本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因工程蓝藻，本发明提供的基因工程蓝藻可以通过光合作用直接利用CO2高效生产苯丙烷类物质。
背景技术：
植物次生代谢是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，其代谢产物具有多种复杂的生物学功能，在提高植物对环境的适应性、种间竞争能力和增强抗病性等方面起着重要作用，植物次生代谢物也为医药、化工、食品、颜料及农药等产业提供了宝贵的原料。作为天然活性物质，植物次生代谢物为目前一些难以医治的疾病提供了一条重要解决途径。苯丙烷类物质是一类重要的植物次生代谢产物，主要包括黄酮类、芪类和简单酚类等，在植物中，大多数苯丙烷类物质都是由酪氨酸或苯丙氨酸经脱氨基后形成对香豆酸进而产生。苯丙烷类物质具有较强生理活性及药理作用，如异黄酮能预防骨质疏松、更年期综合症，及以乳腺癌为代表的多种癌症；白藜芦醇能够预防心血管疾病、动脉硬化等疾病。此外，苯丙烷类物质及其衍生物还广泛的用作化工原料、食品添加剂和香料等，如香兰素是目前世界应用最为广泛的天然香料之一。
尽管苯丙烷类等植物次生代谢产物对人类产生了巨大的作用，但这些天然产物在植物中的含量低，分离和提取较为复杂，并且许多物质在特定植物的特定部位才能产生，使得它们的产量极低，不能满足人们对于植物次生代谢产物日益增长的需求量。化学合成法虽然能合成一些结构相对简单的苯丙烷类物质，但环境问题的日益凸显和人们对于食品安全的重视，限制了这种方法的发展。由于工艺简单、分离和提取简便、安全无污染等优势，利用微生物发酵来合成植物次生代谢产物成为研究的热点。如，2005年，Yan等人利用基因工程酵母菌将对香豆酸转化为28.3mg/L柚皮素(Yan,Y.,Kohli,A.,Koffas,M.A.BiosynthesisofnaturalflavanonesinSaccharomycescerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.,2005,71:5610-5613.)；2012年，Lin等人利用酪氨酸高产的重组大肠杆菌将葡萄糖转化为50.2mg/L咖啡酸(Lin,Y.,Yan,Y.BiosynthesisofcaffeicacidinEscherichiacoliusingitsendogenoushydroxylasecomplex.Microb.CellFact.2012,11:42-50.)；Kang等人在大肠杆菌中导入苯丙烷类物质合成的相关基因，可以将葡萄糖转化为974mg/L对香豆酸、150mg/L咖啡酸和196mg/L阿魏酸(Kang,S.Y.,Choi,O.,Lee,J.K.,Hwang,B.Y.,Uhm,T.B.,Hong,Y.S.ArtificialbiosynthesisofphenylpropanoicacidsinatyrosineoverproducingEscherichiacolistrain.Microb.CellFact.2012,11,153.)。虽然这些生产技术可以得到一定量的苯丙烷类物质，但一般微生物缺乏充足的ATP和NADPH提供给这些外源合成途径，使得产量陷入瓶颈。而且生产过程需要添加碳水化合物或者昂贵的前体物质，使得这种生产方式并不十分经济。此外，许多苯丙烷类合成途径需要一些普通工业微生物难以表达的植物酶类，限制了这种生物生产技术的应用。
蓝藻是可以进行光合作用的原核生物，广泛分布在淡水、海水甚至污水。蓝藻生长迅速，结构和遗传背景简单，易于基因操作，最为突出的是它能将太阳能和温室气体CO2直接转化为产物，是实现可持续生产的最佳途径之一。此外，由于可以光合作用，使得蓝藻具有充足的ATP和NADPH；作为植物的祖先，蓝藻也可以表达绝大多数植物来源的酶，这些特点使得蓝藻尤为适合作为苯丙烷类合成的载体。然而，目前并未有对蓝藻进行基因改造，使其直接利用CO2和太阳能来合成苯丙烷类物质的相关报道。
技术实现要素：
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种基因工程蓝藻，本发明提供的基因工程蓝藻可直接转化CO2来生产苯丙烷类物质。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案是：一种基因工程蓝藻，所述基因工程蓝藻由以下方法的其中之一制备而成：
方法一：将解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因和酪氨酸解氨酶的编码基因导入野生蓝藻的基因组DNA得到产对香豆酸的基因工程蓝藻；
方法二：将解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因、酪氨酸解氨酶的编码基因和对香豆酸羟化酶的编码基因导入野生蓝藻的基因组DNA得到产咖啡酸的基因工程蓝藻；
方法三：将解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因、酪氨酸解氨酶的编码基因、对香豆酸羟化酶的编码基因和咖啡酸甲基转移酶的编码基因导入野生蓝藻的基因组DNA得到产阿魏酸的基因工程蓝藻；
方法四：将解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因、酪氨酸解氨酶的编码基因、对香豆酰辅酶A连接酶的编码基因和芪合酶的编码基因导入野生蓝藻的基因组DNA得到产白藜芦醇的基因工程蓝藻；
方法五：将解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因、酪氨酸解氨酶的编码基因、对香豆酰辅酶A连接酶的编码基因、查耳酮合酶的编码基因和查尔酮异构酶的编码基因导入野生蓝藻的基因组DNA得到产柚皮素的基因工程蓝藻；
方法六：将解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因、酪氨酸解氨酶的编码基因、对香豆酰辅酶A连接酶的编码基因和姜黄素合酶的编码基因导入野生蓝藻的基因组DNA得到的产双去甲氧基姜黄素的基因工程蓝藻。
优选地，所述野生蓝藻选自聚球藻属、集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属和鞭枝藻属等蓝藻。
更优选地，所述野生蓝藻为集胞藻(Synechocystissp.)。
优选地，外源基因通过串联在质粒中导入野生蓝藻的基因组DNA。
更优选地，串联表达的外源基因结构含有一个与串联结构中第一个基因可操作地连接的启动子，或是所述串联结构上每个基因各自独立带有可操作地连接的启动子。
更优选地，所述启动子为trc启动子。
优选地，所述的解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因如SEQIDNO:1所示或者能与SEQIDNO:1所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的酪氨酸解氨酶的编码基因如SEQIDNO:2所示或者能与SEQIDNO:2所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的对香豆酸羟化酶的编码基因如SEQIDNO:3所示或者能与SEQIDNO:3所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的咖啡酸甲基转移酶的编码基因如SEQIDNO:4所示或者能与SEQIDNO:4所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的对香豆酰辅酶A连接酶的编码基因如SEQIDNO:5所示或者能与SEQIDNO:5所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的芪合酶的编码基因如SEQIDNO:6所示或者能与SEQIDNO:6所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的查耳酮合酶的编码基因如SEQIDNO:7所示或者能与SEQIDNO:7所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的查尔酮异构酶的编码基因如SEQIDNO:8所示或者能与SEQIDNO:8所示的核酸序列的互补链杂交；
所述的姜黄素合酶的编码基因如SEQIDNO:9所示或者能与SEQIDNO:9所示的核酸序列的互补链杂交。
更优选地，所述的解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶来源于大肠杆菌；
所述的酪氨酸解氨酶来源于糖丝菌；
所述的对香豆酸羟化酶来源于拟南芥；
所述的咖啡酸甲基转移酶来源于拟南芥；
所述的对香豆酰辅酶A连接酶来源于欧芹；
所述的芪合酶来源于落花生；
所述的查耳酮合酶来源于矮牵牛；
所述的查尔酮异构酶来源于拟南芥；
所述的姜黄素合酶来源于水稻。
本发明还提供了本发明所提供的基因工程蓝藻在生产苯丙烷类物质中的应用。
本发明的有益效果为：本发明对蓝藻进行遗传改造，将植物的苯丙烷类物质合成途径在蓝藻中重构，获得的基因工程菌可以将取之不尽的太阳能和温室气体CO2直接转化为特定苯丙烷类化合物，避免了碳水和化合物的消耗和昂贵前体的使用。在本发明的具体实施例中，经过培养，基因工程蓝藻分别可以产生128.2mg/l对香豆酸、4.7mg/l咖啡酸、6.3mg/l阿魏酸、4.6mg/l白藜芦醇、7.1mg/l柚皮素和4.1mg/l双去甲氧基姜黄素。这些物质作为苯丙烷代谢的重要节点化合物，可以合成许多其他的苯丙烷类化合物，这为苯丙烷类物质的生产开辟了新的技术，具有广泛的工业应用前景。本发明提供应用方法降低了底物成本，还可以减少CO2的排放，具有重要的现实意义和工业应用价值。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明实施例5利用基因工程蓝藻S-COU生产对香豆酸中对香豆酸的浓度随时间的变化图。
图2是本发明实施例5中对香豆酸的LC-ESI-MS检测图谱。
图3是本发明实施例6中对咖啡酸的LC-ESI-MS检测图谱。
图4是本发明实施例7中对阿魏酸的LC-ESI-MS检测图谱。
图5是本发明实施例8中对白藜芦醇的LC-ESI-MS检测图谱。
图6是本发明实施例9中对柚皮素的LC-ESI-MS检测图谱。
图7是本发明实施例10中对双去甲氧基姜黄素的LC-ESI-MS检测图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明使用的菌株和生长条件如下：
克隆宿主DH5α购自Invitrogen公司，所有大肠杆菌在含有100mg/l壮观霉素的LB培养基中，37℃培养。
集胞藻(Synechocystissp.)PCC7942购自美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)。集胞藻PCC7942在BG11液体培养基中生长，固体培养基在BG11液体培养基中添加1.5％的琼脂粉，对于转化后的重组菌添加20mg/l壮观霉素。培养条件：30℃，光强100μE·s-1·m-2，并连续通入5％体积比CO2气体。
其中，所述LB培养基配方是：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L,NaCl10g/L,pH7.0；
所述BG11液体培养基配方是：10mlBG11母液，1ml柠檬酸铁铵溶液(6g/L)，1mlNa2CO3溶液(20g/L)，1mlK2HPO4溶液(30.5g/L)，水定容至1L；
上述BG11母液的配方是：149.6gNaNO3，7.5gMgSO4·7H2O，3.6gCaCl2·2H2O，0.6g柠檬酸，1.12mlNaEDTA溶液(PH8.0，浓度0.25M)，100ml微量元素溶液，水定容至1L；
上述BG11微量元素溶液的配方是：2.86gH3BO3，1.81gMnCl2·7H2O，0.22gZnSO4·7H2O，0.39gNa2MoO4·2H2O，0.079gCuSO4·5H2O，0.049gCo(NO3)2·6H2O，水定容至1L；
所有质粒均为PAM2991衍生质粒，用于通过同源重组整合到集胞藻PCC7942基因组中表达目的基因。
实施例1
构建表达质粒pAM-aroGfbr-sam8：
(1)提取pAM2991质粒：
将含有pAM2991质粒的大肠杆菌DH5α按照1％接种量，接种至5mLLB液体培养基中，在37℃培养箱中培养10h。将培养后的菌体利用普通质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。
(2)扩增Ptrc启动子：
利用pAM2991质粒为模板，采用常规方法进行PCR扩增，该过程可参考《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法。
PCR引物：Ptrc启动子上游引物Ptrc-F：5′-catgagatctcagcttatcatcgactgcacg-3′，下游引物Ptrc-R：5′-catgctcgaggtctgtttcctgtgtgaaattgtt-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是BglII和XhoI的酶切位点。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(3)将步骤(2)中得到的Ptrc启动子和步骤(1)中得到的pAM2991质粒分别利用NEB的限制性内切酶BglII和XhoI进行双酶切。将酶切后的Ptrc启动子基因片段和pAM2991质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM2。
(4)扩增解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroGfbr)：
采用常规的方法制备大肠杆菌K12的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备方法；
利用大肠杆菌K12基因组为模板，采用常规方法进行PCR扩增，该过程可参考《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法。
PCR引物：aroG基因上游引物aroG-F：
5′-catgcttaagatgaattatcagaacgacgatttacg-3′，下游引物aroG-R：
5′-catgagatctttacccgcgacgcgct-3′，其中下划线所标示的碱基序列分别是AflII和BglII的酶切位点。
得到上述产物，经过重组PCR的方法，将539位的C碱基替换为T，从而将第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，得到可以编码解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的序列。将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(5)将步骤(4)中得到的aroGfbr基因片段和步骤(3)中得到的pAM2质粒分别利用NEB的限制性内切酶AflII和BglII进行双酶切。将酶切后的aroGfbr基因片段和pAM2991质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit参照说明书中描述的方法进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接过程参照说明书中的方法，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-aroGfbr。
(6)扩增酪氨酸解氨酶基因(sam8)：
采用常规的方法制备西班牙糖丝菌的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备方法；
利用西班牙糖丝菌基因组为模板，采用常规方法进行PCR扩增，该过程可参考《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行。
PCR引物：sam8基因上游引物sam8-F：
5′-catgctcgaggcatgacgcaggtcgtggaacg-3′，下游引物sam8-R：
5′-catgggatccttatccgaaatccttcccgt-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是XhoI和BamHI的酶切位点。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(7)将步骤(6)中得到的sam8基因片段和步骤(5)中得到的pAM-aroGfbr质粒分别利用NEB的限制性内切酶XhoI和BamHI进行双酶切。将酶切后的sam8基因片段和pAM-aroGfbr质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit参照说明书中描述的方法进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-aroGfbr-sam8。
实施例2
构建表达质粒pAM-sts-4cl-sam8-aroGfbr、pAM-chs-chi-4cl-sam8-aroGfbr和pAM-cus-4cl-sam8-aroGfbr：
(1)合成含有trc启动子的对香豆酰辅酶A连接酶(4cl)片段：
利用在线软件JCat，根据集胞藻PCC7942的密码子偏好性将欧芹(Petroselinumcrispum)中的4cl基因进行密码子优化，并在前端加上trc启动子序列和EcoRI酶切位点，末端加上BamHI酶切位点。利用在线软件DNAWorks设计引物，用重组PCR的方法进行基因合成，并用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(2)合成对香豆酰辅酶A连接酶(4cl)片段：
利用步骤(1)中得到的基因片段为模板，采用常规方法进行PCR扩增，该过程可参考《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行。
PCR引物：4cl基因上游引物4cl-F：5′-catgctcgagatgggtgactgcgttgccc-3′，下游引物4cl-R：5′-catgggatccttacttcggcaggtcgccg-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是XhoI和BamHI的酶切位点。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(3)将实施例1中得到的pAM2质粒和步骤(2)中的4cl基因片段分别利用NEB的限制性内切酶XhoI和BamHI进行双酶切。将酶切后的4cl基因片段和pAM2质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-4cl。
(4)合成芪合酶基因(sts)片段、查耳酮合酶基因(chs)片段和姜黄素合酶基因(cus)片段：
利用在线软件JCat，根据集胞藻PCC7942的密码子偏好性将落花生(Arachishypogaea)中的sts基因、矮牵牛(Petuniahybrida)中的chs基因和水稻(Oryzasativa)中的cus基因进行密码子优化，并在前端加上EcoRI酶切位点，末端加上AflII酶切位点。利用在线软件DNAWorks设计引物，用重组PCR的方法进行基因合成，并用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(5)将步骤(4)中得到的sts和cus基因片段与分别与步骤(3)中的pAM-4cl质粒利用NEB的限制性内切酶EcoRI和AflII进行双酶切。将酶切后的sts、cus基因片段和pAM-4cl质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收，分别用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-sts-4cl和pAM-cus-4cl。
(6)合成查尔酮异构酶基因(chi)片段：
利用在线软件JCat，根据集胞藻PCC7942的密码子偏好性将拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的chi基因进行密码子优化，并在前端加上XhoI酶切位点，末端加上EcoRI酶切位点。利用在线软件DNAWorks设计引物，用重组PCR的方法进行基因合成，并用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(7)将实施例1中得到的pAM2质粒和步骤(4)中的chs基因片段分别利用NEB的限制性内切酶EcoRI和AflII进行双酶切。将酶切后的chs基因片段和pAM2质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-chs。
(8)将步骤(7)中的pAM-chs质粒利用NEB的限制性内切酶EcoRI和AflII进行双酶切。将步骤(1)中的基因片段利用NEB的限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切。将步骤(6)中的chi基因片段利用NEB的限制性内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切。将酶切后的两个基因片段和pAM-chs质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-chs-chi-4cl。
(9)利用实施例1中的pAM-aroGfbr-sam8质粒为模板，采用常规方法进行PCR扩增两个含有不同酶切位点的Ptrc启动子、aroGfbr和sam8基因片段，该过程可参考《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行
启动子Ptrc1的PCR引物：上游引物Ptrc1-F：
5′-catgcttaagcagcttatcatcgactgcacg-3′，下游引物Ptrc1-R：
5′-catggtcgacctctgtttcctgtgtgaaattgtt-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是
AflII和SalI的酶切位点。
启动子Ptrc2的PCR引物：上游引物Ptrc2-F：
5′-catgaagcttcagcttatcatcgactgcacg-3′，下游引物Ptrc2-R：
5′-catgctcgagctctgtttcctgtgtgaaattgtt-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是
AflII和SalI的酶切位点。
片段aroGfbr的PCR引物：上游引物aroGfbr-F：
5′-catggtcgacatgaattatcagaacgatttacg-3′，下游引物aroGfbr-R：
5′-catgaagcttacccgcgacgcgct-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是SalI和
HindIII的酶切位点。
片段sam8的PCR引物：上游引物sam8-F：
5′-catgctcgagatgacgcaggtcgtggaacg-3′，下游引物sam8-R：
5′-catgagatctttatccgaaatccttcccgt-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是XhoI和BglII的酶切位点。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(10)将步骤(5)中的pAM-sts-4cl和pAM-cus-4cl质粒以及步骤(8)中的pAM-chs-chi-4cl质粒利用NEB的限制性内切酶AflII和BglII进行双酶切。将步骤(9)中的Ptrc1基因片段利用NEB的限制性内切酶AflII和SalI进行双酶切。将步骤(9)中的Ptrc2基因片段利用NEB的限制性内切酶AflII和SalI进行双酶切。将步骤(9)中的aroGfbr基因片段利用NEB的限制性内切酶SalI和HindIII进行双酶切。将步骤(9)中的sam8基因片段利用NEB的限制性内切酶XhoI和BglII进行双酶切。将酶切后的基因片段和质粒用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收。将回收后的四个基因片段分别与三个质粒用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-sts-4cl-sam8-aroGfbr、pAM-chs-chi-4cl-sam8-aroGfbr和pAM-cus-4cl-sam8-aroGfbr。
实施例3
构建表达质粒pAM-sam8-aroGfbr-ref8和pAM-sam8-aroGfbr-ref8-comt：
(1)合成对香豆酸羟化酶(ref8)片段：
利用在线软件JCat，根据集胞藻PCC7942的密码子偏好性将拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的ref8基因进行密码子优化，并在前端加上EcoRI酶切位点，末端加上AflII酶切位点。利用在线软件DNAWorks设计引物，用重组PCR的方法进行基因合成，并用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。
(2)将实施例1中得到的pAM2质粒和步骤(2)中的ref8基因片段分别利用NEB的限制性内切酶EcoRI和AflII进行双酶切。将酶切后的ref8基因片段和pAM2质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit参照说明书中描述的方法进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接过程参照说明书中的方法，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-ref8。
(3)利用实施例1中得到的pAM-sts-4cl-sam8-aroGfbr质粒为模板，采用常规方法进行PCR扩增串联的Ptrc1-aroGfbr-Ptrc2-sam8基因片段，该过程可参考《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法。
PCR引物：基因上游引物Ptrc1-F：5′-catgcttaagcagcttatcatcgactgcacg-3′，下游引物sam8-R：5′-catgagatctttatccgaaatccttcccgt-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是AflII和BglII的酶切位点。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(4)将步骤中(2)得到的pAM-ref8质粒和步骤(3)中的Ptrc1-aroGfbr-Ptrc2-sam8基因片段分别利用NEB的限制性内切酶AflII和BglII进行双酶切。将酶切后的Ptrc1-aroGfbr-Ptrc2-sam8基因片段和pAM-ref8质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-sam8-aroGfbr-sam5。
(5)合成咖啡酸甲基转移酶基因(comt)片段：
利用在线软件JCat，根据集胞藻PCC7942的密码子偏好性将拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的comt基因进行密码子优化，并在前端加上XhoI酶切位点，末端加上BamHI酶切位点。利用在线软件DNAWorks设计引物，用重组PCR的方法进行基因合成，并用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit对DNA片段进行切胶回收。
(6)将步骤中(4)得到的pAM-sam8-aroGfbr-sam5质粒和步骤(5)中的comt基因片段分别利用NEB的限制性内切酶AflII和BglII进行双酶切。将酶切后的comt基因片段和pAM-sam8-aroGfbr-sam5质粒分别用Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行回收，用T4DNA连接酶(购买自NewEnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pAM-sam8-aroGfbr-ref8-comt。
实施例4
蓝藻的转化及基因工程蓝藻的获得：
(1)蓝藻菌株转化：
取处于对数生长期(OD730至0.4-0.8)的蓝藻细胞10ml，5000转/分钟离心5分钟后收集菌体，用无菌的10mMNaCl洗涤一次，再用5ml新鲜的BG11培养基将菌体重悬。取500ul菌液至EP管中，加入终浓度为100ng/ml的重组质粒，混匀后，30℃避光培养12-18小时。将蓝藻细胞与重组质粒DNA的混合物涂布于BG11固体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)，置于30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养10-14天，至固体培养基上出现单菌落。
(2)基因工程蓝藻的获得：
从步骤(1)所述转化后的固体培养基上挑取转化子，接入5ml新鲜的BG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)，置于30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天。采用常规的方法制备基因工程蓝藻的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备方法；利用基因工程蓝藻基因组为模板，以转入重组质粒上外源基因的扩增引物，采用常规方法进行PCR扩增验证。
(3)基因工程蓝藻的保存：
将步骤(2)获得的基因工程蓝藻接种于含有20μg/mL壮观霉素的BG11液体培养基中，置于30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天；在无菌操作下，取过夜培养物1mL加入到灭菌的1.5mL离心管中，5000转/分钟离心3min。丢弃上清，用灭菌的15％甘油溶液将菌体沉淀重悬，制备成为甘油保藏管，于-20℃冰箱中可保存半年至一年。每隔半年，取出甘油保藏管中保存的基因工程蓝藻进行活化，并重新保存甘油保藏管。
实施例5
利用基因工程蓝藻S-COU生产对香豆酸：
(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-COU接种到含有20μg/mL壮观霉素的BG11固体培养基上，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养10-15天；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-COU，用接种环接种到5mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，30℃培养3-5天至OD730达到0.5-0.6，加入1mMIPTG，30℃诱导培养10-15天，得到含对香豆酸的转化液；
(4)对香豆酸的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为对香豆酸；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的对香豆酸粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，鉴定结果如图2所示，确定所得样品为对香豆酸。用HPLC检测，图1为转化培养中对香豆酸浓度随时间的变化图，对香豆酸的最高产量为128.2mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，对香豆酸出峰时间为5.50分钟。
该实施例制备的对香豆酸的LC-ESI-MS检测图谱如图2所示。
实施例6
利用基因工程蓝藻S-CAF生产咖啡酸：
(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-CAF接种到含有20μg/mL壮观霉素的BG11固体培养基上，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养10-15天；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-CAF，用接种环接种到5mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，30℃培养3-5天至OD730达到0.5-0.6，加入1mMIPTG，30℃诱导培养10-15天，得到含咖啡酸的转化液；
(4)咖啡酸的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为咖啡酸；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的咖啡酸粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，鉴定结果如图3所示，确定所得样品为咖啡酸。用HPLC检测，咖啡酸的最高产量为4.7mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，咖啡酸出峰时间为4.89分钟。
该实施例制备的对咖啡酸的LC-ESI-MS检测图谱如图3所示。
实施例7
利用基因工程蓝藻S-FER生产阿魏酸：
(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-FER接种到含有20μg/mL壮观霉素的BG11固体培养基上，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养10-15天；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-FER，用接种环接种到5mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，30℃培养3-5天至OD730达到0.5-0.6，加入1mMIPTG，30℃诱导培养10-15天，得到含阿魏酸的转化液；
(4)阿魏酸的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为阿魏酸；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的阿魏酸粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，鉴定结果如图4所示，确定所得样品为阿魏酸。用HPLC检测，阿魏酸的最高产量为6.3mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，阿魏酸出峰时间为5.67分钟。
该实施例制备的对阿魏酸的LC-ESI-MS检测图谱如图4所示。
实施例8
利用基因工程蓝藻S-REV生产白藜芦醇：
(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-REV接种到含有20μg/mL壮观霉素的BG11固体培养基上，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养10-15天；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-NAR，用接种环接种到5mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，30℃培养3-5天至OD730达到0.5-0.6，加入1mMIPTG，30℃诱导培养10-15天，得到含白藜芦醇的转化液；
(4)白藜芦醇的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为白藜芦醇；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的白藜芦醇粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，鉴定结果如图5所示，确定所得样品为白藜芦醇。用HPLC检测，白藜芦醇的最高产量为4.6mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，白藜芦醇出峰时间为6.34分钟。
该实施例制备的对白藜芦醇的LC-ESI-MS检测图谱如图5所示。
实施例9
利用基因工程蓝藻S-NAR生产柚皮素：
(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-NAR接种到含有20μg/mL壮观霉素的BG11固体培养基上，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养10-15天；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-NAR，用接种环接种到5mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，30℃培养3-5天至OD730达到0.5-0.6，加入1mMIPTG，30℃诱导培养10-15天，得到含柚皮素的转化液；
(4)柚皮素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为柚皮素；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的柚皮素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，鉴定结果如图6所示，确定所得样品为柚皮素。用HPLC检测，柚皮素的最高产量为7.1mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，柚皮素出峰时间为7.18分钟。
该实施例制备的对柚皮素的LC-ESI-MS检测图谱如图6所示。
实施例10
利用基因工程蓝藻S-DC生产双去甲氧基姜黄素：
(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-DC接种到含有20μg/mL壮观霉素的BG11固体培养基上，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养10-15天；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-DC，用接种环接种到5mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s-1·m-2的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mLBG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，30℃培养3-5天至OD730达到0.5-0.6，加入1mMIPTG，30℃诱导培养10-15天，得到含双去甲氧基姜黄素的转化液；
(4)双去甲氧基姜黄素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为双去甲氧基姜黄素；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的双去甲氧基姜黄素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，鉴定结果如图7所示，确定所得样品为双去甲氧基姜黄素。用HPLC检测，双去甲氧基姜黄素的最高产量为4.1mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，双去甲氧基姜黄素出峰时间为8.47分钟。
该实施例制备的对双去甲氧基姜黄素的LC-ESI-MS检测图谱如图7所示。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。