本发明涉及一种杂合抗菌肽突变体cam-w融合基因及其重组表达方法，具体涉及一种天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w融合基因及其重组表达方法。
背景技术：
抗菌肽(antimicrobialpeptides)是一类具有抗菌活性多肽的总称。1981年瑞典科学家boman等从惜古比天蚕(hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种抗菌肽，并将其命名为cecropin，中文名为天蚕素。天蚕素对革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌具有很强的杀伤作用，而对真核细胞没有毒性。天蚕素抗菌肽一般含有37～39个氨基酸残基，半胱氨酸含量低，其n端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在c端区域可形成疏水螺旋，且两者之间由甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的c端被酰胺化，而酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。
蜂毒素(melittin)是蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌出的具有芳香气味的透明毒液(蜂毒)的重要组成部分，占蜂毒干重的50％以上，由26个氨基酸组成，相对分子质量2984，不含二硫键，是蜂毒中的主要活性物质，具有抗菌、抗辐射和非常显著的抗炎镇痛作用。蜂毒素能够抑制20～30种革兰氏阴性及革兰氏阳性病原微生物的发育，并能对抗对青霉素有耐药性的金黄色葡萄球菌。蜂毒素是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍。由于许多疼痛是炎症导致的，因此蜂毒素在治疗关节炎、痛风等炎性疼痛方面，具有显著的成效。近年来的研究表明，蜂毒素还具有抑制肿瘤生长的作用，从而进一步拓宽了蜂毒素的应用范围。
目前，由于抗菌肽的组成特点是由氨基酸组成，基本不含外源成分及化学修饰，不需要翻译后加工修饰。因此，抗菌肽可以采取原核表达系统进行表达，但由于抗菌肽本身对宿主细胞也有一定的伤害作用，同时分子量较小的小肽也不能直接进行表达，需要借助融合蛋白来适时封闭抗菌肽的毒性。而融合蛋白的合成，迄今为止，主要使用大肠杆菌和酵母菌作为重组技术工业规模生产蛋白质的宿主菌细胞，由于大肠杆菌表达系统所表达的目的蛋白一般存在于细胞内并且容易形成包涵体，这就导致获得目的蛋白的后处理工艺比较复杂、成本也会比较高。酵母菌表达系统生物合成外源蛋白周期较长，导致其生产外源蛋白的成本也较高。但是，枯草芽孢杆菌表达系统合成目的蛋白的周期短、可以把目的蛋白分泌到细胞外并且不易生成包涵体，是一个比较理想的表达系统；而且枯草芽孢杆菌wb700为7种蛋白酶缺陷型菌株，可以在很大程度上降低分泌到细胞外的目的蛋白降解，提高目的蛋白的产率。利用定点突变技术突变特殊位点氨基酸产生的突变体eddie，能避免体内剪切，在体外能够增加蛋白质的溶解性，并能够准确剪切和快速折叠，这个突变蛋白被命名为eddie。eddie蛋白来源于npro蛋白，npro蛋白是猪瘟病毒外壳蛋白的一部分，由168个氨基酸组成，它能将联在其c端的蛋白质准确地剪切下来，而形成具有原始n端的蛋白质；它还能在原核细菌中高效表达，其由高度疏水氨基酸组成，易形成包涵体；同时原始自我剪切蛋白npro在细胞内也有部分自我剪切的功能，用它表达抗菌肽时会对宿主细胞产生毒害作用。天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w是近年来在天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽cam的基础上经定点突变而来，具有高效杀菌活性和低细胞毒性，同时具有很好的生物学稳定性。耐高温、耐酶解、酸碱耐受范围也较广，是一种综合表现比较优良的、在生物医药、食品防腐、畜牧业安全生产等领域有着广泛应用前景的抗菌肽。因此，如若能以枯草芽孢杆菌wb700为宿主，以天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w的基因与突变体eddie的基因融合，合成新的融合蛋白来封闭抗菌肽的毒性，必将产生良好的社会效益和经济效益。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种杂合抗菌肽突变体cam-w融合基因及其重组表达方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种杂合抗菌肽突变体cam-w融合基因，以pgj222为表达载体，以枯草芽孢杆菌wb700为宿主，以天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w的基因与猪瘟病毒外壳蛋白突变体eddie的基因融合，合成编码edd用-cam-w融合基因的重组表达，所述eddie-cam-w融合基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。
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进一步，所述编码eddie-cam-w融合基因的融合蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。
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本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种杂合抗菌肽突变体cam-w融合基因的重组表达方法，是以pgj222为表达载体，以枯草芽孢杆菌wb700为宿主，以天蚕素一蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w的基因与猪瘟病毒外壳蛋白突变体eddie的基因融合，合成编码eddie-cam-w融合基因的重组表达。
进一步，所述杂合抗菌肽突变体cam-w融合基因的重组表达方法，包括以下步骤：
(1)将天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w的基因与猪瘟病毒定点突变外壳蛋白eddie和果聚糖蔗糖酶信号肽sacb基因融合，合成编码sacb-eddie-cam-w融合蛋白的融合基因；
(2)用限制性内切酶ecori和saci对sacb-eddie-cam-w融合蛋白的基因进行双酶切，并与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体pgj222质粒连接，构建一种可以自我裂解释放出有生物学活性抗菌肽蛋白的表达载体pdm031；
(3)将大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pdm031转化至大肠杆菌dh5α菌株，获得重组大肠杆菌ewd31菌株，并扩增质粒pdm031；
(4)将在大肠杆菌dh5α菌株中扩增后的pdm031转化至枯草芽孢杆菌wb700菌株，获得可以向胞外表达eddie-cam-w融合蛋白的重组枯草芽孢杆菌bwd31菌株；
(5)通过在液体培养基中培养重组bwd31菌株并使用5％麦芽糖诱导，获得分泌到细胞外的eddie-cam-w融合蛋白。
进一步，步骤(1)中，在eddie的dna序列n-末端连上亲和层析纯化的sacb的dna序列，在其c-末端连上cam-w的dna序列，并在整个融合dna序列的5’端和3’端分别加上ecori和saci酶切位点及相应保护碱基。
进一步，步骤(5)中，将重组枯草芽孢杆菌bwd31菌株在固体培养基上的单克隆子，接种到含有5μg/ml氯霉素50μg/ml壮观霉素的lb液体培养基中，在37℃、225rpm/min条件下培养10～12h；然后以5％的比例转接到上述含双抗培养基中，在30℃、200rpm/min条件下培养至菌液od值到1.5～2.0之间，5％麦芽糖诱导12～24h；收集、离心并过滤菌液；通过eddie蛋白的自切割功能，即可获得天蚕素一蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w的粗蛋白液。
与现有技术相比，本发明具有以下预想不到的技术效果：
(1)本发明通过猪瘟病毒定点突变外壳蛋白eddie与抗菌肽cam-w基因融合，以借助eddie蛋白封闭抗菌肽cam-w的毒性，使融合蛋白的毒性减弱，蛋白表达量明显提高；同时可在细胞外通过eddie自切割功能的释放出有生物学活性的cam-w。
(2)本发明的抗菌肽cam-w的重组融合表达可促使重组蛋白胞内区域化，降低对酶解的敏感性。
(3)本发明重组表达系统的构建简单方便，成本低，可为在医药、兽药、水产、饲料添加剂等产业取代抗生素奠定了基础。
实验证明，本发明制备的天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w蛋白纯度可达到80％以上。
附图说明
图1为抗菌肽cam-w表达工艺相关节点的tricine-sds-page分析及westernblot验证图。其中，(a)胞外总蛋白tricine-sds-page分析图，泳道1为蛋白marker，泳道2为重组枯草芽孢杆菌bwd31未经5％麦芽糖诱导的发酵液上清里的总蛋白，泳道3为重组枯草芽孢杆菌bwd31经5％麦芽糖诱导后发酵液上清里的总蛋白；(b)eddie的westernblot检测图，泳道1为为重组枯草芽孢杆菌bwd31未经5％麦芽糖诱导的发酵液上清总蛋白的eddie抗体检测情况，泳道2为重组枯草芽孢杆菌bwd31经5％麦芽糖诱导后发酵液上清总蛋白eddie抗体检测情况；(c)cam-w的westernblot检测图，泳道1为为重组枯草芽孢杆菌bwd31未经5％麦芽糖诱导的发酵液上清总蛋白cam-w抗体检测情况，泳道2为重组枯草芽孢杆菌bwd31经5％麦芽糖诱导后发酵液上清总蛋白的cam-w抗体检测情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
cam-w的基因，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pgj222，购自金艮生物科技(北京)有限公司；宿主细胞枯草芽孢杆菌wb700菌株，购自金艮生物科技(北京)有限公司。
实施例1：天蚕素一蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w蛋白的制备
1、融合蛋白sacb-eddie-cam-w基因的人工合成
根据枯草芽孢杆菌的偏爱密码子优化猪瘟病毒定点突变外壳蛋白(eddie)、天蚕素一蜂毒素杂合抗菌肽突变体(cam-w)和果聚糖蔗糖酶信号肽(sacb)的基因序列，采用固相亚磷酰胺三脂法合成如下片段：在eddie的dna序列n-末端连上亲和层析纯化的sacb的dna序列；在其c-末端连上cam-w的dna序列；并在整个融合dna序列的5’端和3’端分别加上ecori和saci酶切位点及相应保护碱基。合成的eddie-cam-w融合基因的核苷酸序列为：
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编码eddie-cam-w融合基因的融合蛋白的氨基酸序列为：
mnikkfakqatvltfttallaggatqafahhhhhhmelnhfellyktnkqkpvgveepvydttg。
2、pgj222-sacb-eddie-cam-w(pdm031)表达载体的构建
用限制性内切酶ecori和saci对人工合成的sacb-eddie-cam-w融合蛋白的基因进行双酶切，并与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体pgj222质粒连接，构建一种可以自我裂解释放出有生物学活性抗菌肽蛋白的表达载体pgj222-sacb-eddie-cam-w(pdm031)。
3、表达cam-w的重组枯草芽孢杆菌bwd31的获取
将大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pdm031转化至大肠杆菌dh5d菌株，获得重组大肠杆菌ewd31菌株，并扩增质粒pdm031；将在大肠杆菌dh5α菌株中扩增后的pdm031转化至枯草芽孢杆菌wb700菌株，获得可以向胞外表达eddie-cam-w融合蛋白的重组枯草芽孢杆菌bwd31菌株。
4、杂合抗菌肽cam-w的获得
(1)发酵种子液制备：将重组枯草芽孢杆菌bwd31菌株在固体培养基上的单克隆子，接种到含有5μg/ml氯霉素50μg/ml壮观霉素的lb液体培养基中，在37℃、225rpm/min条件下培养12h；
(2)发酵扩大培养：以5％的比例转接到上述含双抗培养基中，在30℃、200rpm/min条件下培养至菌液od值到1.5～2.0之间，5％麦芽糖诱导12～24h；收集、离心并过滤菌液；
(3)获得抗菌肽cam-w：通过eddie蛋白的自切割功能，即可获得天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w的粗蛋白液。
5、发酵液中cam-w含量分析
将cam-w粗蛋白液进行tricine-sds-page分析，经考马斯亮蓝染色和bandscan软件分析，见图1。由此证实实施例1制备的天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体cam-w蛋白含量可达到80％以上。