一种比拉底白刺NbCIPK25基因及其表达蛋白和应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种比拉底白刺NbCIPK25基因及其表达蛋白和应用。

背景技术：

比拉底白刺（Nitrariatangutorum）属于无患子目（Sapindales）白刺科（Nitrariaceae）白刺属（Nitraria），主要分布于澳大利亚南部干旱草原或沙漠，为澳洲特有白刺种类。白刺属为强旱生落叶灌木，具有极强耐盐抗旱性。研究表明，比拉底白刺不仅可以生存于含盐量达900mM的环境中，而且还可以改善盐性，提高土壤的肥力，对于生态平衡的维持具有重要作用。此外，白刺果实中含有丰富的生物碱、黄酮和酚酸等类活性物质，具有降血压，降血脂，抗氧化，抗肿瘤以及抗炎等药用价值。因此，白刺作为一种生态和经济植物逐渐受到关注。目前，比拉底白刺的研究主要包括种源分布，生物碱类活性物质及抗旱耐盐生理生化性质等方面，为比拉底白刺的育种，活性物质开发利用及抗逆分子机理的研究提供数据支持，也为抗性基因的挖掘与应用奠定基础。

CIPKs（CBL-interacting protein kinase），与CBL形成CBL-CIPK复合体，参与植物在胁迫环境中Ca²⁺的信号转导，为植物特有的Ser/Thr类磷酸蛋白激酶基因。CIPKs在N端有保守的激酶结构域，负责催化目的蛋白；C端含有NAF结构域，负责与CBL蛋白结合。目前数据表明，在模式植物拟南芥中有26个CIPK类同源异型盒基因，水稻中有30个CIPK类同源异型盒基因，杨树中有27个CIPK类同源异型基因。众多研究表明，CIPK类基因在植物耐盐，耐低钾，抗寒和抗旱等抗逆过程中发挥重要作用。

目前有研究报道的是鹰嘴豆的CIPK25基因，其研究结果表明鹰嘴豆在NaCl，PEG，低温，ABA，IAA，MeJA及SA等处理环境下，其CIPK25基因均上调表达以响应胁迫环境；CaCIPK25在盐胁迫条件下，可以促进转基因烟草的种子萌发及根生长，提高转基因烟草的耐盐性。此外，胡杨的PeCIPK25基因与PeCBL1形成复合体调节Na⁺/K⁺平衡。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是提供一种比拉底白刺NbCIPK25基因。本发明的另一目的是提供比拉底白刺NbCIPK25基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐盐育种中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种比拉底白刺NbCIPK25基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的比拉底白刺NbCIPK25基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐盐育种中的应用。

含有比拉底白刺NbCIPK25基因的载体。

含有比拉底白刺NbCIPK25基因的宿主细胞。

有益效果：与现有技术相比，本发明结合比拉底白刺的抗旱耐盐特性，利用比拉底白刺的叶片提取组织RNA，通过同源比对设计引物，克隆了比拉底白刺抗旱耐盐相关的CIPK基因片段，再通过5’RACE和3’RACE技术获得基因全长，并根据拟南芥中的同源基因而命名为NbCIPK25。再通过农杆菌介导法及拟南芥花絮侵染法获得转基因拟南芥植株。在正常培养环境中，比拉底白刺NbCIPK25基因过表达的拟南芥T3代纯合植株的生长发育状态与野生型拟南芥无明显差异。在干旱及盐胁迫处理过程中，纯合转基因拟南芥植株的抗旱耐盐性显著高于野生型拟南芥，由此证明了比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加了资源，对于提高植物的抗逆性研究具有重要意义。

附图说明

图1是比拉底白刺总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图2是NbCIPK25基因完整开放阅读框克隆的PCR结果图；

图3是NbCIPK25基因的表达载体图；

图4是NbCIPK25转基因拟南芥在含0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl培养基上萌发4天和10天的状态图；

图5是NbCIPK25转基因拟南芥在含0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl培养基上萌发4天的萌发率统计图；

图6是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl的1/2MS培养基上处理14天的生长状态图；

图7是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl的1/2MS培养基上处理14天的根长统计图；

图8是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM, 100mM, 150mM, 200mM甘露醇的1/2MS培养基上萌发3天的状态图；

图9是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM, 100mM, 150mM, 200mM甘露醇的1/2MS培养基上萌发3天的萌发率统计图；

图10是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM和150mM甘露醇的1/2MS培养基上处理4天的生长状态和根数、叶数及根长统计结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

以比拉底白刺的叶片为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。确定为目的序列后，依据该序列设计RACE引物，PCR获取5’和3’序列，测序分析后，拼接得到NbCIPK25全长序列。依据全长序列设计引物，PCR获得全长片段，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，再次测序和分析，确定为全长目的片段。在目的片段两端添加酶切位点。表达载体pBI121双酶切后，在T4连接酶的作用下与目的片段相连。重组载体转入农杆菌EHA105和GV3101中，等待拟南芥适龄后，利用花絮浸泡法进行转化，并通过抗生素筛选及PCR检测鉴定获取T1代，T2代及T3代纯合转基因植株，然后对纯合转基因植株和野生型植株进行抗旱耐盐性对比分析。具体如下：

（1）总RNA的提取

以比拉底白刺的叶片为材料，按照NORGEN试剂盒（Norgen Biotek）的操作步骤进行RNA提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。比拉底白刺叶片总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带较清晰；测定总RNA的吸光度，OD₂₆₀/OD₂₈₀值为2.02，OD₂₆₀/OD₂₃₀为1.91，可用作基因克隆。

RNA提取的具体过程为：在0.1%DEPC溶液过夜处理的研钵中加入液氮进行充分磨样，然后取800μL Lysis Solution于样品中进行匀浆后转移至2mL新管。12000rpm离心2min，取上清移至新管中。加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀。将混合液移至柱子中（下接2mL收集管），离心1min，倒掉滤液，放回收集管。加入400μL Wash Solution ，离心1min，弃滤液，放回收集管。加入DNaseI工作液，12000rpm离心1min，将滤液吸回柱子上，25-30℃静置15min。加入400μL Wash Solution，12000rpm离心1min，弃滤液。再次加入400μL Wash Solution，12000rpm离心1min，弃滤液。将柱子放回收集管，12000rpm离心2min，弃收集管。将柱子放入1.5mL管子中加入50μLElution Solution。先200~2000rpm离心2min，再12000rpm离心1min，体积不足50μL，再用14000rpm离心1min。

（2）cDNA的获得

以提取的RNA为模板，反转录获得cDNA，所使用的是Invitrogen公司的SuperScript® III First-Strand Synthesis Kit。RNA使用量为1μg，具体过程为：配置反应液（1μg RNA，1μL Primer（OligodT），1μL 10mM dNTP mix，DEPC-TreatedWater，up to 10μL），短暂低速离心后，65℃ 5min，立即置于冰上1~2min。向上一步的管中加入试剂（2μL 1 0×RT Buffer，4μL 25mM MgCl₂，2μL 0.1M DTT，1μLRNaseOUT（40U/μL），1μLSuperScript III RT），置于PCR仪上，反应程序为50℃ 50min，85℃ 5min。将上一步的反应液离心，每管中加入1μL的RNase H ，37℃ 20min。

（3）目的基因的同源克隆

根据比拉底白刺的部分转录组数据，通过NCBIblast进行比对，利用Oligo7设计特异性引物，克隆获得NbCIPK25基因片段，然后进行连接载体、转化大肠杆菌、目的序列测序和序列分析，确定为目的基因。克隆引物，PCR体系和PCR程序如下所示。

NbCIPK25片段克隆引物为：

CIPK25 forward primer：5'-AACAAGGATAAAGTGAAGAAGGAAGT-3'，

CIPK25 reverse primer：5'-CCTGACAAAACTTAACATACTCCAAG-3'。

PCR反应体系（20μL）为：2μL 10×PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10×dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μL Forward primer（10uM/L）、1μL Reverse primer（10uM/L）、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

PCR反应程序为：95℃变性5min，55℃退火30s，72℃延长1min20s，35个循环。

（4）目的基因5’端和3’端序列克隆

利用Oligo7设计RACE引物，进行CIPK25基因3’末端和5’末端的克隆，切胶回收获得目的片段，然后与载体pMD19-T连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，测序和序列分析，确定获得NbCIPK25基因的两个末端序列后，拼接得到NbCIPK25基因全长序列。RACE引物，PCR反应体系和程序如下所示。

RACE引物为：

CIPK25:3’race primer A：5’-CAATTCCGGCCATCATGCGTCTCCCCT-3'，

CIPK25:3’race primer B：5'-AGGTTACAGGGGAAATTCGAGGGGAGG-3'，

CIPK25:3’race primer C：5'-GAAGTTGCGGTGGTGGAATTCTCGAAGT-3'，

CIPK25:5’race primer A：5’-GTATCGGCTTTGGCTCCGTCGTATCC-3’，

CIPK25:5’race primer B：5’-ACTGTGTGTGGAGGAGCCCGTCGTTG-3’，

CIPK25:5’race primer C：5’- ATCGACGGCGCTGATCAACTGCTGG-3’，

RACE A item 的PCR反应体系（20μL）为：2μL 10´PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10´dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μLCIPK25:3’/ 5’race primer A（10uM/L）、1μL10´Universal Primer A Mix、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

RACE A item 的PCR反应程序：95℃变性5min，69℃/66℃退火（3’end/5’end）30s，72℃延长（3’end/5’end）50s/45s，35循环。

RACE B和C item 的PCR反应体系（20μL）为：2μL 10´PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、2μL dNTP、0.4μL Kode、0.6μL Universal Primer A Mix、0.6μLCIPK25:3’/ 5’race primer B/C、1μLDiluent of race A product、12.2μL ddH₂O。

RACE B和C item 的PCR反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，67℃/66℃/69℃/68℃（3’race B /3’raceC/5’raceB/5’raceC）退火30s，68℃延伸30s/30s/40s/30s（3’race B /3’race C/5’race B/5’race C），35个循环。

（5）基因全长获取

根据CIPK25基因全长序列，利用Oligo7设计全长基因克隆引物，PCR及切胶回收获得NbCIPK25全长基因，与pMD19-T连接后转入大肠杆菌，经过测序分析，再次确定为完整CIPK25基因。比拉底白刺的CIPK25基因全长为1925bp，命名为NbCIPK25，具体序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框（ORF）序列长度为1356bp，所表达的蛋白序列包括452个氨基酸，如SEQ ID NO.2所示。图2为NbCIPK25基因含完整ORF的克隆结果。全长基因克隆的引物，PCR反应体系及程序具体如下：

全长基因克隆引物为：

CIPK25:wl forward primer：5'-ATGGCGGAGGAGGATAAAC-3'，

CIPK25:wl reverse primer：5'-AACTTCCACAGTCATCTCATCTC-3'，

PCR反应体系（20μL）为：2μL 10´PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10´dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μLForward primer（10uM/L）、1μLReverse primer（10uM/L）、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

PCR反应程序：95℃变性5min，57℃退火30s，72℃延长2mins，35个循环。

实施例2基因功能验证

构建35S：CIPK25表达载体，转入野生型哥伦比亚拟南芥中，观察比拉底白刺NbCIPK25基因是否能增强拟南芥的抗旱耐盐性，比较转基因拟南芥和野生型拟南芥的表型差异，分析比拉底白刺CIPK25基因的功能。

1）载体的构建

本发明所用大肠杆菌菌株为E. coli JM109（宝生物工程（大连）有限公司购入）；表达载体为pBI 121（Biovector Co.,LTD公司购入）。限制性内切酶购自New England Biolabs（NEB）。T4连接酶购自Takara。

具体过程如下：

1.通过PCR向CIPK25基因片段上下游分别添加XbaI和SmaI酶切位点，PCR体系及反应条件同全长扩增，引物分别是：

NbCIPK25F+XbaⅠ：5'-GCTCTAGAATGGCGGAGGAGGATAAAC-3'，

NbCIPK25R+SmaⅠ：5'-TCCCCCGGGAACTTCCACAGTCATCTCATCTC-3'，

Forward restricted site of XbaⅠ：5' -T∧CTAGA-3'，

Reverse restricted site ofSmaⅠ：5' -CCC∧GGG-3'，

2.PCR产物测序正确后，在T4连接酶的作用下，可进行载体的构建。使用XbaⅠ和SmaⅠ内切酶进行酶切反应处理pBI 121表达载体。

双酶切反应（20μL）体系及步骤：2μL CutSmart buffer、0.5μLXbaⅠ、1μgpBI121质粒、ddH₂O补足20μL；37℃水浴，反应4h；加入0.5μLSmaⅠ，酶切反应4h；1%琼脂糖凝胶电泳进行分离；用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AXYGEN）进行回收并纯化酶切产物，溶于20μL的TE缓冲液中。相同操作从克隆载体上获取目的基因。

3.检测所回收的酶切产物浓度，按连接体系加入各试剂（目的片段分子数：载体分子数=3:1~5:1），16℃过夜连接。25μL连接反应体系为：2.5μL T4 DNA ligase buffer（10×）、5μL酶切的表达载体、15.5μL酶切的PCR产物、2μL T4 DNA ligase、ddH₂O补足25μL。

4.连接产物转化大肠杆菌JM109超感细胞，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，之后用AxyPrep Plasmid MiniprepKit（AXYGEN）提取质粒进行酶切验证。同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。构建表达载体如图3所示。

2）农杆菌的转化

1.本发明使用的农杆菌菌株为GV3101（ Biovector Co.,LTD公司购入）。采用的是液氮冻融法将构建好的pBI121+NbCIPK25表达载体转入农杆菌。具体过程为：1）冰浴融化GV3101感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴20~30 min；2）液氮速冻l min，37℃热击3 min，迅速置于冰上1~2min；3）加入800 μL无抗生素的LB培养基，28℃，200 rpm复苏3.5h；4） 4000 rpm离心3 min，吸掉700μL培养基；5）混匀剩余菌液，涂抹于添加50 mg.L^-1卡纳霉素的固体LB培基上；6） 28℃倒置培养30~48h；7）PCR检测阳性克隆，4℃保存阳性克隆备用。

2.待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将PCR检测的阳性克隆，摇菌至OD₆₀₀为0.8时，进行拟南芥花器官浸泡转化。具体过程如下：1）将菌液5000 rpm，5 min离心，收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；2）在浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05%（500 μL/L），晃出泡沫；3）将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡30 sec，期间轻轻晃动，4）将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；5）揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

3.收获种子进行干燥，灭菌后用卡那霉素筛选T1代种子，筛选培养基：1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢200mg/L。

4.筛选获得的阳性植株移至土里继续培养，收取T1代拟南芥种子后，继续进行筛选获得T2代植株。然后，收取T2代拟南芥植株的种子后，继续进行筛选，鉴定纯合T3代株系。

3）转NbCIPK25基因拟南芥耐盐性试验

取4个纯合转基因拟南芥株系和野生型拟南芥各50粒种子分别放在含有0mM，100mM和150mM NaCl的1/2MS培养基上萌发，种子春化2-3天后放于光下萌发，4天后统计萌发率。4个纯合转基因株系和野生型拟南芥株系分别命名为OX-1，OX-2，OX-3，OX-4和WT。六次重复试验同时进行。萌发4天和10天的表型如图4所示，萌发4天的萌发率统计结果如图5所示。

统计结果显示，萌发四天后，在0mM NaCl环境中，转NbCIPK25基因的4个过表达株系的种子萌发率与WT的种子萌发率差异较明显，转基因株系分别比WT的萌发率高3.53%，4.80%，4.90%和5.39%。在100mMNaCl环境中，转基因株系分别比WT的萌发率高53.00%，50.06%，53.10%和54.62%，呈极显著性差异（P<0.01）。在150mM盐处理条件下，转基因株系分别比WT高38.92%，53.96%，55.50%和51.40%，其中OX-2和OX-3与WT之间差异极显著（P<0.01）。从盐萌发结果可知，NbCIPK25可以提高拟南芥种子在盐胁迫环境中的萌发率。

转基因植株和WT种子在1/2MS培养上萌发生长1周后，每个株系取30株转移至分别添加0mM，100mM和150mM NaCl的1/2MS培养基上，观察转基因植株和野生型植株的生长表型。三次重复试验同时进行。生长表型如图6所示。观察转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长状态，可知NbCIPK25在正常条件下会促进植株的根生长。在100mM和150mMNaCl环境下，NbCIPK25可以植物促进拟南芥叶片及根部的生长，表现出比WT更好的生长状态。图7为转基因拟南芥及野生型拟南芥的根长统计结果。

4）NbCIPK25转基因拟南芥的抗旱性试验

将三个纯合转基因拟南芥株系种子和WT拟南芥种子种在分别添加了0mM,，100mM，150mM和 200mM甘露醇的1/2MS培养基上，萌发3天后，统计萌发率。统计结果如图8、9所示，萌发第3天时，在含0mM甘露醇的培养基，三个转基因株系比WT的萌发率分别高49%，43%和45%，且差异极显著。甘露醇浓度在100mM和150mM时，转基因株系比WT株系的萌发率高，但OX-2与WT的差异不明显。当甘露醇浓度为200mM时，转基因拟南芥的萌发率比野生型分别高78%，73%和72%，均呈差异极显著性（P<0.01）。

将OX-1转基因拟南芥和WT种子在1/2MS培养基上萌发一周后，每个株系各取60株转移到分别添加0mM和150mM甘露醇的1/2MS培养基上，生长4天后，观察拟南芥生长状态，统计根数量，叶片数量及根长数据。

结果如图10所示，在0mM甘露醇环境下处理4天后，转基因拟南芥OX-1的根长比WT的长19%，差异极显著（P<0.01），叶片数量及根数和WT无明显差异；在150mM甘露醇环境下处理4天后，转基因拟南芥OX-1的根长比WT的长29%，差异极显著（P<0.01），转基因拟南芥OX-1的根数和叶片数量分别比WT多42%和20%，差异极显著（P<0.01）。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种比拉底白刺NbCIPK25基因及其表达蛋白和应用

<130> 100

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1925

<212> DNA

<213> Nitrariatangutorum

<400> 1

cccttaaaaa ccaaaaccaa aaccaaaacc aaaccaagca caataccagg ttctacaatg 60

gccttaaatc aaagagtccc cttcgttatg cctttccatc ctcagatcaa aacctcactt 120

gggaaacttt ccttcaatat tcccagaaat aatatcaacc actctcagtc aacaatccat 180

ggagtccaat agagtcttac gaagttcccc cctttcttca accaaaatct taaaaccctt 240

ttgtaatttt ttacagtagc ccttaagaag aagaaaggat cgaattttga ttcgaaagtt 300

tggagattta gggcttgttc tcaatggcgg aggaggataa acatatgttg ttcgggaagt 360

atgagatggg gagattgctt gggaagggca ctttcgccaa agtctatcac gggaagaaca 420

tcgtttctgg ggaaagtgtc gccattaaag tgatcaacaa ggataaagtg aagaaggaag 480

tgatgatgga gcaaatcaag agagaaatct ccgttatgcg gctcgctcgt catccgaacg 540

tcgtcgagtt gaaagaggtc atggcgacga agaccaagat attttttatg atggagtacg 600

tcaagggcgg cgaactcttc gccaaagtcg ccaagggcaa aatgagcgaa gatcttgccc 660

gtaaatattt ccagcagttg atcagcgccg tcgatttctg tcacagccgc ggcgtctccc 720

accgagatct gaaaccggag aatctgctct tggacgaaaa cgaggatctc aaaatctccg 780

atttcggtct ctcggctctg ccggaacatt tacgcaacga cgggctcctc cacacacagt 840

gcgggacgcc tgcttacgtg gcgccggagg ttttaaggaa aaaaggatac gacggagcca 900

aagccgatac atggtcctgt ggagtgattt tatatgtgct cctcgccgga ttcttaccgt 960

ttcaggatga gaatctgatg aagatgtacc ggaaaatttt caaagcagaa tttgaatttc 1020

cgccgtggtt ttcgacggat gcgaagcgtt tgatctccag acttctaatc cctgatccag 1080

aacggagaat tacaattccg gccatcatgc gtctcccctg gttccggaag gatttaacgc 1140

agacgacgtc gtttgcgatg gaagaacctg ctgaaattga aaaaacagag gaagatataa 1200

acgactcagc ccgtaagagt accaaaacga cgtcgccgaa gttctttaac gcgttcgaat 1260

ttatctcatc gatgtcgtcg ggatttgatt tctctagcct gttcgagaac acgagaaaat 1320

caggatcgat gttcacgtcg aagtgctcgg cgagtggtat tatggagaaa atcgaaggag 1380

tcggaaacgc gatgaatttc aaagtgtcga aactgaagga tttcaaagtg aggttacagg 1440

ggaaattcga ggggaggaaa gggcggctgg ccgtgaccgc ggaagtatac gaggtggcgg 1500

cggaagttgc ggtggtggaa ttctcgaagt cggctggaga taccttggag tatgttaagt 1560

tttgtcagga agatgttagg ccggcgttga aagacattgt ttggacatgg caaggtgaca 1620

atgttgtcgg taactgtaac ggtaataaaa ctgagggaga tgagatgact gtggaagttt 1680

gagtggtaat ttcgcagtgg tgaaaacatg acatgaacct ctttaggatt tttgtcttaa 1740

gaaaaagtat tttgtgattc gtgcttttag ttttggtttt tggggaaact tggtttaatg 1800

agccctttgt aaatagtttg tgtttactgc atcagttgga acttggaagc aatgtggttg 1860

tagaaaacgt gaacttccaa tttaaactaa tattttgaaa gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaa 1925

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> Nitrariatangutorum

<400> 2

Met Ala Glu Glu Asp Lys His Met Leu Phe Gly Lys Tyr Glu Met Gly

1 5 10 15

Arg Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Ala Lys Val Tyr His Gly Lys Asn

20 25 30

Ile Val Ser Gly Glu Ser Val Ala Ile Lys Val Ile Asn Lys Asp Lys

35 40 45

Val Lys Lys Glu Val Met Met Glu Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Val

50 55 60

Met Arg Leu Ala Arg His Pro Asn Val Val Glu Leu Lys Glu Val Met

65 70 75 80

Ala Thr Lys Thr Lys Ile Phe Phe Met Met Glu Tyr Val Lys Gly Gly

85 90 95

Glu Leu Phe Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Met Ser Glu Asp Leu Ala

100 105 110

Arg Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Ser Ala Val Asp Phe Cys His Ser

115 120 125

Arg Gly Val Ser His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp

130 135 140

Glu Asn Glu Asp Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu Pro

145 150 155 160

Glu His Leu Arg Asn Asp Gly Leu Leu His Thr Gln Cys Gly Thr Pro

165 170 175

Ala Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Arg Lys Lys Gly Tyr Asp Gly Ala

180 185 190

Lys Ala Asp Thr Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Val Leu Leu Ala

195 200 205

Gly Phe Leu Pro Phe Gln Asp Glu Asn Leu Met Lys Met Tyr Arg Lys

210 215 220

Ile Phe Lys Ala Glu Phe Glu Phe Pro Pro Trp Phe Ser Thr Asp Ala

225 230 235 240

Lys Arg Leu Ile Ser Arg Leu Leu Ile Pro Asp Pro Glu Arg Arg Ile

245 250 255

Thr Ile Pro Ala Ile Met Arg Leu Pro Trp Phe Arg Lys Asp Leu Thr

260 265 270

Gln Thr Thr Ser Phe Ala Met Glu Glu Pro Ala Glu Ile Glu Lys Thr

275 280 285

Glu Glu Asp Ile Asn Asp Ser Ala Arg Lys Ser Thr Lys Thr Thr Ser

290 295 300

Pro Lys Phe Phe Asn Ala Phe Glu Phe Ile Ser Ser Met Ser Ser Gly

305 310 315 320

Phe Asp Phe Ser Ser Leu Phe Glu Asn Thr Arg Lys Ser Gly Ser Met

325 330 335

Phe Thr Ser Lys Cys Ser Ala Ser Gly Ile Met Glu Lys Ile Glu Gly

340 345 350

Val Gly Asn Ala Met Asn Phe Lys Val Ser Lys Leu Lys Asp Phe Lys

355 360 365

Val Arg Leu Gln Gly Lys Phe Glu Gly Arg Lys Gly Arg Leu Ala Val

370 375 380

Thr Ala Glu Val Tyr Glu Val Ala Ala Glu Val Ala Val Val Glu Phe

385 390 395 400

Ser Lys Ser Ala Gly Asp Thr Leu Glu Tyr Val Lys Phe Cys Gln Glu

405 410 415

Asp Val Arg Pro Ala Leu Lys Asp Ile Val Trp Thr Trp Gln Gly Asp

420 425 430

Asn Val Val Gly Asn Cys Asn Gly Asn Lys Thr Glu Gly Asp Glu Met

435 440 445

Thr Val Glu Val

450

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25 forward primer序列

<400> 3

aacaaggata aagtgaagaa ggaagt 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25 reverse primer序列

<400> 4

cctgacaaaa cttaacatac tccaag 26

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:3'race primer A序列

<400> 5

caattccggc catcatgcgt ctcccct 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:3'race primer B序列

<400> 6

aggttacagg ggaaattcga ggggagg 27

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:3'race primer C序列

<400> 7

gaagttgcgg tggtggaatt ctcgaagt 28

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:5'race primer A序列

<400> 8

gtatcggctt tggctccgtc gtatcc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:5'race primer B序列

<400> 9

actgtgtgtg gaggagcccg tcgttg 26

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:5'race primer C序列

<400> 10

atcgacggcg ctgatcaact gctgg 25

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:wl forward primer序列

<400> 11

atggcggagg aggataaac 19

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:wl reverse primer序列

<400> 12

aacttccaca gtcatctcat ctc 23

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NbCIPK25F+XbaⅠ序列

<400> 13

gctctagaat ggcggaggag gataaac 27

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NbCIPK25R+SmaⅠ序列

<400> 14

tcccccggga acttccacag tcatctcatc tc 32

<210> 15

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Forward restricted site of XbaⅠ序列

<400> 15

tctaga 6

<210> 16

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Reverse restricted site ofSmaⅠ序列

<400> 16

cccggg 6