甲基醚；四氢吡喃基(THP)；4-甲氧基四氢吡喃-4-基；四氢呋喃基(THF)；叔丁氧基羰基(Boc)；硅醚(例如，三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)。硅醚也为氟化物离子不稳定的。
碱不稳定的保护基团的非限制性实例包括：苯甲酰基和其它芳基羧酸酯(盐)衍生物；乙酰基和其它烷基羧酸酯(盐)衍生物；烷基-或芳基氧基乙酸酯(盐)；三卤代乙酸酯(盐)；二卤代乙酸酯(盐)；酰氧基甲基醚；芴基甲基氧基羰基(FMOC)；氰乙基；取代的烷基，如–CH2CH2-EWG，其中“EWG”为吸电子基团，如–PhNO2或–C(O)-；氰乙基氧基羰基。还原不稳定的保护基团的非限制性实例包括：苄基和取代的类似物；苄氧基羰基(Z)；烯丙氧基羰基。对光不稳定的保护基团的非限制性实例包括：邻硝基苄基醚和取代的衍生物；邻硝基苄基氨基甲酸酯。热不稳定的保护基团的非限制性实例包括：叔丁氧基乙基醚(羟基)；4-氧代烷基酯；3-酰基氨基丙基酯；4-羧基丙基酯的酰胺和酯；5-烷硫基烷基酯。
“烷基”为具有通式CnH2n+1的化学部分。烷基通常为下述类别：低级烷基；高级烷基；环烷基；以及支链烷基。低级烷基具有6个或更少的碳原子。非限制性实例包括：甲基；乙基；丙基；丁基；和戊基。高级烷基具有7个或更多个碳原子。非限制性实例包括：庚基；辛基；壬基。环烷基为形成环结构的烷基，并且为式CnH2n-1。非限制性实例包括：环丙基；环丁基；环戊基；和环己基。支链烷基为其中一个或多个氢原子被烷基取代的烷基链(即，直链的)。非限制性实例包括：异丙基；仲丁基；和叔丁基。
“杂烷基”为其中一个或多个碳原子被杂原子(例如，O、S、NH)替换的烷基。非限制性实例包括：-CH2OCH3；-CH2CH2OCH3；-NC4H8O(吗啉代)。
“取代的烷基”为其中一个或多个氢原子被官能团替换的烷基。官能团的非限制性实例包括下述：其中R26、R27和R28独立地为烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基：-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR26；-NR27R28；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR29；-OC(O)OR29；-C(O)NH2；-C(O)NHR26；-C(O)NR26R27；-OC(O)NHR26；-OC(O)NR26R27；-NHC(O)NHR26；-NHC(O)NR26R27，其中R26、R27、R28和R29独立地为烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；-F；-Cl；-Br；-I；-Ar，其中“Ar”为芳基；-Ar-X，其中“Ar-X”为取代的芳基；-HAr，其中“-HAr”为杂芳基；以及-HAr-X，其中“-HAr-X”为取代的杂芳基。
“取代的杂烷基”为其中一个或多个氢原子被官能团替换的杂烷基，其中R30、R31、R32和R33独立地为烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基：-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR30；-NR31R32；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR33；-OC(O)OR33；-C(O)NH2；-C(O)NHR30；-C(O)NR31R32；-OC(O)NHR31；-OC(O)NR31R32；-NHC(O)NHR31；-NHC(O)NR31R32；-F；-Cl；-Br；-I。
“芳基”为以下结构：
“取代的芳基”为以下结构：
其中R34、R35、R36、R37和R38独立地选自H、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基；-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR39；-NR40R41；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR42；-OC(O)OR42；-C(O)NH2；-C(O)NHR39；-C(O)NR40R41；-OC(O)NHR39；-OC(O)NR40R41；-NHC(O)NHR39；-NHC(O)NR40R41；-F；-Cl；-Br；-I；其中R39、R40、R41和R42独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；条件是R34、R35、R36、R37和R38中的至少一个不是H。
“杂芳基”为芳香族杂环。杂芳基的非限制性实例包括：
其中R39选自烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基。
“取代的杂芳基”为具有一个或多个选自以下的取代基的杂芳基：H、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基；-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR43；-NR44R45；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR46；-OC(O)OR46；-C(O)NH2；-C(O)NHR43；-C(O)NR44R45；-OC(O)NHR43；-OC(O)NR44R45；-NHC(O)NHR43；-NHC(O)NR44R45；-F；-Cl；-Br；-I；其中R43、R44、R45和R46独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
本发明的化合物为结构XO-CH2-SM-B-A。取代基“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐。“SM”为糖部分或糖部分的类似物。“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物。“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基。
对于核苷合成的讨论，参见：Vorbrüggen,H.；Ruh-Polenz,C.Org.React.2000,55,1；Diekmann,E.；Friedrich,K.；Fritz,H.-G.J.Prakt.Chem.1993,335,415；Fischer,E.；Helferich,B.Chem.Ber.1914,47,210；Miyaki,M.；Shimizu,B.Chem.Pharm.Bull.1970,18,1446；Kazimierczuk,Z.；Cottam,H.B.；Revankar,G.R.；Robins,R.K.J.Am.Chem.Soc.1984,106,6379；Wittenburg,E.Z.Chem.1964,4,303；Choi,W-B.；Wilson,L.J.；Yeola,S.；Liotta,D.C.；Schinazi,R.F.J.Am.Chem.Soc.1991,113,9377；Vorbrüggen,H.；Niedballa,U.；Krolikiewicz,K.；Bennua,B.；G.In Chemistry and Biology of Nucleosides and Nucleotides；Harmon,R.E.,Robins,R.K.,Townsend,L.B.,Eds.；Academic:New York,1978；p.251；Prystas,M.；F.Collect.Czech.Chem.Commun.1964,29,121；Niedballa,U.；Vorbrüggen,H.J.Org.Chem.1974,39,3668；Itoh,T.；Melik-Ohanjanian,R.G.；Ishikawa,I.；Kawahara,N.；Mizuno,Y.；Honma,Y.；Hozumi,M.；Ogura,H.Chem.Pharm.Bull.1989,37,3184；Vorbrüggen,H.；Bennua,B.Tetrahedron Lett.1978,1339；Vorbrüggen,H.；Bennua,B.Chem.Ber.1981,114,1279；Sugiura,Y.；Furuya,S.；Furukawa,Y.Chem.Pharm.Bull.1988,36,3253；Kawasaki,A.M.；Wotring,L.L.；Townsend,L.B.J.Med.Chem.1990,33,3170；Nair,V.；Purdy,D.F.Heterocycles 1993,36,421；Hanrahan,J.R.；Hutchinson,D.W.J.Biotechnol.1992,23,193；Martin,O.R.Tetrahedron Lett.1985,26,2055；Langer,S.H.；Connell,S.；Wender,I.J.Org.Chem.1958,23,50；Patil,V.D.；Wise,D.S.；Townsend,L.B.J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1 1980,1853；Vorbrüggen,H.；Krolikiewicz,K.；Bennua,B.Chem.Ber.1981,114,1234。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
糖部分通常为戊呋喃糖基部分。此类部分的非限制性实例包括(其中，显示了化合物的XOCH2-、B和A)：
其中上文结构1和结构2的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
糖部分的类似物通常为天然呋喃糖基部分的似物。
此类部分的非限制性实例包括：
其中上文结构3和结构4的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中上文结构5和结构6的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构7和结构8的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中上文结构9和结构10的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中上文结构11和结构12的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1,其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构13和结构14的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构15和结构16的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构17和结构18的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；以及R4和R5独立地为H、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构19和结构20的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构21和结构22的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构23和结构24的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构25和结构26的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构27和结构28的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Z为H、OH或OR3，其中R3为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构29和结构30的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构31和结构32的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构31和结构32的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；以及Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构33和结构34的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；“R6”为烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；“m”和“o”独立地为0、1或2。
其中结构35和结构36的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；“R6”为烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构37和结构38的取代基为：“X”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”为H、保护基团、在氧与固体载体之间任选地包含连接物的固体载体、含磷部分或它们的盐；Y为OH或OR2，其中R2为保护基团、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基；“R6”为烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
其中结构39的取代基为：“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；R7为H、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基或保护基团；R8为OH、卤化物、OR9、NR10R11，其中R9为烷基、取代的烷基、芳基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基，以及其中R10和R11独立地为H、烷基、取代的烷基、芳基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基或取代的芳基。
核碱基部分的非限制性实例包括：
其中上文结构40和结构41中的取代基“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
其中上文结构42和结构43中的取代基“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
其中上文结构44和结构45中的取代基“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
其中上文结构46和结构47中的取代基“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
核碱基类似物部分的非限制性实例包括：
其中“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；其中“M”为N或CR13，其中R13为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基；以及其中R12为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基。
其中上文结构50和结构51中的取代基为：“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；其中“M”为N或CR13，其中R13为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基；以及其中R12为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基。
其中上文结构52和结构53中的取代基为：“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中R12为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基。
其中上文结构54和结构55中的取代基为：“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中R12为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基。
其中上文结构56和结构57的取代基为：“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中“M”、“D”和“E”独立地为N或CR13，其中R13为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基。
其中结构58和结构59中的取代基为：“A”为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中“M”、“D”和“E”独立地为N或CR13，其中R13为H、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15独立地为H或烷基。
对于核苷类似物的讨论，参见：Merino,P.(编辑)(2013)Chemical Synthesis of Nucleotide Analogues,Pedro Marino,Wiley Publishers；USP 7,427,672；Prakash,T等人.J.Med.Chem.2010,53,1636-1650。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
部分“A”为结构–C(O)R1，其中R1为叔烷基。叔烷基为其中碳原子与三个基团(即，-CR16R17R18)共价结合的叔烷基，其中R16、R17和R18独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基和取代的杂烷基。通常，取代基R16、R17和R18以与中心碳原子直接结合的CH2或CH3(例如，-C(CH3)2(CH2CH3)终止。叔烷基的非限制性实例包括：-C(CH3)3；-C(CH3)2(CH2CH3)；-C(CH3)(CH2CH3)(CH2CH2CH3)；-C(R19)(R20)-连接物-标签；和-C(R19)(R20)-连接物-[固体载体]，其中R19和R20独立地选自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
–C(R19)(R20)-连接物-标签的非限制性实例包括：
其中上文结构60中的取代基为：R19和R20独立地选自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
其中上文结构61中的取代基为：R19和R20独立地选自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
其中上文结构62中的取代基为：R19和R20独立地选自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
其中上文结构63中的取代基为：R19和R20独立地选自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
-C(R19)(R20)-连接物-[固体载体]的非限制性实例包括：
其中上文结构64和结构65中的取代基为：R19和R20独立地选自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2；CPG为可控孔度玻璃；以及PS为聚苯乙烯。
在一个实例中，当SM为以下结构时，
其中上文结构66的取代基为：Y为–OP(O-CNE)ONR51R52或–OP(O)(OH)H或它们的盐，其中R51和R52独立地选自烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，或者R51和R52一起形成杂环(例如，吡咯烷)，则X为酸不稳定的保护基团或固体载体，Z为H或OR53，以及R53为羟基保护基团。
在另一实例中，当SM为以下结构时，
其中上文结构67的取代基为：X为–P(O-CNE)(NR51R52)或–P(O)(OR53)H或它们的盐，其中R51和R52独立地选自烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，或者R51和R52一起形成杂环(例如，吡咯烷)，以及其中R53为烷基、取代的烷基、芳基或取代的烷基，则Y为酸不稳定的羟基保护基团或固体载体，以及Z为H。
在另一实例中，当SM为以下结构时
其中上文结构68的取代基为：X为–P(O)(OR53)H或–P(O)(OH)O[P(O)(O-)(O-)]nH或它们的盐，其中R53为烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，其中n＝0、1或2，则Y为OH或OR54，其中R54为热不稳定的羟基保护基团，以及Z为H、-OH或OR54。
本发明的化合物的非限制性实例包括下述：
其中上文结构69和结构70的取代基为：“X”为–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它们的盐，以及其中“Z”为-H或–OH。
其中上文结构71和72的取代基为：“X”为–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它们的盐，以及其中“Z”为-H或–OH。
其中上文结构73和结构74的取代基为：“X”为–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它们的盐，以及其中“Z”为-H或–OH。
其中上文结构75和结构76的取代基为：“X”为–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它们的盐，以及其中“Z”为-H或–OH。
本发明还涉及寡核苷酸及其盐，其包括结构–O-CH2-SM(-O-)B-A的一个或多个核苷酸或核苷酸类似物，其中“SM”为糖部分或糖部分的类似物；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR60，其中R60为叔烷基。
对于寡核苷酸合成的讨论，参见：Ellington,A.和Pollard,J.D.2001.Introduction to the Synthesis and Purification of Oligonucleotides.Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.00:A.3C.1–A.3C.22；Beaucage,S.L.和Reese,C.B.2009.Recent Advances in the Chemical Synthesis of RNA.Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.38:2.16.1–2.16.31；Tsukamoto,M.和Hayakawa,Y.2005.“Strategies useful for the Chemical Synthesis of Oligonucleotides and Related Compounds.”Frontiers in Organic Chemistry,Bentham Science Publishers,第1卷。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
在一个方面，寡核苷酸为下述结构：
其中上文结构77的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物，或寡核苷酸；“SM”为糖部分或糖部分的类似物；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR60，其中R60为叔烷基。
在另一方面，寡核苷酸为下述结构(或它们的盐)之一：
其中上文结构78和结构79的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR1，其中R1为叔烷基。
在另一方面，寡核苷酸为下述结构(或它们的盐)之一：
其中上文结构80和结构81的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)；
其中上文结构82和结构83的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)；
其中上文结构84和结构85的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)；
其中上文结构86的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)；
其中上文结构87和结构88的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)。
其中上文结构89和结构90的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)。
其中上文结构91和结构92的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)。
其中上文结构93的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)。
在另一方面，寡核苷酸包含上文所示结构的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个核苷酸或核苷酸类似物。
本发明还涉及某些治疗性核苷酸、核苷酸类似物、核苷和核苷类似物。治疗性核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物为可以被用于治疗疾病(例如，HCV)的治疗性核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物，其中化合物包含核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物以及一个或多个热不稳定的保护基团，其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
对于治疗性核苷酸、核苷酸类似物、核苷和核苷类似物的讨论，参见：Lars Petter Jordheim等人Nature Reviews Drug Discovery,447-464(2013)；Squires,K.Antivir.Ther.2001；6Suppl 3:1-14；USP 8,664,386；USP 8,658,617；USP 8,642,756；USP 8,633,309；USP 8,629,263；USP 8,618,076；USP 8,580,765；USP 8,569,478；USP 8,563,530；USP 8,551,973。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
在一个方面，治疗性核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物为下述结构之一：
其中上文结构94和结构95的取代基为：A1、A2和A3独立地为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构96和结构97的取代基为：A1、A2和A3独立地为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构98和结构99的取代基为：A1、A2和A3独立地为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构100和结构101的取代基为：A1和A3独立地为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构102和结构103的取代基为：A1、A2和A3独立地为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构104和结构105的取代基为：A1、A2和A3独立地为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构106和结构107的取代基为：A3为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构108和结构109的取代基为：A1、A2和A3独立地为H或热不稳定的保护基团，以及其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B为核碱基或核碱基类似物。
在另一方面，治疗性核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物为下述结构之一：
本发明还涉及治疗性寡核苷酸(或它们的盐)。治疗性寡核苷酸为可以被用于治疗疾病(例如，CMV)的治疗性寡核苷酸，其中化合物包含含有一个或多个热不稳定的保护基团的寡核苷酸(例如，福米韦生(Fomivirsen)、米泊美生(Mipomersen))。热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
治疗性寡核苷酸通常为下述结构(或它们的盐)：
其中上文结构116的取代基为：PL1和PL2独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及Nu1和Nu2独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)。“SM“为糖部分或糖部分的类似物；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物；“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR60，其中R60为叔烷基。
对于治疗性寡核苷酸的讨论，参见：Yogesh S.Sanghvi Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,4.1.1-4.1.22,2011年9月；Goodchild,J.Methods Mol.Biol.2011；764:1-15；USP 8,697,675。将前述参考文献为了所有目的通过引用并入本文件中。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸-标签缀合物(或它们的盐)。寡核苷酸-标签缀合物包含下述结构中的一种或多种核苷酸或核苷酸类似物：
其中上文结构117的取代基为：L1和L2独立地为H、核苷酸、核苷酸类似物和标签，其中可以有将所述标签与其在核苷酸或核苷酸类似物之上的位置进行连接的连接基团；L3为H、-C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)或标签，其中可以有将所述标签与其在核苷酸或核苷酸类似物之上的位置进行连接的连接基团。如果标签不是L1、L2或L3，则其与寡核苷酸的另一核苷酸连接。“SM”为糖部分或糖部分的类似物；“B”为核碱基部分或核碱基部分的类似物。
对于寡核苷酸-标签缀合物的讨论，参见USP 5,583,236；USP 8,530,634；Durrant,Ian等人.Methods in Molecular Biology,第31卷(1994),163-175。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
在另一方面，本发明涉及合成寡核苷酸(或它们的盐)的方法。所述方法包括下述步骤：
1)将化合物与固体载体直接地或通过连接物偶联，其中所述化合物为下述结构之一：
其中上文结构118和结构119的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)以提供下述结构之一的固体载体化合物：
其中上文结构120和结构121的取代基为：L1为连接物或无化学实体，以及S1为固体载体；“P1”为保护基团(例如，DMT)，“B”为核碱基或核碱基类似物，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
2)使固体载体化合物脱保护以提供下述结构之一的脱保护的化合物：
其中上文结构122和结构123的取代基为：L1为连接物或无化学实体，以及S1为固体载体；“B”为核碱基或核碱基类似物，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
3)使脱保护的化合物与包含含磷原子的部分的化合物反应，其中所述化合物为下述结构之一：
其中上文结构124和结构125的取代基为：“PM”为含磷部分，“P1”为保护基团(例如，DMT)；“B”为核碱基或核碱基类似物；“SM”为糖部分或糖部分的类似物；以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，
以提供下述结构之一的二核苷酸；
其中上文结构126和结构127的取代基为：“PM*”为反应之后的含磷部分，L1为连接物或无化学实体，S1为固体载体，“P1”为保护基团(例如，DMT)，“B”为核碱基或核碱基类似物，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
4)任选地，化学修饰含磷部分以提供下述结构之一的修饰的二聚体：
其中上文结构128和结构129的取代基为：“PM**”为化学修饰的含磷部分，L1为连接物或无化学实体，S1为固体载体，“P1”为保护基团(例如，DMT)，“B”为核碱基或核碱基类似物，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或-C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
5)任选地，脱保护二聚体或修饰的二聚体以提供下述结构之一的脱保护的二聚体或修饰的二聚体：
其中上述结构130、结构131、结构132和结构133的取代基为：“PM*”为用以提供二聚体的反应之后的含磷部分，“PM**”为化学修饰的含磷部分，L1为连接物或无化学实体，S1为固体载体，“B”为核碱基或核碱基类似物，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
6)任选地，重复步骤“3”和“4”以提供下述结构之一的寡聚物或修饰的寡聚物：
其中上文结构134、结构135、结构136和结构137的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，“PM*”为用以提供寡聚物的反应之后的含磷部分，“PM**”为化学修饰的含磷部分，“L1”为连接物或无化学实体，“S1”为固体载体，“B”为核碱基或核碱基类似物，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60。其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；“n”为1至200(例如，1至25、1至50、1至75、1至100等)的整数；
7)使二聚体、修饰的二聚体、寡核苷酸或修饰的寡核苷酸脱保护，将其从固体载体去除，以及化学修饰PM*或PM**部分以提供下述结构的化合物：
其中上文结构138的取代基为：“Q”为O或S，以及其中“n”为1至200(例如，1至25、1至50、1至75、1至100等)的整数，其中至少一个“A1”为–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物。
在一个实例中，上述方法的步骤“1”中的与固体载体偶联的化合物为下述结构之一：
其中上文结构139和结构140的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“A1”为–H或–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在另一实例中，上述方法的步骤“1”中的与固体载体偶联的化合物为下述结构之一：
其中上文结构139和结构140的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，以及“A1”为–H或–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文结构141和结构142的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，以及“A1”为–H或–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在一个实例中，上述方法的步骤“2”中的脱保护的结构为下述结构之一：
其中上文结构143和结构144的取代基为：“B”为核碱基或核碱基类似物，“A1”为–H或–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学实体，以及S1为固体载体。
在一个实例中，上述方法的步骤“2”中的脱保护的结构为下述结构之一：
其中上文结构145和结构146的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，“A1”为–H或–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体；或
其中上文结构147和结构148的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，“A1”为–H或–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体。
在一个实例中，上述方法的步骤“3”中的包含含磷原子的部分的化合物为下述结构之一：
其中上文结构149和结构150的取代基为：“P1”为保护基团(例如，DMT)，其中“A1”为–H或–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“PM”为选自下述部分之一的含磷部分：
其中上文结构151、结构152、结构153、结构154和结构155的取代基为：“P2”和“P3”独立地为保护基团(例如，Bn、-CH2CH2SC(O)Ph)，以及其中“EWG”为吸电子基团(例如，-CN、-NO2)，以及其中R61和R62为烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基，或者和与磷原子结合的氮原子一起形成杂环(例如，吡咯烷、哌啶)。
在一个实例中，上述方法的步骤“5”中的脱保护的、修饰的二聚体为下述结构之一：
其中“A1”为-H或-C(O)OR4，以及其中R4为叔烷基(例如-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及其中“PM**”为例如选自下述部分之一的含磷部分：-P(O)(O-)；-P(S)(O-)；-P(O)(-CH2CH2-EWG)-；-P(S)(-CH2CH2-EWG)-，其中L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体。
在一个实例中，上述方法的步骤“7”中的寡聚物为下述结构：
其中上文结构158的取代基为：“A1”为–H或–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及其中“Q”为O或S。
在另一方面，本发明涉及合成寡核苷酸(或它们的盐)的方法。所述方法包括下述步骤：
1)将化合物与固体载体直接地或通过连接物偶联，其中所述化合物为下述结构之一：
其中上文结构159和结构160的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)以提供下述结构之一的固体载体结合的化合物：
其中上文结构161和结构162的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体；
2)使固体载体结合的化合物脱保护以提供下述结构之一的脱保护的化合物：
其中上文结构163和结构164的取代基为：“P2”为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体；
3)使脱保护的化合物与包含含磷原子的部分的化合物反应，其中所述化合物为下述结构之一：
其中上文结构165和结构166的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体，“PM”为含磷部分，以提供下述结构之一的二核苷酸：
其中上文结构167和结构168的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体，“PM*”为反应之后的含磷部分；
4)任选地，化学修饰含磷部分以提供下述结构之一的修饰的二聚体：
其中上文结构169和结构170的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体，“PM**”为化学修饰的含磷部分；
5)任选地，使二聚体或修饰的二聚体脱保护以提供下述结构之一的脱保护的二聚体或修饰的二聚体：
其中上文结构171、结构172、结构173和结构174的取代基为：“P2”为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体，“PM*”为偶联反应之后的含磷部分，“PM**”为化学修饰的含磷部分；
6)任选地重复步骤“3”和“4”以提供下述结构之一的寡聚物或修饰的寡聚物：
其中上文结构175、结构176、结构177和结构178的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及“A1”为H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体，“PM*”为偶联反应之后的含磷部分，“PM**”为化学修饰的含磷部分，“n”为1至200(例如，1至25、1至50、1至75等)的整数；
7)使二聚体、修饰的二聚体、寡核苷酸或修饰的寡核苷酸脱保护，将其从固体载体去除，以及化学修饰“PM*”或“PM**”部分以提供下述结构的化合物：
其中“n”为1至200(例如，1至25、1至50、1至75等)的整数，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及其中“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及其中至少一个“A1”为–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及其中“Q”为O或S。
在一个实例中，上述方法的步骤“1”中的与固体载体偶联的化合物为下述结构之一：
其中上文结构180和结构181的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，“B”为核碱基或核碱基类似物，以及“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在另一实例中，上述方法的步骤“1”中的与固体载体偶联的化合物为下述结构之一：
其中上文结构182和结构183的取代基为：“P1“和”P2“独立地为保护基团，以及”A1“为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文结构184和结构185的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，以及“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文结构186和结构187的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，以及“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文结构188的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，以及“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在一个实例中，上述方法的步骤“2”中的脱保护的结构为下述结构之一：
其中上文结构189和结构190的取代基为：“P2”为保护基团，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及其中“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1为连接物或无化学实体，以及S1为固体载体。
在一个实例中，上述方法的步骤“2”中的脱保护的结构为下述结构之一：
其中上文结构191和结构192的取代基为：“P2”为保护基团，以及其中“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体；或
其中上文结构193和结构194的取代基为：“P2”为保护基团，以及其中“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体；或
其中上文结构195和结构196的取代基为：“P2”为保护基团，以及其中“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体；或
其中上文结构197的取代基为：“P2”为保护基团，以及其中“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1为连接物或无化学部分，以及S1为固体载体。
在一个实例中，上述方法的步骤“3”中的包含含磷原子的部分的化合物为下述结构之一：
其中上文结构198和结构199的取代基为：“P1”和“P2”独立地为保护基团，以及其中“A1”为–H或–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及其中“PM”为选自下述部分的含磷部分：
其中上文结构200、结构201、结构202、结构203和结构204的取代基为：“P3”和“P4”独立地为保护基团(例如，Bn、-CH2CH2SC(O)Ph)，以及其中“EWG”为吸电子基团(例如，-CN、-PhNO2)，以及其中R70和R71为烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或和与磷原子结合的氮原子一起形成杂环(例如，吡咯烷、哌啶)。
在一个实例中，上述方法的步骤“5”中的脱保护的、修饰的二聚体为下述结构之一：
其中上文结构205和结构206的取代基为：“P2”为保护基团，以及其中“A1”为–H或–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及其中“PM**”为例如，选自下述部分之一的含磷部分：-P(O)(O-)；-P(S)(O-)；-P(O)(-CH2CH2-EWG)-；-P(S)(-CH2CH2-EWG)-，其中“EWG”为吸电子基团(例如，-CN、-NO2)。
在一个实例中，上述方法的步骤“7”中的寡聚物为下述结构：
其中上文结构207的取代基为：“A1”为–H或–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，以及其中“Q”为O或S。
在另一方面，本发明涉及使用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA的方法。该方法涉及使用一种或多种在核碱基的环结构之上或之内的氮原子之上具有至少一个热不稳定的保护基团的三磷酸脱氧核苷酸，其中所述保护基团为结构–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
对于PCR的讨论，参见：USP 8,133,669；USP 4,683,195；USP 4,683,202；USP4,800,159；USP 4,965,188；USP 5,008,182；USP 5,176,995；USP 6,040,166；USP 6,197,563。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
在另一方面，本发明涉及使用PCR扩增DNA的方法，其中所述方法包括下述步骤：
1)提供包含靶DNA(即，待扩增的DNA)、DNA聚合酶、引物和三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的反应混合物，其中所述dNTP中的一种或多种为下述结构之一：
其中上文结构208和结构209的取代基为：“TP”为三磷酸酯，“A1”为–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
其中上文结构210和结构211的取代基为：“TP”为三磷酸酯，“A1”为–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
其中上文结构212和结构213的取代基为：“TP”为三磷酸酯，“A1”为–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
其中上文结构214的取代基为：“TP”为三磷酸酯，“A1”为–C(O)OR60，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
2)将反应混合物加热(例如，94℃至98℃)一段时间(例如，一分钟)以使靶DNA变性，从而提供单链DNA模板；
3)降低反应混合物的反应温度(例如，50℃至65℃)，持续一段时间(例如，20至40秒)，这使引物退火至单链DNA模板以提供引物-模板复合物以及DNA聚合酶与所述引物-模板复合物的结合；
4)加热所述反应混合物(例如，75℃至80℃)，通过将所述dNTP添加至所述DNA模板使所述DNA聚合酶以5'至3'方向合成与所述靶DNA互补的DNA链；
5)将反应混合物的温度任选地保持在70℃至74℃以确保任何剩余的单链DNA的延伸。
在另一方面，本发明涉及使用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA的方法。该方法涉及使用一种或多种在引物的核碱基的环结构之上或之内的氮原子之上具有一个或多个热不稳定的保护基团的引物(即，靶向特定DNA序列的寡核苷酸)，其中所述保护基团为结构–C(O)OR4，其中R4为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在另一方面，本发明涉及使用PCR扩增DNA的方法，其中所述方法包括下述步骤：
1)提供包含靶DNA(即，待扩增的DNA)、DNA聚合酶、引物和三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的反应混合物，其中所述引物中的一种或多种为下述结构：
其中上文结构215的取代基为：“n”为1至50的整数，以及其中“B”为核碱基，以及其中“A”为H或结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，条件是至少一个“A”为热不稳定的保护基团；
2)将反应混合物加热(例如，94℃至98℃)一段时间(例如，一分钟)以使靶DNA变性，从而提供单链DNA模板；
3)降低反应混合物的反应温度(例如，50℃至65℃)，持续一段时间(例如，20至40秒)，这使引物退火至单链DNA模板以提供引物-模板复合物以及DNA聚合酶与所述引物-模板复合物的结合；
4)加热所述反应混合物(例如，75℃至80℃)，通过将所述dNTP添加至所述DNA模板使所述DNA聚合酶以5'至3'方向合成与所述靶DNA互补的DNA链；
5)将反应混合物的温度任选地保持在70℃至74℃以确保任何剩余的单链DNA的延伸。
在另一方面，本发明涉及制备三磷酸核苷或三磷酸核苷类似物的方法，其中所述三磷酸核苷或三磷酸核苷类似物包含至少一个热不稳定的保护基团。所述方法包括以下步骤：
1)向包含核苷或核苷类似物的反应混合物中添加单磷试剂，以及任选地缩合剂(例如，羰基二咪唑)，其中类似物为下述结构：
其中上文结构216的取代基为：Y为OP1，其中P1为保护基团或-H，Z为H或OP2，其中P2为保护基团或-H，B为核碱基或核碱基类似物，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以提供下述结构的单磷酸化中间体：
其中上文结构217的取代基为：Y为OP1，其中P1为保护基团，Z为H或OP2，其中P2为保护基团，B为核碱基或核碱基类似物，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，“PM”为包含单个磷原子的部分；
2)将多磷试剂添加至磷酸化中间体以提供下述结构的多磷酸化中间体：
其中上文结构218的取代基为：Y为OP1，其中P1为保护基团，Z为H或OP2，其中P2为保护基团，B为核碱基或核碱基类似物，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)，“PP”为包含多个磷原子的部分；
3)水解所述多磷酸化中间体以及去除P1以提供下述结构的三磷酸核苷或三磷酸核苷类似物：
其中上文结构219的取代基为：Y为OP1，其中P1为保护基团，Z为H或OP2，其中P2为保护基团，B为核碱基或核碱基类似物，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一个实例中，上述方法的步骤“1”中的使用的单磷试剂选自下述：POCl3；以及，
在一个实例中，上述方法的步骤“1”中的核苷或核苷类似物为下述结构之一：
其中上文结构221和结构222的取代基为：P1为保护基团，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
其中上文结构223和结构224的取代基为：P1为保护基团，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
其中上文结构225和结构226的取代基为：P1为保护基团，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
其中上文结构227的取代基为：P1为保护基团，以及A为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一个实例中，上述方法的步骤“2”中的多磷试剂为下述结构之一：(n-Bu3NH)2H2P2O7；和P2O74-。
在一个实例中，上述方法的步骤“2”中的多磷酸化中间体为下述结构：
其中上文结构228的取代基为：P1为保护基团，B为核碱基或核碱基类似物，以及A1为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一个实例中，上述方法的三磷酸核苷为下述之一：
其中上文结构229、结构230、结构231和结构232的取代基为：A1为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
对于三磷酸酯合成的讨论，参见：Gregor S.Cremosnik,Alexandre Hofer和Henning J.Jessen Angew.Chem.Int.Ed.,2014,53,286；Malwina Strenkowska,Przemyslaw Wanat,Marcin Ziemniak,Jacek Jemielity和Joanna Kowalska Org.Lett.,2012,14,4782；Tobias Santner,Vanessa Siegmund,Andreas Marx和Ronald Micura Bioorganic&Medicinal Chemistry,2012,20,2416；Julianne Caton-Williams,Bilal Fiaz,Rudiona Hoxhaj,Matthew Smith和Zhen Huang Sci.China Chem.,2012,55,80；Gregor S.Cremosnik,Alexandre Hofer和Henning J.Jessen Angew.Chem.,2014,126,290；Qi Sun,Shanshan Gong,Jian Sun,Si Liu,Qiang Xiao和Shouzhi Pu J.Org.Chem.,2013,78,8417；Julianne Caton-Williams,Matthew Smith,Nicolas Carrasco和Zhen Huang Org.Lett.,2011,13,4156；Julianne caton-Williams,Lina Lin,Matthew Smith和Zhen Huang Chem Commun.,2011,47,8142-8144。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
在另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，其中所述方法包括下述步骤：
1)向有需要的患者施用治疗量的化合物，其中所述化合物包含核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物以及一个或多个热不稳定的保护基团，其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR8，以及其中R8为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
2)将能量施加于所述患者的一个或多个区域，导致一个或多个区域的温度增加以及所述核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物的随后的热脱保护；
从而治疗所述疾病。
对于某些热不稳定的保护基团的讨论，参见：Chmielewski,M.等人,New J.Chem.,2012,36,603-12.USP 8,133,669；USP 7,355,037；USP 6,762,298。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
在一个实例中，治疗性化合物为下述结构之一：
其中上文结构233和结构234的取代基为：“A1”、“A2”和“A3”独立地为–H或热不稳定的保护基团，条件是A1、A2或A3中的至少一个为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构235和结构236的取代基为：“A1”、“A2”和“A3”独立地为–H或热不稳定的保护基团，条件是A1、A2或A3中的至少一个为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构237和结构238的取代基为：“A1”、“A2”和“A3”独立地为–H或热不稳定的保护基团，条件是A1、A2或A3中的至少一个为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构239和结构240的取代基为：“A1”、“A2”和“A3”独立地为–H或热不稳定的保护基团，条件是A1、A2或A3中的至少一个为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构241和结构242的取代基为：“A1”、“A2”和“A3”独立地为–H或热不稳定的保护基团，条件是A1、A2或A3中的至少一个为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构243和结构244的取代基为：“A1”、“A2”和“A3”独立地为–H或热不稳定的保护基团，条件是A1、A2或A3中的至少一个为结构–C(O)OR4的热不稳定的保护基团，其中R4为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构245和结构246的取代基为：“A3”为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
其中上文结构247和结构248的取代基为：“A1”、“A2”和“A3”独立地为–H或热不稳定的保护基团，条件是A1、A2或A3中的至少一个为结构–C(O)OR60的热不稳定的保护基团，其中R60为叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物；
在一个实例中，使用下述方法中的一种或多种，将热能施加于患者的一个或多个区域：微波相控阵(microwave phased array)或单次涂布器高热疗法(single applicator hyperthermia)，如USP 6,725,095、USP 6,807,446和USP 6,768,925中所讨论的，将其为了所有目的通过引用并入本文件中。
在另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，其中所述方法包括下述步骤：
1)向有需要的患者施用治疗量的化合物，其中所述化合物包含寡核苷酸(或其盐)以及一个或多个热不稳定的保护基团，其中热不稳定的保护基团中的至少一个为结构–C(O)OR60，以及其中R60为叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
2)将能量施加于所述患者的一个或多个区域，导致一个或多个区域的温度增加以及寡核苷酸的随后的热脱保护；
从而治疗疾病。
在一个实例中，治疗性化合物为与结构–C(O)OR8的一个或多个热不稳定的保护基团连接的福米韦生或米泊美生，其中R8为叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一个实例中，使用下述方法中的一个或多个，将热能施加于患者的一个或多个区域：微波相控阵或单次涂布器高热疗法，如USP 6,725,095、USP 6,807,446和USP 6,768,925中所讨论，将其为了所有目的通过引用并入本文件中。
本发明还涉及使核苷、核苷类似物、核苷酸和核苷酸类似物脱保护的方法。受保护的化合物为结构：XO-SM-B-A。取代基“X”为H、保护基团、固体载体、含磷部分或它们的盐。“SM”为糖部分或糖部分的类似物。“B”为碱基部分的类似物的碱基部分。“A”为一个或多个连接于碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR60，其中R60为叔烷基。
脱保护方法包括在存在溶剂(例如，水)下加热化合物。在某些实例中，溶剂的pH为6.0至9.0–例如，6.5至7.5、6.75至7.25、6.90至7.10，或大约7.0。在其它实例中，溶剂的pH大于7.0–例如，7.0至10.0、7.0至9.0或7.0至8.0。将化合物加热到90℃至100℃的温度范围。通常，其范围为91℃至99℃、92℃至97℃、93℃至95℃。在某些实例中，温度为94℃。将温度保持小于1小时的时段。通常，将其保持小于45分钟或30分钟。在某些实例中，将其保持小于20分钟。
脱保护方法导致去除超过90％的–C(O)OR1保护基团。通常，其导致去除超过92.5％或95％的保护基团。在某些实例中，其导致去除超过97.5％或99％的保护基团。
脱保护方法还导致低于5％的化合物的降解。通常，其导致低于4％或3％的化合物的降解。在某些实例中，其导致低于2％或1％的化合物的降解。
在另一方法中，在存在溶剂下通过使用微波技术使化合物XO-SM-B-A脱保护。参见，例如，Culf等人,Oligonucleotides 18:81-92(2008)，和Kumar等人,Nucleic Acids Research,1997,第25卷,第24期,第5127-5129页，将两者通过引用并入本文件中。溶剂的pH通常大于6.0或者等于或大于7.0–例如，7.0至7.5、7.5至8.0、8.0至8.5、8.5至9.0。微波温度中的溶剂的温度通常低于55℃–例如，低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于35℃或低于30℃。在某些实例中，氨或胺包括在脱保护的反应混合物中。
胺的非限制性实例包括单烷基胺，如甲胺、乙胺、丙胺、乙醇胺；和二烷基胺，如二甲胺、二乙胺；以及其它胺，如DBU。在某些实例中，脱保护步骤耗费小于30分钟完成超过90％。通常，脱保护步骤耗费小于25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟完成超过90％。
在另一方法中，在不存在溶剂下将化合物XO-SM-B-A脱保护。将化合物加热至90℃至100℃的温度范围。通常，其范围为91℃至97℃、92℃至96℃、93℃至95℃。在某些实例中，温度为94℃。
将温度保持小于1小时的时段。通常，将其保持小于45分钟或30分钟。在某些实例中，将其保持小于20分钟。
无溶剂脱保护方法导致去除超过90％的–C(O)OR1保护基团。通常，其导致去除超过92.5％或95％的保护基团。在某些实例中，其导致去除超过97.5％或99％的保护基团。
无溶剂脱保护方法还导致低于5％的化合物的降解。通常，其导致低于4％或3％的化合物的降解。在某些实例中，其导致低于2％或1％的化合物的降解。
本发明还涉及使寡核苷酸或寡核苷酸类似物脱保护的方法。受保护的化合物为以下结构：
其中上文结构255的取代基为：“PL1”和“PL2”独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及其中“Nu1”和“Nu2”独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物、或寡核苷酸(或它们的盐)，以及其中“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，“A”为一个或多个连接于核碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR60，其中R60为叔烷基。
寡核苷酸、或寡核苷酸类似物脱保护方法包括在存在溶剂(例如，水)下加热化合物。在某些实例中，溶剂的pH为6.0至9.0–例如，6.5至7.5、6.75至7.25、6.90至7.10或大约7.0。在其它实例中，溶剂的pH大于7.0–例如，7.0至10.0、7.0至9.0或7.0至8.0。将化合物加热到90℃至100℃的温度范围。通常，其范围为91℃至99℃、92℃至97℃、93℃至95℃。在某些实例中，温度为94℃。在某些实例中，温度为94℃。将温度保持小于1小时的时段。通常，将其保持小于45分钟或30分钟。在某些实例中，将其保持小于20分钟。
脱保护方法导致去除超过90％的寡核苷酸/类似物–C(O)OR1保护基团。通常，其导致去除超过92.5％或95％的保护基团。在某些实例中，其导致去除超过97.5％或99％的保护基团。
脱保护方法还导致低于5％的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的降解。通常，其导致低于4％或3％的化合物的降解。在某些实例中，其导致低于2％或1％的化合物的降解。
在另一方法中，在存在溶剂下通过使用微波技术，使包含结构–C(O)OR60的保护基团的寡核苷酸脱保护，其中R60为叔烷基(例如，C(CH3)3)。参见，例如，Culf等人,Oligonucleotides 18:81-92(2008)，和Kumar等人,Nucleic Acids Research,1997,第25卷,第24期,第5127-5129页，将两者通过引用并入本文件中。溶剂的pH通常大于6.0或者等于或大于7.0–例如，7.0至7.5、7.5至8.0、8.0至8.5、8.5至9.0。微波温度中的溶剂的温度通常低于55℃–例如，低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于35℃或低于30℃。在某些实例中，氨或胺包括在脱保护的反应混合物中。
胺的非限制性实例包括单烷基胺，如甲胺、乙胺、丙胺、乙醇胺；和二烷基胺，如二甲胺、二乙胺；以及其它胺，如DBU。在某些实例中，脱保护步骤耗费小于30分钟完成超过90％。通常，脱保护步骤耗费小于25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟完成超过90％。
在另一方法中，在不存在溶剂下，使以下化合物脱保护：
其中上文结构256的取代基为：“PL1”和“PL2”独立地为H或-P(O)(OH)O-或它们的类似物，以及其中“Nu1”和“Nu2”独立地为没有取代基、核苷或核苷类似物或寡核苷酸，以及其中“SM”为糖部分或糖部分的类似物，以及其中“B”为核碱基或核碱基类似物，“A”为一个或多个连接于核碱基部分之上或之内的一个或多个氮原子的部分，以及为结构–C(O)OR60，其中R60为叔烷基。将化合物加热至90℃至100℃的温度范围。通常，其范围为91℃至97℃、92℃至96℃、93℃至95℃。在某些实例中，温度为94℃。将温度保持小于1小时的时段。通常，将其保持小于45分钟或30分钟。在某些实例中，将其保持小于20分钟。
寡核苷酸或类似物的无溶剂脱保护方法导致去除超过90％的–C(O)OR1保护基团。通常，其导致去除超过92.5％或95％的保护基团。在某些实例中，其导致去除超过97.5％或99％的保护基团。
无溶剂脱保护方法还导致低于5％的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的降解。通常，其导致低于4％或3％的化合物的降解。在某些实例中，其导致低于2％或1％的化合物的降解。
本发明还涉及用于聚合物(例如，DNA寡核苷酸)合成的仪器。对于DNA合成仪的讨论，参见：USP 5,368,823；USP 5,472,672；USP 5,529,756；USP 5,837,858。将前述参考文献为了所有目的据此通过引用并入本文件中。
本发明的仪器通常包括含有用于合成主题聚合物的化合物的一个或多个储器，其中储器可操作地连接于允许各种试剂(例如，在液体介质中)流向合成室(例如，包含固体载体的塔)的系统中。在仪器中存在诱导试剂流向(例如，气体压力)合成室的机制，其中进行聚合物合成中涉及的多种化学反应。合成室包括控制其温度的内部或外部装置(例如，微波设备或加热夹套)。合成的聚合物通过控制液体流动的阀门离开合成室。计算机控制器通常用于控制来自储器的化合物的流动、合成室的温度以及来自仪器的聚合物的离去。
参考图1，计算机控制装置控制网络化通道系统中的气体压力。气体压力引导DNA寡核苷酸合成中使用的各种化合物–“核苷A，储器1”、“核苷C，储器2”、“核苷G、储器3”、“核苷T，储器4”、“洗涤”、“试剂1，储器”、“试剂2，储器”、“试剂3，储器”、“试剂4，储器”、“脱保护，试剂1”和“脱保护，试剂2”–向包含固体载体的合成塔的流动。化学品引入合成塔的精确顺序由计算机控制装置决定以产生受保护的、固体载体结合的DNA寡聚物。可操作地连接合成塔的温度控制装置调节塔的温度以促进或实现从寡核苷酸去除一种或多种类型的保护基团；在某些实例中，温度控制装置还促进或实现从固体载体去除寡核苷酸，以提供目标寡核苷酸。
在某些实例中，设计合成塔及相关温度控制器以实现在中性条件(即，寡核苷酸合成中使用的液体介质的pH为大约7.0)下从寡核苷酸去除一个或多个BOC基团。这通过以下完成：将与合成塔的固体载体连接的寡核苷酸加热至91℃至99℃的温度(或大约94℃)，持续5分钟至20分钟的时段。
在其它实例中，设计合成塔及相关温度控制器以实现从固体载体去除寡核苷酸。这可以在以下情况下发生：叔烷基被用于将寡核苷酸与固体载体连接的情况下，或者叔烷基为寡核苷酸与固体载体之间的连接物的一部分的情况下。随着BOC的去除，寡聚物从固体载体的裂解在中性条件下发生，以及涉及在91℃至99℃加热固体载体化合物，持续5分钟至20分钟的时段。
实验部分
在Biosearch 8750合成仪上用Cruachem DNA amidite进行DNA合成。
如下进行阴离子交换HPLC分析：将2-20mL样品水溶液(取决于浓度)注入Dionex阴离子交换柱(4.6x 250mm)；在20min内，使用1:0至0:1的线性梯度用(A)0.025M TRIS HCl和0.01M TRIS，以及(B)0.025M TRIS HCl,0.01M TRIS和1.0M NaCl的缓冲液水溶液以2mL/min洗脱样品，其中在260nm进行UV检测。
如先前所述16处理用于碱基组成分析的样品，其中通过反相HPLC如下进行分析：将20uL样品水溶液注入HAISIL HL C18 5m柱(4.6x150mm)；在20min内，使用1:0至0:1的线性梯度用(A)0.1M TEAA,5％乙腈，(B)乙腈的缓冲液以1mL/min洗脱样品。在260nm进行UV检测。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N6,N6-(二叔丁氧基羰基)脱氧腺-3’-O-N,N-二异丙基氰乙基亚磷酰胺(结构257)
向5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲酰基)脱氧腺苷(50g,76mM)和咪唑(20g,0.294M)中添加700mL无水吡啶和50g(0.333M)叔丁基二甲基氯硅烷。将溶液搅拌18小时。通过旋转蒸发去除吡啶，以及将残余物溶解在700mL乙酸乙酯中。将有机相用500ml 0.5M K2HPO4洗涤，随后用500mL饱和NaHCO3洗涤。将溶液蒸发，产生了62g 5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲酰基)-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-脱氧腺苷产物。向该产物在900mL甲醇中的溶液添加100mL浓氨水。在短暂涡旋之后，使溶液静置过夜。通过旋转蒸发去除溶剂，将固体再溶解于700mL无水吡啶和20mL TEA中，以及添加50g焦碳酸二叔丁酯。将溶液搅拌18小时。通过旋转蒸发去除溶剂，将残余物溶解在500mL DCM中，以及用500mL 0.5M KH2PO4洗涤该溶液。将有机相添加至用在DMF中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。将至6％甲醇的梯度应用于柱，经10L溶剂，以及将包含纯的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脱氧腺苷的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减。产量为42g(55mM，72％，来自DMT dA(Bz))。
通过添加60mL 1M TBAF于THF中以及10mL HOAc于500mL THF中的溶液去除TBDMS基团。在18小时之后，添加50mL饱和NaHCO3，以及通过旋转蒸发去除THF。将残余物溶解在600mL DCM中，以及用400mL饱和NaHCO3洗涤。将有机相添加至用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。将至10％甲醇的梯度应用于柱，经14L溶剂，以及将包含纯的5’-O-DMT-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脱氧腺苷的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减。产量为32g(42.5mM，89％，来自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脱氧腺苷)。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM)8.78(s,1H),8.22(s,1H),7.3–7.6(m,9H),6.8(d,4H),6.5(t,1H),4.7(s,1H),3.8(s,6H),3.42(d,2H),2.8(m,1H),2.55(m,1H),1.46(s,18H)。
制备2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(15g,50mM)和1H-四唑(1g,14mM)在800mL无水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，将其添加至包含32g(49mM)无水5’-O-DMT-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脱氧腺苷的烧瓶中。在涡旋下，缓慢地溶解核苷，持续2hr。通过旋转蒸发去除溶剂，以及将残余物溶解在包含300mL饱和NaHCO3溶液的700ml EtOAc中。摇振混合物，使其分离，以及将有机相添加至用在EtOAc中的2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X25cm。等度洗脱柱，将包含纯的257的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减至33.9g(35.6mM，84％收率，来自受保护的核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.617,149.410。C50H64N7O10P的分析计算值:C,62.95.H,6.76.N,10.28。实测值：C,63.20.H,6.79.N,10.21。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N4-(叔丁氧基羰基)脱氧胞嘧啶-3’-O-N,N-二异丙基氰乙基亚磷酰胺(结构258)
向无水5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N4-(乙酰基)脱氧胞嘧啶(50g,87.4mM)中添加咪唑(20g,0.294M)、700mL无水吡啶和50g(0.333M)叔丁基二甲基氯硅烷。将溶液搅拌18小时，通过旋转蒸发去除吡啶，以及将残余物溶解在700mL乙酸乙酯中。将有机相用500ml 0.5M K2HPO4洗涤，随后用500mL饱和NaHCO3洗涤。蒸发产生了56g(81mM)5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N4-(乙酰基)-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-脱氧胞嘧啶。制备该产物在900mL甲醇中的溶液，以及向此添加100mL浓氨水。在短暂涡旋之后，使溶液静置过夜。在干燥之后，将固体再溶解在700mL无水吡啶中，通过旋转蒸发去除溶剂，以及进行高真空过夜。将固体再溶解在700mL无水THF中，以及添加20g无水K2CO3。在10min之后，添加50g(229mM)焦碳酸二叔丁酯。将溶液搅拌18小时。通过过滤去除K2CO3，以及添加200mL 0.5M KH2PO4。通过蒸发去除THF。将残余物溶解在500mL DCM中，以及用500mL 0.5M KH2PO4洗涤。将有机相添加至用在DCM中的1％甲醇和1％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。在洗脱包含第一DMT的条带之后，将至2％甲醇的梯度应用于柱，将包含纯的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N4–(叔丁氧基羰基)-脱氧胞嘧啶的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减。产量为28g(37.6mM，43％收率，来自DMT dC(Ac))。通过添加60mL 1M TBAF在THF中以及10mL HOAc在500mL THF中的溶液去除TBDMS基团。在18小时之后，添加饱和NaHCO3(50mL)，以及通过旋转蒸发去除THF。将残余物溶解在600mL DCM中，以及用400mL饱和NaHCO3洗涤。将有机相添加至用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。将至10％甲醇的梯度应用于柱，经10L溶剂，将包含纯的5’-O-DMT-N4–(叔丁氧基羰基)-脱氧胞嘧啶的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减。产量为20g(31.7mM,84％，来自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N4–(叔丁氧基羰基)-脱氧胞嘧啶)。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM):8.2(d,1H),7.3(m,9H),7.0(d,1H),6.85(d,4H),6.3(t,1H),4.5(dd,1H),4.15(dd,1H),3.8(s,6H),3.5(dd,2H),3.4(dd,1H),2.75(m,1H),2.35(m,1H),1.5(s,18H)。
制备9g(30mM)2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺和650mg(9mM)1H-四唑在500mL无水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，将其添加至20g(31.7mM)无水5’-O-DMT-N4–(-叔丁氧基羰基)-脱氧胞嘧啶。在涡旋下，缓慢地溶解核苷，以及在2小时之后通过旋转蒸发去除溶剂。将残余物溶解在500ml EtOAc中，以及用200mL饱和NaHCO3溶液摇振。将分离的有机相添加至用在EtOAc中的2％吡啶填充的二氧化硅柱，5X25cm。等度洗脱柱，将包含纯的258的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减至19.5g(23.5mM，74％收率，来自核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.997,149.339。C44H56N5O9P的分析计算值：C,63.68.H,6.80.N,8.44。实测值：C,63.59.H,6.69.N,8.52。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N2-(叔丁氧基羰基)脱氧鸟苷-3’-O-N,N-二异丙基氰乙基亚磷酰胺(结构259)
向无水5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N2-(异丁酰基)脱氧鸟苷(100g,156mM)中添加含咪唑(40g,0.588M)的1200mL无水吡啶和100g(0.666M)叔丁基二甲基氯硅烷。将溶液搅拌18小时，通过旋转蒸发去除吡啶，以及将残余物溶解在700mL乙酸乙酯中。将有机相用500ml 0.5M K2HPO4洗涤，随后用500mL饱和NaHCO3洗涤。干燥产生110g(145mM)5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N2-(异丁酰基)-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-脱氧鸟苷产物。制备产物在1500mL甲醇中的溶液，以及向此添加150mL浓氨水。在短暂涡旋之后，使溶液静置过夜。通过旋转蒸发去除溶剂，将干燥的固体再溶解在1400mL THF中，以及添加40g无水K2CO3。在搅拌10min之后，添加100g焦碳酸二叔丁酯。将溶液搅拌3小时。TLC显示部分转化(二氧化硅，2％MeOH，2％吡啶于DCM中，原料rf：0.3，产物rf：0.7，用10％H2SO4和加热进行可视化)。较长的反应时间产生较少的期望产物和较多的副反应材料。通过过滤去除K2CO3，以及添加400mL 0.5M KH2PO4。通过旋转蒸发去除THF，以及将残余物与700mL DCM混合。将有机相添加至用在DMF中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。将至10％甲醇的梯度应用于柱，经14L溶剂，将包含纯的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N2-(叔丁氧基羰基)-脱氧鸟苷的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减。产量为25g(34mM，22％收率，来自DMT dG(iBu))。通过添加60mL 1M TBAF在THF中以及10mL HOAc在500mL THF中的溶液去除TBDMS基团。在18小时之后，添加50mL饱和NaHCO3，以及通过旋转蒸发去除THF。将残余物溶解在600mL DCM中，以及用400mL饱和NaHCO3洗涤。将有机相通过旋转蒸发缩减至泡沫以产生5’-O-DMT-N2-(叔丁氧基羰基)-脱氧鸟苷(19.5g,29.1mM,86％，来自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N2–(叔丁氧基羰基)-脱氧鸟苷)。材料的纯度足以用于下一步骤。在用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱(10X35cM)上通过柱色谱法如上制备分析性样品。将至10％甲醇的梯度应用于柱，经10L溶剂，将包含纯的产物的级分合并以及蒸发。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM)7.7(m,1H),7.2–7.4(m,10H),6.8(d,4H),6.2(t,1H),5.7(s,2H),4.65(m,1H),4.15(m,1H),3.8(s,6H),3.35(m,2H),2.7(m,1H),2.45(m,1H),1.6(s,18H)。
制备2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基-亚磷酰二胺(12g,40mM)和1H-四唑(1g,14mM)在400mL无水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，将其添加至包含19.5g(29.1mM)无水5’-O-DMT-N2–(叔丁氧基羰基)-脱氧鸟苷的烧瓶中。在涡旋下，缓慢地溶解核苷，在2小时之后，通过旋转蒸发去除溶剂，以及将残余物溶解在包含100mL饱和NaHCO3溶液的EtOAc(500ml)中。摇振混合物，使其分离，以及将有机相添加至用在EtOAc中的2％吡啶填充的二氧化硅柱，6X25cM。等度洗脱柱，将包含纯的259的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减至12g(14mM，45％收率，来自核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.213,149.175。C45H56N7O9P的分析计算值：C,62.13.H,6.49.N,11.27。实测值：C,62.22.H,6.69.N,11.02。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷-3’-O-N,N-二异丙基氰乙基亚磷酰胺(结构260)
将50g(91.5mM)5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-胸苷通过旋转蒸发从700mL无水吡啶中干燥，以及进行高真空过夜。添加20g(0.294M)咪唑以及700mL无水吡啶和50g(0.333M)叔丁基二甲基氯硅烷。将溶液搅拌18小时，由此TLC显示完全转化(二氧化硅，10％MeOH，2％吡啶于DCM中，原料rf：0.5，产物rf：0.9，用10％H2SO4和加热进行可视化)。通过旋转蒸发去除吡啶，以及将产物溶解在700mL DCM中。将溶液用500mL 0.5M KH2PO4洗涤，随后用500mL饱和NaHCO3水溶液洗涤。将溶液蒸发，以及进行高真空过夜。产量为60g，90.8％。将50g该产物溶解在1L THF中，以及在氩气下添加25g无水K2CO3。将混合物搅拌30min，以及添加50g焦碳酸二叔丁酯。在此完全溶解之后，添加12g DMAP。在过夜搅拌之后，TLC揭示完全反应(1:1石油醚：乙酸乙酯，2％吡啶，原料rf：0.4，产物rf：0.8)。通过旋转蒸发去除THF，以及将残余物溶解在700mL乙酸乙酯中。将有机相用500ml 0.5M K2HPO4洗涤，随后用500mL饱和NaHCO3洗涤。将有机相添加至用49％乙酸乙酯、49％石油醚和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10x 35cM。等度洗脱柱，以及将包含纯的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减。产量为49.3g，86％收率。通过添加60mL 1M TBAF在THF中以及10mL HOAc在500mL THF中的溶液去除TBDMS基团。在18小时之后，TLC显示完全转化(二氧化硅，2％MeOH，2％吡啶于DCM中，原料rf：0.60，产物rf 0.2，用10％H2SO4和加热进行可视化)。添加50mL饱和NaHCO3，以及通过旋转蒸发去除THF。将残余物溶解在600mL EtOAc中，以及用400mL水洗涤，随后用400mL饱和NaHCO3洗涤。通过旋转蒸发将有机相缩减至焦油，然后再溶解在200mL DCM中，以及添加至用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cM。将至10％甲醇的梯度应用于柱，经10L溶剂，将包含纯的5’-O-DMT-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减。产量为35g(54.3mM，84％，来自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷)。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM):8.6(d,2H),7.4–7.2(m,9H),6.7(dd,4H),6.37(t,1H),4.6(dd,1H),4.15(dd,1H),3.8(s,6H),3.5(dd,1H),3.4(dd,1H),2.7(d,1H),2.35(m,2H),1.6(s,9H),1.45(s,3H)。将25g(45mM)产物通过在无水吡啶(500mL)中的溶液干燥，以及通过旋转蒸发去除溶剂，随后高真空过夜。制备15g(50mM)2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺和650mg(9mM)1H-四唑在500mL无水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，将其添加至包含25g(45mM)无水5’-O-DMT-N3-(-叔丁氧基羰基)-胸苷的烧瓶中。在涡旋下缓慢地溶解核苷，以及2小时之后，TLC显示完全转化(二氧化硅，2％吡啶于EtOAc中，原料rf：0.30，产物rf：0.75，呈两个非对映体斑点，用0.5％AgNO3和加热进行可视化)。通过旋转蒸发去除溶剂，以及将残余物溶解在包含200mL饱和NaHCO3溶液的500ml EtOAc中。摇振混合物，使其分离，以及将有机相添加至用49％乙酸乙酯、49％石油醚和2％吡啶填充的二氧化硅柱，5X25cM。等度洗脱柱，将包含纯的260的级分合并，以及通过旋转蒸发缩减至25.5g(29.6mM，76.3％收率，来自核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.711,149.105。C45H57N4O10P的分析计算值：C,63.97.H,6.80.N,6.63。实测值：C,63.74.H,6.64.N,6.78。
Boc受保护的核糖核苷亚磷酰胺的一般合成。
通过用氨处理商购的碱基-受保护的5’-O-DMT-2’-O-TBDMS核糖核苷3’-亚磷酰胺以去除核碱基之上的保护基团来制备用于合成RNA的这些试剂。用焦碳酸二叔丁酯对其进行处理产生了用于RNA合成的期望的Boc-受保护的试剂。
例如，以下为riboC试剂的制备。
用在甲醇中的氨水进行N-脱保护5’-O-DMT-2’-O-TBDMS-N4-乙酰基胞嘧啶3’-O-(N,N-二异丙基氰乙基亚磷酰胺)。将产物充分干燥，以及用在THF中的焦碳酸二叔丁酯和碳酸钾处理。通过柱色谱法分离产物Boc RNA amidite。同样也制备了完全受保护的N6-二Boc-腺苷、N2-Boc-鸟苷和N-1-Boc-尿苷亚磷酰胺。
CPG-Boc-核苷的一般合成
用在无水吡啶中的二甘醇酸酐和催化剂N-甲基咪唑处理5’-DMT-N-(Boc)核苷，以及将所得的3’-酯通过柱色谱法纯化。用在足以与CPG形成浓浆液的乙腈中的400mg甘醇酸酯、400mg BOP和400微升N-甲基吗啉处理10g 1000A氨丙基CPG。静置过夜，随后洗涤，加帽和干燥，产生了30微摩尔/g负载下的衍生化的CPG。
脱保护T10寡核苷酸中的单个Boc残基的时间进程
Boc-dC-T10的制备和脱保护
将dC amidite与T-10偶联，切割DNA，用在甲醇(1mL)中的25％的2-甲氧基乙胺在室温脱保护3小时，去除CPG并蒸发至干燥，再溶解于DI水(1mL)中。ESMS显示具有仍然连接的叔丁基的DNA(M+100)的准确质量。RP HPLC被用于跟踪热诱导的N-4-Boc-dC脱保护；Boc受保护的dC-T-10具有较长的保留时间，其中来自oligo的基线分离无上述现象。积分给出了溶液中各物质的相对量。3小时时间进程显示15min内完全脱保护；12min时间进程(以下显示)显示依次地脱保护，其中T1/2为约6min。
剩余的部分Boc：5’-dC(Boc)T10-3’，94°，中性水
时间，分钟
(Boc)2-dA-T10的脱保护
将BisBoc-dA amidite与T-10偶联，切割DNA，用在甲醇(1mL)中的25％的2-甲氧基乙胺在室温脱保护3小时，去除CPG并蒸发至干燥，再溶解于DI水(1mL)中。ESMS显示具有仍然连接的叔丁基的DNA(M+100)的准确质量。RP HPLC被用于跟踪热诱导的Boc脱保护。15分钟的时间进程显示15min内80％的脱保护，其中T1/2为约7min。NMR和ESMS数据显示：在从CPG去除寡核苷酸期间，通过碱处理去除碳酸叔丁酯之一，从而在腺嘌呤残基上留下单个Boc。
脱保护寡核苷酸中的Boc-受保护的dA的时间进程
Boc-受保护的RNA
在10-15min的偶联时间内将核糖核苷amidite与T10以至少90％的效率偶联。将各个与T-10偶联，以及通过RP HPLC检查。通过磷NMR测得其纯度为98％。当将样品在94℃加热1h时，在所有情况中，在加热后，观察到Boc基团的完全去除。通过ESMS确认结果。时间进程用于测量转化率，使用HPLC用于简单评价存在的各物质的量。以下显示了rC-和rA-T10寡核苷酸的结果：
Boc-受保护的PCR引物的脱保护
用Boc dA、dC和dG amidite在Boc-dG CPG(1μmol)上合成RNaseP正向引物19-mer[AGATTTGGACCTGCGAGCG]。该引物的完全脱保护的质量为5868g/mol，以及Boc保护的预期质量为7369g/mol[15个Boc残基·100amu/Boc＝增加的1500]。在室温下，用在甲醇(1mL)中的25％的2-甲氧基乙胺进行3小时的侧链保护基团的脱保护，去除CPG且蒸发至干燥，再溶解于DI水(1mL)中。在裂解之前，去除DMT，因为Boc基团可以被用作疏水手柄。将产物用在1mL筒(cartridge)中填充的20-50微米聚苯乙烯珠子中脱盐，以及在20％ACN/H2O中洗脱。
将脱盐的Boc-引物等分至3个100uL微量离心管中。将样品干燥，以及溶解在1mL家用DI水中。向第一管中仅添加水。在第二管中，将1mL含有MgCl2的PCR缓冲液，pH 8.5，1X，添加至6mM的终浓度(标准PCR浓度)。向第三管中添加TEAA以产生0.025N的终浓度。将3个样品各自等分至10个200uL薄壁PCR管中，总共30个管。在室温进行所有引物准备。
将ABI 9700热循环仪预热至94℃。将各样品置于热块(heat block)上，在某时间点移除并置于冰上以终止反应。作为阴性对照，在实验开始时，T＝0时的样品不进行加热，且直接置于冰中。使样品在室温解冻，转移至96孔板中，用于HPLC和质谱分析。
对于各时间点，获得反相和质谱数据以追踪Boc保护基团的去除。Boc受保护的引物不是单一物质，而是各种保护阶段的集合。在T＝0的样品中，一系列物质(相差100个质量单位)显示一些Boc基团可能通过暴露于质谱仪的高温入口已经脱离。
加热之前的HPLC：
加热之前的ESMS：
2：(时间：1.52)MaxEnt 1；组合(1:294)6.2e+003
10分钟之后，几乎所有Boc基团离去；然而，一些保留在TEAA样品中。15分钟之后，去除TEAA中的所有Boc基团。重要地是，10分钟之后，在正常PCR缓冲作用中，脱保护引物。
加热之后的HPLC：
加热之后的ESMS:
5：(时间：0.84)MaxEnt 1；组合(1:278)1.3e+004