用于遗传工程改造的细胞中调节抑制性相互作用的组合物和方法与流程

技术特征：

1.一种工程改造的T细胞，其包括：

(a)特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；和

(b)抑制性核酸分子，其减少PD-L1的表达或能够造成PD-L1的表达的减少。

2.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。

3.如权利要求1或权利要求2所述的细胞，其中，所述抑制性核酸是或包括或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。

4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的序列。

5.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的反义寡核苷酸。

6.一种遗传工程改造的T细胞，其包括：

(a)特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；和

(b)被破坏的编码PD-L1的基因，用于破坏编码PD-L1的基因的物质和/或对编码PD-L1的基因的破坏。

7.如权利要求6所述的细胞，其中，所述基因的破坏是通过基因编辑核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)/Cas9、和/或TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的。

8.如权利要求6或权利要求7所述的细胞，其中，所述破坏包括使所述基因的至少一个外显子的至少部分缺失。

9.如权利要求6-8中任一项所述的细胞，其中：

所述破坏包括所述基因中的缺失、突变和/或插入，其导致在所述基因中存在提早终止密码子；和/或

所述破坏包括所述基因的第一或第二外显子内的缺失、突变和/或插入。

10.如权利要求1-9中任一项所述的细胞，其中，与不存在所述物质或基因破坏或不存在所述T细胞活化条件下T细胞中的表达相比，T细胞中PD-L1的表达减少至少50、60、70、80、90或95％。

11.一种遗传工程改造的T细胞，其包括：

(a)特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；和

(b)编码减少或破坏所述细胞中PD-1或PD-L1表达的一种或多种分子的多核苷酸，其中所述多核苷酸的活性或表达是条件型的。

12.如权利要求11所述的细胞，其中，所述表达受到条件型启动子或增强子或反式激活因子的控制。

13.如权利要求12所述的细胞，其中，所述条件型启动子或增强子或反式激活因子是诱导型启动子、增强子或反式激活因子或阻遏型启动子、增强子或反式激活因子。

14.如权利要求11-13中任一项所述的遗传工程改造的T细胞，其中，减少或破坏PD-1或PD-L1表达的所述分子是或包括或编码反义分子，siRNA，shRNA，miRNA，基因编辑核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)，TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas9组合，其特异性地结合、识别或杂交所述基因。

15.如权利要求12-14中任一项所述的细胞，其中，所述启动子选自RNA pol I、pol II或pol III启动子。

16.如权利要求15所述的细胞，其中，所述启动子选自：

pol III启动子，其为U6或H1启动子；或

pol II启动子，其为CMV、SV40早期区或腺病毒主要晚期启动子。

17.如权利要求12-16中任一项所述的细胞，其中，所述启动子是诱导型启动子。

18.如权利要求17所述的细胞，其中，所述启动子包括Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，或是其类似物。

19.如权利要求12-16中任一项所述的细胞，其中，所述启动子是阻遏型启动子。

20.如权利要求19所述的细胞，其中，所述启动子包括Lac阻遏型元件或四环素阻遏型元件，或是其类似物。

21.如权利要求1-20中任一项所述的细胞，其中，所述T细胞是CD4+或CD8+T细胞。

22.如权利要求1-21中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是功能性非T细胞受体。

23.如权利要求1-22中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。

24.如权利要求23所述的细胞，其中，所述CAR包括特异性结合所述抗原的胞外抗原识别结构域和包括ITAM的胞内信号转导结构域。

25.如权利要求24所述的细胞，其中，所述胞内信号转导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内结构域。

26.如权利要求24或25所述的细胞，其中，所述CAR还包括共刺激信号转导区域。

27.如权利要求26所述的细胞，其中，所述共刺激信号转导区域包括CD28或4-1BB的信号转导结构域。

28.如权利要求26或权利要求27所述的细胞，其中，所述共刺激信号转导区域是CD28的信号转导结构域。

29.如权利要求1-28中任一项所述的细胞，其是人细胞。

30.如权利要求1-29中任一项所述的细胞，其是分离的细胞。

31.一种核酸分子，其包括第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸任选地是第一表达盒，其编码抗原受体(CAR)，所述第二核酸任选地是第二表达盒，其编码针对PD-1或PD-L1的抑制性核酸分子。

32.如权利要求31所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。

33.如权利要求31或权利要求32所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子是或包括或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。

34.如权利要求31-33中任一项所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的序列。

35.如权利要求31所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的反义寡核苷酸。

36.如权利要求31-35中任一项所述的核酸分子，其中，所述抗原受体是功能性非T细胞受体。

37.如权利要求31-36中任一项所述的核酸分子，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。

38.如权利要求37所述的核酸分子，其中，所述CAR包括特异性结合所述抗原的胞外抗原识别结构域和包括ITAM的胞内信号转导结构域。

39.如权利要求38所述的核酸分子，其中，所述胞内信号转导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内结构域。

40.如权利要求38或39所述的核酸分子，其中，所述CAR还包括共刺激信号转导区域。

41.如权利要求40所述的核酸分子，其中，所述共刺激信号转导区域包括CD28或4-1BB的信号转导结构域。

42.如权利要求40或权利要求41所述的核酸分子，其中，所述共刺激信号转导区域是CD28的信号转导结构域。

43.如权利要求31-42中任一项所述的核酸分子，其中，所述第一和第二核酸，任选地所述第一和第二表达盒，可操作地连接相同或不同的启动子。

44.如权利要求31-43中任一项所述的核酸分子，其中，所述第一核酸，任选地第一表达盒，可操作地连接诱导型启动子或阻遏型启动子，并且所述第二核酸，任选地第二表达盒，可操作地连接组成型启动子。

45.如权利要求31-44中任一项所述的核酸分子，其是分离的。

46.一种载体，其包括权利要求31-45中任一项所述的核酸分子。

47.如权利要求46所述的载体，其中，所述载体是质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

48.如权利要求47所述的载体，其是整合酶缺陷型的。

49.一种T细胞，其包括权利要求31-45中任一项所述的核酸分子或权利要求46-48中任一项所述的载体。

50.如权利要求49所述的T细胞，其是CD4+或CD8+T细胞。

51.如权利要求49或权利要求50所述的T细胞，其是人细胞。

52.如权利要求49-51中任一项所述的T细胞，其是分离的。

53.一种药物组合物，其包括如权利要求1-30或49-52中任一项所述的细胞和药学上可接受的运载体。

54.一种产生遗传工程改造的T细胞的方法，包括：

(a)将特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体导入包括T细胞的细胞群；并且

(b)将如下物质导入所述细胞群：相较于在一种或多种条件下孵育的没有导入所述物质的对应细胞群中T细胞中PD-L1的表达和/或上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件孵育的群中的T细胞中导致PD-L1表达的减少和/或抑制PD-L1的上调。

其中，步骤(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行，从而将所述遗传工程改造的抗原受体和所述物质导入所述群中的T细胞。

55.一种调节遗传工程改造的T细胞中PD-L1表达的方法，其包括，将如下物质导入T细胞：相较于经一种或多种条件下孵育的没有导入所述物质的对应T细胞中PD-L1的表达或上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件孵育的所述细胞中导致PD-L1表达的减少和/或抑制PD-L1的上调，所述T细胞包括特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体。

56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中，在具有抗原存在的条件下的孵育诱导所述对应群中PD-L1的表达或上调，所述对应群包括未导入所述物质的T细胞。

57.如权利要求56所述的方法，其中，在抗原存在下的所述孵育包括在体外孵育所述细胞与所述抗原。

58.如权利要求57所述的方法，其中，在抗原存在下的所述孵育进行：2小时至48小时，6小时至30小时或12小时至24小时，各自包括端值，或少于48小时，少于36小时或少于24小时。

59.如权利要求56所述的方法，其中，所述孵育包括在条件下将所述细胞给予对象从而使得所述工程改造的抗原受体就所述孵育的至少部分而言特异性地结合所述抗原。

60.如权利要求59所述的方法，其中，将细胞给予所述对象后24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间内，所述孵育诱导表达或上调。

61.如权利要求54-60中任一项所述的方法，其中，所述PD-L1表达的减少或对PD-L1上调的抑制是至少或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

62.如权利要求54-61中任一项所述的方法，其是离体进行的。

63.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中，所述物质的导入通过导入包括所述物质编码序列的核酸来进行。

64.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其中，所述导入包括诱导所述物质在所述T细胞中的瞬时表达，以使所述细胞中PD-L1表达临时减少或破坏，和/或其中所述减少或破坏不是永久的。

65.如权利要求54-64中任一项所述的方法，其中，所述物质的活性或表达是条件型的。

66.如权利要求65所述的方法，其中，所述表达受到条件型启动子或增强子或反式激活因子的控制。

67.如权利要求66所述的方法，其中，所述条件型启动子或增强子或反式激活因子是诱导型启动子、增强子或反式激活因子或阻遏型启动子、增强子或反式激活因子。

68.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中，所述启动子选自RNA pol I、pol II或pol III启动子。

69.如权利要求68所述的方法，其中，所述启动子选自：

pol III启动子，其为U6或H1启动子；或

pol II启动子，其为CMV、SV40早期区或腺病毒主要晚期启动子。

70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中，所述启动子是诱导型启动子。

71.如权利要求70所述的方法，其中，所述启动子包括Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列。

72.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中，所述启动子是阻遏型启动子。

73.如权利要求72所述的方法，其中，所述启动子包括Lac阻遏型元件或四环素阻遏型元件。

74.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其中，所述物质在所述T细胞中稳定表达，以造成所述细胞中PD-L1表达的持续的减少或破坏。

75.如权利要求54-74中任一项所述的方法，其中，所述物质是包含在病毒载体中的核酸分子。

76.如权利要求75所述的方法，其中，所述病毒载体是腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或腺相关病毒载体。

77.如权利要求54-76中任一项所述的方法，其中，所述物质是使所述细胞中PD-L1表达减少的抑制性核酸分子。

78.如权利要求77所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。

79.如权利要求77或权利要求78所述的方法，其中，所述抑制性核酸是或包括或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。

80.如权利要求78或权利要求79所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的序列。

81.如权利要求77所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的反义寡核苷酸。

82.如权利要求54-81中任一项所述的方法，其中，造成减少和/或抑制上调包括破坏编码PD-L1的基因。

83.如权利要求82所述的方法，其中：

所述破坏包括在DNA水平上破坏所述基因，和/或

所述破坏是不可逆的；和/或

所述破坏不是瞬时的。

84.如权利要求82或83所述的方法，其中，所述破坏包括导入特异性结合或杂交所述基因的DNA结合蛋白或DNA-结合核酸。

85.如权利要求84所述的方法，其中，所述破坏包括导入：(i)包括DNA-靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或(ii)RNA-引导的核酸酶。

86.如权利要求85所述的方法，其中，所述DNA-靶向蛋白或RNA-引导的核酸酶包括锌指蛋白(ZFP)、TAL蛋白、或成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)，其对所述基因具有特异性。

87.如权利要求82-86中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括导入锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或CRISPR-Cas9组合，其特异性结合至、识别或杂交所述基因。

88.如权利要求84-87中任一项所述的方法，其中，所述导入通过导入包括编码DNA-结合蛋白、DNA-结合核酸、和/或包括DNA-结合蛋白或DNA-结合核酸的复合物的序列的核酸来进行。

89.如权利要求88所述的方法，其中，所述核酸在病毒载体中。

90.如权利要求84-89中任一项所述的方法，其中，对基因的特异性结合位于所述基因的外显子内和/或位于编码被编码多肽N末端的基因部分内。

91.如权利要求84-90中任一项所述的方法，其中，所述导入因此造成所述基因中的移码突变和/或在所述基因的编码区域内插入早期终止密码子。

92.如权利要求54-91中任一项所述的方法，其还包括，将如下物质导入细胞：相较于经一种或多种条件孵育的没有导入所述物质的对应细胞中PD-1的表达和上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件孵育的细胞中导致PD-1表达的减少和/或抑制PD-1的上调，其中所述表达的减少和/或上调的抑制是暂时的或瞬时的。

93.如权利要求92所述的方法，其中，所述物质在所述细胞中被诱导型表达或阻遏，以造成所述细胞中PD-1表达的条件型减少或破坏。

94.一种产生遗传工程改造的T细胞的方法，包括：

(a)将特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体导入包括T细胞的细胞群；并且

(b)将如下物质导入细胞群：相较于经一种或多种条件孵育的没有导入所述物质的对应细胞群的T细胞中PD-1的表达和上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件孵育的群的T细胞中瞬时减少PD-1表达和/或瞬时抑制PD-1上调。

其中，步骤(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行，从而将所述遗传工程改造的抗原受体和所述物质导入所述群中的T细胞。

95.一种调节遗传工程改造的T细胞中PD-1表达的方法，其包括，将如下物质导入T细胞：相较于经一种或多种条件孵育的没有导入所述物质的对应T细胞中PD-1的表达或上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件下孵育的细胞中瞬时减少PD-1表达和/或瞬时抑制PD-1上调，所述T细胞包括特异性结合抗原的抗原受体。

96.如权利要求94或权利要求95所述的方法，其中，瞬时减少包括所述细胞中PD-1表达的可逆减少。

97.如权利要求94-96中任一项所述的方法，其中，在具有抗原存在的条件下的孵育诱导所述对应群中PD-L1的表达或上调，所述对应群包括未导入所述物质的T细胞。

98.如权利要求97所述的方法，其中，在所述抗原存在下的所述孵育包括在体外孵育所述细胞与所述抗原。

99.如权利要求98所述的方法，其中，在所述抗原存在下的所述孵育进行：2小时至48小时，6小时至30小时或12小时至24小时，各自包括端值，或少于48小时，少于36小时或少于24小时。

100.如权利要求97所述的方法，其中，所述孵育包括在条件下将所述细胞给予对象从而使得所述工程改造的抗原受体就所述孵育的至少部分而言特异性地结合所述抗原。

101.如权利要求100所述的方法，其中，所述孵育诱导细胞给予所述对象后24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天时间内的表达或上调。

102.如权利要求94-101中任一项所述的方法，其中，所述PD-1表达的减少或PD-1上调的抑制是至少或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

103.如权利要求94-102中任一项所述的方法，其是离体进行的。

104.如权利要求94-103中任一项所述的方法，其中，(b)中所述的导入通过将包括所述物质编码序列的核酸导入所述细胞而进行。

105.如权利要求94-104中任一项所述的方法，其中，所述物质在所述细胞中瞬时表达，以造成所述T细胞中PD-1表达的暂时减少或破坏。

106.如权利要求94-105中任一项所述的方法，其中，所述物质的活性或表达是条件型的。

107.如权利要求106所述的方法，其中，所述表达受到条件型启动子或增强子或反式激活因子的控制。

108.如权利要求107所述的方法，其中，所述条件型启动子或增强子或反式激活因子是诱导型启动子、增强子或反式激活因子或阻遏型启动子、增强子或反式激活因子。

109.如权利要求108所述的方法，其中，所述启动子选自RNA pol I、pol II或pol III启动子。

110.如权利要求109所述的方法，其中，所述启动子选自：

pol III启动子，其为U6或H1启动子；或

pol II启动子，其为CMV、SV40早期区或腺病毒主要晚期启动子。

111.如权利要求108-110中任一项所述的方法，其中，所述启动子是诱导型启动子。

112.如权利要求111所述的方法，其中，所述启动子包括Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列。

113.如权利要求108-112中任一项所述的方法，其中，所述启动子是阻遏型启动子。

114.如权利要求113所述的方法，其中，所述启动子包括Lac阻遏型元件或四环素阻遏型元件。

115.如权利要求92-114中任一项所述的方法，其中，所述物质是使所述细胞中PD-1表达减少的抑制性核酸分子。

116.如权利要求115所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。

117.如权利要求115或权利要求116所述的方法，其中，所述抑制性核酸是或包括或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。

118.如权利要求115-117中任一项所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-1的核酸互补的序列。

119.如权利要求115所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-1的核酸互补的反义寡核苷酸。

120.如权利要求54-119中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是CD4+或CD8+T细胞。

121.如权利要求54-120中任一项所述的方法，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是功能性非T细胞受体。

122.如权利要求54-121中任一项所述的方法，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。

123.如权利要求122所述的方法，其中，所述CAR包括特异性结合所述抗原的胞外抗原识别结构域和包括ITAM的胞内信号转导结构域。

124.如权利要求123所述的方法，其中，所述胞内信号转导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内结构域。

125.如权利要求123或124所述的方法，其中，所述CAR还包括共刺激信号转导区域。

126.如权利要求125所述的方法，其中，所述共刺激信号转导区域包括CD28或4-1BB的信号转导结构域。

127.如权利要求125或权利要求126所述的方法，其中，所述共刺激信号转导区域是CD28的信号转导结构域。

128.如权利要求127所述的方法，其中，所述步骤(a)和(b)同时进行，所述步骤包括导入包括第一核酸和第二核酸的核酸分子，所述第一核酸任选地是第一表达盒，其编码所述抗原受体，所述第二核酸任选地是第二表达盒，其编码造成PD-1或PD-L1表达减少的物质。

129.如权利要求127或权利要求128所述的方法，其还包括将编码特异性结合相同或不同抗原的第二遗传工程改造的抗原受体的核酸分子导入细胞群，所述第二抗原受体包括不同于CD28的信号转导结构域的共刺激信号转导区域。

130.一种产生遗传工程改造的T细胞的方法，包括：

(a)将特异性结合第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体导入包括T细胞的细胞群；所述第一抗原受体包括CD28共刺激信号转导结构域；

(b)将编码特异性结合相同或不同抗原的第二遗传工程工程改造的抗原受体的核酸分子导入所述包括T细胞的细胞群；并且

(c)将如下物质导入所述包括T细胞的细胞群：相较于经一种或多种条件孵育的没有导入所述物质的对应细胞群的T细胞中PD-1和/或PD-L1表达或上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件孵育的所述群中的T细胞中导致PD-1或PD-L1表达的减少和/或抑制PD-1或PD-L1的上调。

131.如权利要求130所述的方法，其中，在具有抗原存在的条件下的孵育诱导所述对应群中PD-1和/或PD-L1的表达或上调，所述对应群包括未导入所述物质的T细胞。

132.如权利要求131所述的方法，其中，在抗原存在下的所述孵育包括在体外孵育所述细胞与所述抗原。

133.如权利要求132所述的方法，其中，在抗原存在下的所述孵育进行：2小时至48小时，6小时至30小时或12小时至24小时，各自包括端值，或少于48小时，少于36小时或少于24小时。

134.如权利要求131所述的方法，其中，所述孵育包括在条件下将所述细胞给予对象从而使得所述工程改造的抗原受体就所述孵育的至少部分而言特异性地结合所述抗原。

135.如权利要求134所述的方法，其中，所述孵育诱导细胞给予所述对象后24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天时间内的表达或上调。

136.如权利要求130-135中任一项所述的方法，其中，相较于未导入所述物质的方法产生的工程改造的细胞，所述细胞中PD-1和/或PD-L1的上调或表达被抑制或减少至少或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

137.如权利要求129-136中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二遗传工程改造的抗原受体结合相同的抗原。

138.如权利要求130-137中任一项所述的方法，其中，所述第二抗原受体包括不同于CD28的信号转导结构域的共刺激信号转导区域。

139.如权利要求129-138中任一项所述的方法，其中，所述不同于CD28的信号转导结构域的共刺激信号转导区域是4-1BB的信号转导结构域。

140.如权利要求130-139中任一项所述的方法，其中，所述物质造成PD-L1表达的减少和/或上调的抑制。

141.如权利要求130-140中任一项所述的方法，其中，步骤(a)至(c)以任意顺序同时进行，所述步骤包括，导入包括第一核酸、第二核酸和第三核酸的核酸分子，所述第一核酸任选地是第一表达盒，其编码所述第一抗原受体，所述第二核酸任选地是第二表达盒，其编码所述第二抗原受体，而所述第三核酸任选地是第三表达盒，其编码造成PD-1或PD-L1表达减少的物质。

142.如权利要求141所述的方法，其中，所述核酸，任选地所述表达盒，可操作地连接相同或不同的启动子。

143.如权利要求141或权利要求142的方法，其中，所述第一和/或第二核酸，任选地第一和/或第二表达盒，可操作地连接诱导型启动子或阻遏型启动子，并且所述第三核酸，任选地第三表达盒，可操作地连接组成型启动子。

144.如权利要求54-143中任一项所述的方法，其是人细胞。

145.一种产生遗传工程改造的T细胞的方法，包括：

(a)获得包括T细胞的原代细胞群；

(b)针对所述群中不表达靶抗原的细胞进行富集；和

(c)将特异性结合所述靶抗原的遗传工程改造的抗原受体导入所述细胞群，从而产生遗传工程改造的T细胞。

146.如权利要求145所述的方法，其还包括在刺激条件下培养和/或孵育所述细胞以使所述细胞增殖，其中所述细胞的增殖和/或扩增多于由所述方法产生但未针对不表达所述靶抗原的细胞进行富集的细胞。

147.如权利要求146所述的方法，其中，细胞的增殖和/或扩增是至少或至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。

148.如权利要求145-147中任一项所述的方法，其中，针对不表达靶抗原的细胞进行富集包括在所述群中进行负选择以清除表达靶抗原的细胞，或破坏细胞中编码所述靶抗原的基因。

149.如权利要求146-148中任一项所述的方法，其中，所述刺激条件包括如下物质：所述物质能够活化TCR复合物的一种或多种组分的一种或多种胞内信号转导结构域。

150.一种细胞，通过权利要求54-149中任一项所述的方法产生。

151.一种药物组合物，其包括权利要求150所述的细胞和药学上可接受的运载体。

152.一种治疗方法，其包括向具有疾病或病症的对象给予权利要求1-30、49-52或150中任一项所述的细胞或权利要求46或115所述的药物组合物。

153.如权利要求152所述的治疗方法，其中，将所述细胞以这样的剂量方案给予：

(a)将第一剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞给予所述对象；并且

(b)将继续剂量的表达CAR的细胞给予所述对象，所述继续剂量在当(a)中给予对象的表达CAR的细胞的表面上PD-L1表达被诱导或上调的时候给予，和/或所述继续剂量在(a)中的给予开始后至少5天给予所述对象。

154.一种治疗方法，其包括：

(a)将第一剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞给予所述对象；并且

(b)将继续剂量的表达CAR的细胞给予所述对象，所述继续剂量在当(a)中给予对象的表达CAR的细胞的表面上的PD-L1的表达被诱导或上调的时候给予，和/或所述继续剂量在(a)中的给予开始后至少5天给予所述对象。

155.如权利要求153或权利要求154所述的方法，其中，在(a)中的给予开始后至少或超过约5天并且不到约12天时给予所述继续剂量的细胞。

156.如权利要求153-155中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二剂量中给予的细胞的数量为约0.5x10⁶细胞/kg对象体重至4x10⁶细胞/kg，约0.75x10⁶细胞/kg至3.0x10⁶细胞/kg或约1x10⁶细胞/kg至2x10⁶细胞/kg，各自包括端值。

157.如权利要求152-156中任一项所述的方法，其中，所述遗传工程改造的抗原受体特异性结合与所述疾病或病症相关联的抗原。

158.如权利要求152-157中任一项所述的治疗方法，其中，所述疾病或病症是癌症。

159.如权利要求152-158中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是白血病或淋巴瘤。

160.如权利要求152-159中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是急性淋巴细胞性白血病。

161.如权利要求152-159中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。