用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物以及含有该引物的试剂盒，还涉及使用所述的引物以及试剂盒快速检测鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR方法，本发明属于生物技术检测领域，

背景技术：

沙门氏菌(Salmonella)是主要的食源性致病菌之一，其血清型众多，目前已经确定的血清型有2600多种，但只有某些特定的沙门氏菌血清型会感染人和动物。其中，鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)是严重影响我国禽养殖业发展的宿主特异性病原菌，其传播范围广，致病性强，主要感染21日龄以内的雏鸡，可以引起白色下痢，并且雏鸡感染后死亡率几乎100％；然而成年鸡感染鸡白痢沙门氏菌后通常没有临床症状，但作为病原携带者，不仅可以水平传播，而且可以垂直传播。因此，鸡白痢沙门氏菌是一种传播快、危害大的致病性病原菌。及时准确地检测出鸡白痢沙门氏菌，做出相应的防控措施显得尤为重要。

传统的沙门氏菌血清学检测仍然是通过细菌与特异性抗体的凝集反应鉴别其O抗原和H抗原，根据White-Kauffmann-Le Minor抗原表确定沙门氏菌的血清型。但该方法对某些血清型的鉴别容易混淆，甚至无法鉴别，如鸡白痢、鸡伤寒和肠炎三种沙门氏菌血清型的抗原结构相似，鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌没有运动性，H抗原检测结果为阴性，肠炎沙门氏菌H抗原容易发生变异，必须通过常规的生化鉴定才可以进一步确定这三种沙门氏菌血清型，这种常规的检测方法需要5至7天的时间，过程繁琐，耗时耗力。PCR作为病原检测的一种方法表现出巨大的潜力，它在检测病原菌时具有快速、灵敏、特异等优点。在我国，鸡白痢已经是我国家禽最主要的细菌病之一，并且被国家列为规定净化的细菌病，对鸡白痢沙门氏菌进行快速、准确的检测是净化和防治鸡白痢的关键。

技术实现要素：

针对鸡白痢沙门氏菌在检测过程中容易出现的问题，本发明的目的在于提供一种快速地、特异性地检测鸡白痢沙门氏菌的引物及其检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，本发明还提出了含有所述的特异性引物的PCR检测试剂盒。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，还含有PCR扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。

其中，优选的，所述的阳性对照为鸡白痢沙门氏菌菌株的基因组DNA或是含有SEQ ID NO.1所示序列的载体；所述的阴性对照为无菌水。

再进一步的，本发明还提出了使用所述试剂盒检测鸡白痢沙门氏菌的方法，其包括以下步骤：

步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用所述的试剂盒进行PCR扩增；

步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果在356bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸡白痢沙门氏菌。

其中，优选的，步骤一中所述PCR扩增所采用的检测体系为25μL反应体系包括：2×Premix Ex Taq 12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后灭菌去离子水补足至25μL。

其中，优选的，步骤一中所述PCR扩增所采用的扩增程序为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环共30个；循环结束后，72℃延伸7min，降温至10℃，结束。

更进一步的，本发明还提出了所述的引物或所述的试剂盒在制备检测鸡白痢沙门氏菌试剂中的应用。

优选的，所述的试剂用于区别鸡白痢沙门氏菌以及其他致病性沙门氏菌血清型。其中，优选的，所述的其他致病性沙门氏菌血清型包括鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型。

与现有检测技术相比较，本发明的有益效果在于：采用本发明的检测方法相比于其他检测方法具有明显优势。例如常规的细菌分离鉴定费时费力；平板凝集实验虽然快速简便，但容易出现假阳性，导致误淘，引起不必要的经济损失；免疫荧光、酶联免疫吸附等免疫学检测方法虽然比较准确，但由于这些方法的抗体制备困难，也不易于推广。但本发明建立的鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确，能够有效防止对鸡只的误淘汰；而且该方法操作简单、快速，在普通的分子实验室均可以进行，整个检测过程只需一天就可以完成，在我国提倡净化养殖场鸡白痢沙门氏菌的背景下，本发明具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中鸡白痢沙门氏菌SEEP17495基因特异性检测结果；其中，图A中，M：DL2000DNA Marker，1：鸡白痢沙门氏菌527，2：鸡白痢沙门氏菌528，3：大肠杆菌CVCC1555，4：大肠杆菌CVCC1560，5：单增李斯特菌，6：奇异变形杆菌，7：金黄色葡萄球菌，8：鲍曼不动杆菌，9：粘质沙雷氏菌，N：阴性对照。图B、C中，M：DL2000DNA Marker，1-31：分别对应表1中序号各菌株，N：阴性对照。

图2为本发明施例2中鸡白痢沙门氏菌灵敏度评价试验检测结果；其中，M：DL2000DNA Marker；1-7：分别对应浓度10⁶cfu/mL-10⁰cfu/mL，N：阴性对照。

图3为本发明施例3中鸡白痢沙门氏菌的鸡粪模拟样品检测灵敏度的试验结果；其中，M：DL2000DNA Marker；1-7：分别对应浓度10⁶cfu/mL-10⁰cfu/mL，N：阴性对照。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1引物设计

对GenBank中鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型全基因组进行全面的生物信息学分析，最终确定SEEP17495基因(SEQ ID NO.1所示)为鸡白痢沙门氏菌的检测靶基因。

根据SEEP17495基因，使用Oligo 6软件设计特异性引物，引物由苏州金唯智公司合成。引物序列如下：

SEEP17495-idF：5’CGATAATGGCAACCGCACTG 3’(SEQ ID NO.2所示)；

SEEP17495-idR：5’TGATGTCTGCCCCTTTCGAC 3’(SEQ ID NO.3所示)。

实施例2：鸡白痢沙门氏菌血清型PCR检测方法的建立

1、实验用菌株与试剂

实验菌株见表1，其中11株分离株为哈尔滨兽医研究所动物细菌病实验室分离鉴定。

Premix Ex Taq DNA聚合酶和Marker DL2000购自TaKaRa公司。

表1实验菌株

注：a：中国兽医微生物菌种保藏管理中心；b：中国医学细菌保藏管理中心；c：中国工业微生物菌种保藏管理中心；d：美国典型培养物保藏中心；e：本室保存

2、方法

步骤一，DNA模板制备

将表1所列菌株分别接种于5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将1mL过夜培养的菌液加入1.5mL Eppendorf离心管中，5000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体。加入200μL无菌去离子水，振荡混匀，100℃煮沸10min后，12000rpm离心10min，将上清转入新的1.5mL Eppendorf离心管中，作为模板，-20℃保存备。

步骤二，PCR检测方法特异性评价实验

PCR检测方法如下，配制如下扩增体系：Premix Ex Taq 12.5μL，上下游引物浓度10μmol/L，各加入0.5μL，模板1μL，以无菌水为模板作为反应的阴性对照，加入灭菌去离子水补足25μL，混匀。然后将反应管离心后，放入PCR反应仪中，按照以下PCR循环参数进行：在94℃预变性5min，接着作30个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，退火温度55℃，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸7min，最后降温至4℃，结束所有操作程序。

图1显示了所用菌株的检测结果，其中图A表示引物对鸡白痢沙门氏菌可以扩增出特异性目的条带，但对其他7株常见非沙门氏菌致病菌的扩增结果均为阴性；同时图B、C表示引物对其他29株常见致病性沙门氏菌血清型的扩增结果也为阴性。结果表明本发明设计的引物扩增鸡白痢沙门氏菌时具有良好的特异性。

步骤三，灵敏度评价试验

将鸡白痢沙门氏菌527标准株接种于5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，使用LB肉汤对过夜增菌液进行10×倍比稀释，稀释后取出100μL涂于LB平板，放在37℃温箱内培养12h至16h后计数；同时将稀释后的菌液按照步骤一所述方法提取基因组，制备模板，使用步骤二所述方法对其进行PCR扩增。

图2显示灵敏度评价结果，结果显示，鸡白痢沙门氏菌菌液浓度为10³cfu/mL时，可以有效地扩增出目的片段，但菌液浓度为10²cfu/mL或更低时扩增结果为阴性。结果表明，该PCR方法对鸡白痢沙门氏菌的最低检测浓度为10³cfu/mL，具有较好的灵敏度。

实施例3：鸡粪模拟样品检测灵敏度的试验

将高压灭菌后的鸡粪样品1g与1ml 10×倍比稀释后的菌液混合，加入LB肉汤定容至5ml，37℃，200rpm振荡培养5h；将培养液3000rpm离心3min后取上清，按照上述方法提取基因组，作为模板，使用实施例2所建立的PCR方法对其进行PCR扩增，产物使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

图3显示检测鸡粪模拟样品的灵敏度试验结果，结果显示，增菌5h时，可以检测到鸡粪样品中鸡白痢沙门氏菌的最小浓度为10³cfu/mL，但浓度为10²cfu/mL或更低浓度时PCR扩增结果为阴性，表示本发明的PCR方法在检测鸡粪中的鸡白痢沙门氏菌时也具有良好的灵敏度。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用

<130> KLPI170140

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3078

<212> DNA

<213> S. pullorum

<400> 1

atgagtgata ataacctgcg cctgcaggtc attcttaatg cggttgacaa actcacccgc 60

ccattccgtg ctgcacaggc cagttcgaaa gagctggctg gcgcaattca gaatacccga 120

aacagcctca aagaactgaa taagcaggct ggcagaattg atgaatttcg caagacgcgc 180

tcgcaactag ccataacagc caacaacctg aacgcagccc gcgaagaggc ggcaaaactc 240

gccacacaat ttgctgccac taacaggcca accgccgcgc aggcaaagtt attcagtcag 300

gccaaaacac gagtacagga acttcagcag acctataacg gcttgttggg ggcggtccag 360

agacaacgtc aggcacttaa agaatcaggg attgatacca gacaactcag tagtgcccag 420

cgagaactta agaaaaatgc cgaagaaact cgtcaggcac tagagggcca gcaaaaagca 480

cttaaacgtc tgggtgaaca acaggcacgg atgaacgctg ccagagaaca atactcaaga 540

cggcttgaag tgcgcgatcg catcgcagga gccggagcca ccaccacggc tgcagggctg 600

gcaatgggcg cgccagtgat ggcggcggta aaaagctata ccagcatgga agatgccatg 660

aaaggtgtgg caaagcaggt caatggtctg cgtgacgata atggcaaccg cactgcgcgt 720

ttttacgaaa tgcaggatgc catcaaagct gccagtgaac agctgccaat ggaaaacggt 780

gctgtggact tcgccgcact ggttgaaggt ggtgcgcgca tgaatgtggc aaaccctgac 840

gacagctggg aggaccagaa acgtgacctg ctggccttcg ccagtacggc agcaaaggcg 900

gcaacagcct ttgagctgcc agcggatgaa ctgtcagaaa gtctggggaa aatcgcccag 960

ctctacaaaa taccaacccg caatattgaa cagctcggtg atgcgctgaa ctatctggat 1020

gataacgcta tgtcgaaagg ggcagacatc attgatgtca tgcaacgcct gggcggtgtg 1080

gctgatcgtc tggattatcg taaagcggcg gcgctgggtt ccaccttcct gacactgggg 1140

gctgcgccgg aggtcgctgc cagtgctgcc aacgcggtgg tgcgtgaatt gtccattgcg 1200

accatgcaaa gcaagagttt ctttgaagga atgaatctgc tgaaactcaa tcctgaagtg 1260

attgaaaagc agatgacgaa ggatgcgatg ggaactatcc agcgcgtact ggagaaggtg 1320

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ggcgatgatg cggcgaaact ggcaaacaac ctgccggaac tgcagcgcca gctaaaactg 1440

acagcgggca atgatgcgct cggttcgatg cagaaagaat ccgacattaa caaggactca 1500

ctttctgcgc agtggttgtt ggtcaaaacc ggagcgcaga acaccttcag cagcctgggc 1560

gaaacgctgc gccagccgct gatggatatt ctgtacacgg tgaaaagcat cacgggggcg 1620

ttgcgtcgct gggtggaagc taaccctgaa ctgacgggca cactgatgaa agtagccgcg 1680

gttgtggctg ctgttactgt gggcctcggc accctggctg tggtgttggc tgctgtgctg 1740

gggccgctgg cagtcatccg tctgggattc tctgtgctgg gtatcaaaac gttaccttcc 1800

gttacggcag cagtaacgcg aaccagcagc gcgttgtcct ggttggcagg cgcaccactt 1860

gcactgctgc gacgcgggct tgcttcatcg ggcaacgccg caggtttact tactgcaccg 1920

ttgtcgtctt tgcgccgcac ggcatcactg acgggaaatg tcctgaaaac tgtagcaggt 1980

gcgccggttg cacttttgcg gtctggatta tccggtttac gtgctgttgc tgtgatgttt 2040

atgaatcctc tggcggtact gcgcggtgga ctggcctccg caggcacggt gctgcgagta 2100

ctggcatctg gtccactggc gatgctgcgc gttgccctgt atgccgtatc tggtctgtta 2160

ggtgctctgc tcagtccgat aggtcttgtg gttactgcac tggcgggcgt ggcgctggtt 2220

gtctggaaat actggcaacc catcaccgca tttcttggtg gcgtggtgga aggattcaaa 2280

gcggcggcag gtcccgtcag tgcagcattc gaaccgctta agcccgtgtt ccagtggatt 2340

ggcgacaaag tacaggcgct gtggggctgg tttactgatc tgctgacgcc cgttaagtcg 2400

acctctgccg aactgcagag tgcagcggca atggggcgac gattcgggga ggcactggcg 2460

gaagggctga atatggtcat gcatccgctg gactccctga aatccggcgt ttcctggttg 2520

ctggagaaac tcggcattgt cagtaaagag gctgcaaagg cgaaactgcc ggaaagagtg 2580

acgcgtcagc aacctgcgac ggtgaatgca gacggtaaag tgatgatgcc accgggtggt 2640

tttccgtcat ggggatatgg ctttgcgggg atgtatgaca gcggcggcta tatcccgcgc 2700

gggcagtttg gcatcgtcgg tgaaaacggg ccggaaattg ttaacggccc ggcaaatgtg 2760

accagccgga gaaatacagc tgcactggct gccgttgttg ccgaaatgat gggcgttgct 2820

gccgcgcctg cagagcttcc accgttgcat cctttggcac ttcccgcgaa aggcggcgaa 2880

gcgatggtga gtcgtgcagc cactgtaccg cccgttcacc ggattgaggc accgacgcag 2940

atcatcattc agacgcagcc aggacaaagt gcgcaggata ttgcgcggga ggtggcacgc 3000

cagcttgatg aacgtgaacg caggctgaag gcaaaagcca ggagtaacta cagcgatcag 3060

gggggatacg acgcatga 3078

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgataatggc aaccgcactg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgatgtctgc ccctttcgac 20