一种中性高温木聚糖酶及其编码基因和其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种中性高温木聚糖酶及其编码基因和其应用。
背景技术：
：木聚糖(xylan)是自然界中的含量仅次于纤维素的第二丰富植物生物质的主要成分(lyndetal.microbiologyandmolecularbiologyreview,2002,66:506–577)，在生物能源方面有潜在的利用价值。现有生物技术可以高效降解植物中的纤维素成分并转化成可发酵的葡萄糖，后者在酵母作用下生成生物乙醇。高组分的木聚糖不但限制了纤维素酶与纤维素的结合反应，抑制催化反应，而且作为副产品排入自然界可引起营养富集化从而破坏生态系统(polizelietal.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2005,67:577-591)。因此在生物质生物转化过程中，通常要添加木聚糖酶，一方面去除木聚糖的物理屏障，促进纤维素酶与纤维素的结合(huetal.biotechnologyforbiofuels,2011,4:14；qingandwymanbiotechnologyforbiofuels,2011,4:18)，另一方面生成的木寡糖也可以进一步降解成可发酵的木糖，为生物乙醇的生产提供10-25％的原料物质(jinetal.appliedandenvironmentalmicrobiology,2004,70:6816-6825)。基于氨基酸序列和催化域的结构，大部分木聚糖酶(ec3.2.1.8)划分在糖苷水解酶第10和11家族。与专一降解木聚糖的第11家族木聚糖酶相比，第10家族的木聚糖酶具有宽泛的底物特异性，除了作用于木聚糖外，还可催化纤维素、葡聚糖等多种底物的降解，因此在工业领域中具有更广泛的应用前景。现有的生物乙醇加工工艺包括木质纤维素的酸碱预处理、长时间高温酶反应，从而消耗大量的能量和酸碱化学试剂，造成成本的大幅度提升和严重的环境污染。因此开发中性高温的木质纤维素降解酶系在节约能源、保护环境、易于催化反应等方面具有重要的意义(jietal.biotechnologyforbiofuels,2014,7:130)。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种蛋白，名称为ctxyn10a，来源于天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14。本发明所述蛋白为如下1)、2)、或3)所述的蛋白：1)具有序列表中的seqid№.3所示的氨基酸序列的蛋白质；2)具有序列表中的seqid№.5所示的氨基酸序列的蛋白质；3)将序列表中的seqid№.3和/或seqid№.5所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由1)和/或2)衍生的蛋白质。序列表中seqid№.3所示的氨基酸序列由352个氨基酸残基组成；其中，n端18个氨基酸为预测的信号肽序列，具有序列表中seqid№：4所示的氨基酸序列。序列表中seqid№.5所示的氨基酸序列由334个氨基酸残基组成；即ctxyn10a成熟蛋白。上述1)、2)和3)中的ctxyn10a蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述1)、2)和3)中的ctxyn10a蛋白的编码基因可通过将序列表中序列表中seqid№：1、seqid№：2、和/或seqid№：2的第55位-1059位所示核苷酸序列所示的dna序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。编码所述ctxyn10a蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。本发明的还一个目的是提供一种编码基因，其特征在于，所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：1)编码本发明所述蛋白的多核苷酸序列；2)序列表中seqid№：1、seqid№：2、和/或seqid№：2的第55位-1059位所示核苷酸序列；3)编码序列表中seqid№：3和/或seqid№.5蛋白质序列的多核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与1)、2)、和/或3)任一限定的dna序列杂交的核苷酸序列；5)与1)、2)、3)、和/或4)任一限定的dna序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。上述高严谨条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。其中，序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列，共1202bp，含有2个长度分别为59bp和84bp的内含子序列，所述2个内含子序列分别具有序列表中seqid№：1所示的第141位-199位核苷酸序列和第512位-595位核苷酸序列；去掉所述2个内含子序列后的cdna长1059bp，具有序列表中seqid№：2的核苷酸序列，编码序列表中seqid№：3所示的氨基酸序列和一个终止密码子，即本发明所述ctxyn10a蛋白；具有序列表中seqid№：2的第55位-1059位核苷酸序列的核酸片段编码序列表中seqid№：5所示的氨基酸序列，即本发明所述ctxyn10a成熟蛋白。本发明的还一个目的是提供一种载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、和/或微生物，所述载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、和/或微生物含有所述的编码基因。具体的，所述载体包括重组克隆载体、重组表达载体；再具体的包括ppic-ctxyn10a；所述重组菌的出发菌包括大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉、和/或木霉；再具体的，所述重组菌的出发菌包括毕赤酵母、啤酒酵母、和/或多型逊酵母；再具体的，所述重组菌的出发菌为毕赤酵母gs115；再具体的，所述重组菌具体为gs115/ctxyn10a；所述微生物包括天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14；所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、gfp基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因生物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化株。本发明的还一个目的是提供一种引物对，所述引物对可扩增所述编码基因全长或其任意片段。本发明的还一个目的是提供一种蛋白的制备方法，所述方法包括：1)制备本发明所述的编码基因；2)制备包含步骤1)所述编码基因的重组表达载体；3)使步骤2)所述表达载体表达以获得目的蛋白。具体的，所述方法还包括目的蛋白的去糖基化；所述使步骤2)所述表达载体表达的具体步骤包括将所述表达载体导入微生物中，使其表达；再具体的，所述微生物包括大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉、和/或木霉；再具体的，所述微生物包括毕赤酵母、啤酒酵母、和/或多型逊酵母；再具体的，所述微生物为毕赤酵母gs115；具体的，所述重组表达载体包括ppic-ctxyn10a。所述蛋白制备方法制备得到的蛋白也属于本发明保护的范围；具体的，所述蛋白包括本发明所述ctxyn10a蛋白和修饰结构；具体的，所述修饰结构包括糖基化结构。本发明的再一个目的是提供本发明所述的蛋白、编码基因、重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、和/或微生物、引物对、蛋白制备方法、所述制备方法制备得到的蛋白的应用。具体的，所述应用包括在如下1)-8)至少一种中的应用：1)在制备木聚糖酶和/或含有木聚糖酶相关产品中的应用；2)在制备木聚糖酶突变体和/或含有木聚糖酶突变体相关产品中的应用；3)在制备重组木聚糖酶和/或含有重组木聚糖酶相关产品中的应用；4)在制备木寡糖、木二糖、木一糖、含有木寡糖、含有木二糖、和/或含有木一糖相关产品中的应用；5)作为纤维素酶、葡聚糖酶和/或制备具有纤维素酶、葡聚糖酶酶活性相关产品中的应用；6)在降解木聚糖、纤维素、和/或葡聚糖中的应用；7)在制备应用于工业、农业、食品、医药、饲料、能源、废物处理和/或环境保护领域中的产品中的应用；8)在工业、农业、食品、医药、饲料、能源、废物处理和/或环境保护领域中的应用。具体的，所述木聚糖包括榉木木聚糖、可溶小麦阿拉伯木聚、桦木木聚糖、不可溶小麦阿拉伯木聚糖；所述纤维素包括羧甲基纤维素、地衣多糖；所述葡聚糖包括大麦葡聚糖。具体的，所述木聚糖酶包括本发明所述蛋白和/或本发明所述蛋白制备方法制备得到的蛋白；所述木聚糖酶突变体包括将本发明所述蛋白和/或本发明所述蛋白制备方法制备得到的蛋白经点突变后所获得的蛋白；所述重组木聚糖酶包括将本发明所述蛋白和/或本发明所述蛋白制备方法制备得到的蛋白经同源重组后获得的蛋白。具体的，所述应用包括在如下1)、2)、3)、和/或4)所述条件下的应用：1)ph包括4.0-12.0；2)温度包括0℃-90℃；3)包括金属离子、和/或化学试剂的环境；4)底物包括木聚糖、纤维素、和/或葡聚糖。优选的，所述ph包括5.0-8.0；再优选的，所述ph包括6.0-7.0；最优选的，所述ph为6.5；优选的，所述温度包括50℃-80℃；优选的，所述温度包括50℃-75℃；优选的，所述温度包括60℃-75℃；最优选的，所述温度为70℃；所述金属离子、和/或化学试剂包括ni2+，co2+，na+，cr3+，mg2+，mn2+，k+，cu2+，ca2+，pb2+，zn2+，fe3+，β-巯基乙醇，edta，sds；所述金属离子、和/或化学试剂的浓度包括5mmol/l；所述木聚糖包括榉木木聚糖、可溶小麦阿拉伯木聚、桦木木聚糖、不可溶小麦阿拉伯木聚糖；所述纤维素包括羧甲基纤维素、地衣多糖；所述葡聚糖包括大麦葡聚糖。本发明的再一个目的是提供一种木聚糖酶的制备方法，所述方法包括：从cladosporiumtianshanensesl-14中提取木聚糖酶。本发明提供的木聚糖酶ctxyn10a在中性(ph5.0-8.0)和高温(50℃-75℃)范围内均具有高活性的特性。本发明筛选到天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14(中国农业菌种保藏中心accc32710)所产生的木聚糖酶ctxyn10a，其最适ph值为6.0-7.0，在ph5.0-8.0的范围内维持80％以上的酶活性；最适温度为70℃，在60-75℃间均具有70％以上的酶活力；在0℃条件下还有10％酶活；且对多种木聚糖、葡聚糖、纤维素具有降解作用。这种性质的中性高温木聚糖酶还未曾有过报道。本发明克服现有技术的不足，获得了高温木聚糖酶的菌物资源，提供了一种性质优良的、适合于在食品、造纸、能源工业中应用新的中性高温木聚糖酶ctxyn10a。本发明的木聚糖酶ctxyn10a最适ph为6.0-7.0，在ph5.0～8.0都有较高的酶活性；ph稳定性好；比活力为461u/mg；具有宽泛的底物特异性。其中性高温的特点，可降低木聚糖酶在工业生产上的能源成本。ph适应范围广，可提高水产饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染。其宽泛的底物特异性可以提高谷物加工副产品的营养价值，提升饲料产品品质。木聚糖酶ctxyn10a可应用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。还可以在常温条件下，将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为木寡糖，而木寡糖可以被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此，木聚糖酶ctxyn10a在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。木聚糖酶ctxyn10a水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在食品行业，作为增稠剂、脂肪代替物、益生寡糖和抗冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。木聚糖酶及其水解产物还可以进一步转化为液体燃料、溶剂和低热量甜味剂。附图说明图1为重组菌gs115/ctxyn10a中表达的重组木聚糖酶ctxyn10a的sds-page分析，其中，泳道1为去糖基化的纯化重组木聚糖酶；泳道2为纯化重组木聚糖酶；泳道3为低分子量蛋白质marker。图2为重组木聚糖酶ctxyn10a的最适ph测定结果图。图3为重组木聚糖酶ctxyn10a的ph稳定性测定结果图。图4为重组木聚糖酶ctxyn10a的最适温度测定结果图。图5为重组木聚糖酶ctxyn10a的热稳定性测定结果图。具体实施方式说明：下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。试验材料和试剂：1、菌株及载体：下述实施例中所用天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14，保存于中国农业科学院农业菌种保藏中心(北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业菌种保藏中心，100081)，其保藏号为：accc32710，公众可从该中心购买得到该菌株。毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrogen公司。榉木木聚糖购自sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：(1)cladosporiumtianshanensesl-14培养基为马铃薯汁培养基：1000ml马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，ph5.0。(2)大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl,ph7.0)。(3)bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，1％甘油(v/v)。(4)bmmy培养基：除以0.5％甲醇(v/v)代替甘油,其余成份均与bmgy相同，ph4.0。实施例1、中性高温木聚糖酶ctxyn10a的基因组dna的克隆提取天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14基因组dna：将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2ml提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50ml离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量te溶解，置于-20℃备用。根据cladosporiumtianshanensesl-14基因组框架图的序列分析，设计合成特异引物ctxyn10a-f/ctxyn10a-r：ctxyn10a-f：5'-atgcgtttcactgaggtcttcactgctc-3'；ctxyn10a-r：5'-tcacttcttgccacccttgatgccc-3'；以天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14总dna为模板，以上述ctxyn10a-f/ctxyn10a-r为特异引物，进行pcr扩增。pcr反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec，30个循环后72℃保温10min。上述pcr反应得到一约1200bp的核酸片段，将该片段回收后与peasy-t3载体相连送三博生物技术有限公司测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的核酸片段的序列具有序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列，共1202bp。将该具有序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列的核酸片段命名为ctxyn10a。实施例2、编码成熟中性高温木聚糖酶ctxyn10a基因的获得提取天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14的总rna，利用反转录酶得到cdna的一条链，然后以引物ctxyn10a-f/ctxyn10a-r扩增该单链cdna,扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。ctxyn10a-f：5'-ggggaattccacccttcggctcccaaggac-3'；ctxyn10a-r：5'-ggggcggccgctcacttcttgccacccttgatgcc-3'；通过比较实施例1所测的核酸片段的基因组序列和上述pcr扩增产物测序结果后，发现该基因有2个内含子，cdna长1059bp，具有序列表中seqid№：2的核苷酸序列，编码序列表中seqid№：3所示的氨基酸序列和一个终止密码子。具有序列表中seqid№：3所示的氨基酸序列的蛋白，共352个氨基酸残基，n端18个氨基酸为预测的信号肽序列，具有序列表中seqid№：4所示的氨基酸序列。序列表中seqid№：1的第141位-199位核苷酸序列和第512位-595位核苷酸序列分别为59bp和84bp的内含子序列上述pcr扩增产物测序结果表明，上述pcr扩增得到核酸片段包括ecori+noti双酶切位点，上述两个酶切位点中间为具有序列表中seqid№：2的第55位-1059位核苷酸序列的核酸片段。具有序列表中seqid№：2的第55位-1059位核苷酸序列的核酸片段为ctxyn10a基因编码成熟蛋白部分的核酸片段，编码序列表中seqid№：5所示的氨基酸序列；将ctxyn10a基因编码成熟蛋白部分的核酸片段与genbank上的木聚糖酶基因序列进行同源比较，最高一致性为74％，氨基酸序列最高一致性为72％，证明从天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14中分离克隆得到的编码木聚糖酶的基因为新基因。实施例3、中性高温木聚糖酶ctxyn10a的制备将毕赤酵母表达载体ppic9进行双酶切(ecori+noti)，同时将上述实施例2制备得到的编码成熟蛋白的核酸片段双酶切(ecori+noti)，切出编码成熟蛋白的基因片段与双酶切后的表达载体ppic9连接。测序验证序列的正确性。所得重组质粒中插入的外源基因的序列为seqid№：2第55-1059位核苷酸，将该重组质粒命名为ppic-ctxyn10a。将上述重组质粒ppic-ctxyn10a转化毕赤酵母gs115；将阳性重组菌提取质粒测序验证序列的正确性，将测序正确的含有重组质粒ppic-ctxyn10a的重组毕赤酵母菌株命名为gs115/ctxyn10a。取重组菌gs115/ctxyn10a菌株，接种于300mlbmgy培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mlbmmy培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清，纯化蛋白，测定木聚糖酶ctxyn10a的活力。sds-page结果如图1所示，图1结果表明，木聚糖酶ctxyn10a在毕赤酵母重组菌gs115/ctxyn10a中得到了表达。所表达的木聚糖酶ctxyn10a经过纯化之后，其目标蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上，达到电泳纯。经endo-h脱糖基化后，纯化蛋白的分子量与理论值一致，为37.4kda。实施例4、中性高温木聚糖酶ctxyn10a的酶活测定采用dns法测定上述实施例3制备得到的木聚糖酶ctxyn10a的活力，具体方法如下：在ph6.5，70℃条件下，1ml的反应体系包括100μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应10min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。1个酶活单位(u)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。经测定，实施例3制备得到的中性高温木聚糖酶ctxyn10a的酶活为160u/ml。实施例5、中性高温木聚糖酶ctxyn10a的性质测定1、重组木聚糖酶ctxyn10a的最适ph和ph稳定性的测定方法如下：将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。将底物木聚糖用不同ph的0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解，30℃下进行木聚糖酶活力测定。结果如图2所示，木聚糖酶ctxyn10a的最适ph为6.0-7.0，在ph5.0～8.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的80％以上。木聚糖酶于上述各种不同ph的缓冲液中37℃处理60min，再在ph6.5缓冲液体系中70℃下测定酶活性，以研究酶的ph耐性。结果如图3所示，木聚糖酶ctxyn10a在ph4.0-12.0之间均很稳定，在此ph范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上，这说明此酶具有较好的ph稳定性。2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在ph6.5、70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果如图4所示，木聚糖酶ctxyn10a的最适温度为70℃，比活为461u/mg；50℃-75℃的高温范围内具有较高活性；在60℃-75℃间均具有70％以上的酶活力；在0℃条件下还有10％酶活；酶的热稳定性试验结果如图5(图5中80℃所示结果为有底物反应时间10分钟；图4中80℃、结果及表述在无底物80℃温浴一定时间后测定酶活)所示，木聚糖酶ctxyn10a在60℃时稳定性非常好，70℃下保温60min，完全失去酶活。此外，还测定了木聚糖酶ctxyn10a在90℃和ph9.0时的酶活，结果显示其保持了20％以上的酶活。上述实验结果表明，木聚糖酶ctxyn10a为中性高温酶，具有中性高温的特点。3、木聚糖酶的km值测定方法如下：用不同浓度的榉木木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.5)缓冲液体系中，70℃下测定酶活性，计算出其在70℃下的km、vmax、kcat和kcat/km值。经测定，此木聚糖酶ctxyn10a在70℃下以榉木木聚糖为底物的km值为0.64mg/ml，最大反应速度vmax为450μmol/min·mg，kcat值为281/s和kcat/km值为434ml/mg·s.，该实验结果表明ctxyn10a与底物的亲和力较强，在高温条件下还具有较高的催化效率，其酶学性质大大优于序列相似的真菌木聚糖酶foxyn10a(最适ph7.0,最适温度45℃，km0.8mg/ml,vmax1.22μmol/min·mg；christakopoulosetal.carbohydrateresearch,1997,302:191-195)4、不同金属离子化学试剂对木聚糖酶ctxyn10a的酶活的影响测定如下：在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究各种化学试剂对木聚糖酶ctxyn10a活力的影响，各种物质终浓度为5mmol/l。在70℃、ph6.5条件下测定酶活性。结果如表1所示，大多数离子和化学试剂在浓度为5mmol时对重组木聚糖酶ctxyn10a的活力没有明显影响,sds有部分抑制作用。mn2+在5mmol时能使重组酶活力增加到原来的1.32倍。该实验结果表明ctxyn10a具有较好的化学抗性，适当的添加少量mn2+还可以增加酶活，从而降低应用成本。5、木聚糖酶ctxyn10a的底物特异性在酶促反应体系中加入不同的底物，研究木聚糖酶ctxyn10a的底物特异性。在70℃、ph6.5条件下测定酶活性。结果如表2所示，木聚糖酶ctxyn10a同时具有木聚糖酶、纤维素酶和葡聚糖酶的活性。该实验结果表明，木聚糖酶ctxyn10a具有宽泛的底物特异性，除了作用于木聚糖外，还可催化纤维素、葡聚糖等多种底物的降解，因此在工业领域中具有更广泛的应用前景。表1表2底物相对酶活(％)榉木木聚糖(1％)100.0可溶小麦阿拉伯木聚糖(1％)130.6桦木木聚糖(1％)88.1不可溶小麦阿拉伯木聚糖(1％)49.0cmc(1％)31.7地衣多糖(1％)24.6大麦葡聚糖(0.5％)8.96、木聚糖酶ctxyn10a降解榉木木聚糖产物的分析如下：在500μl1％的木聚糖中加入100μl纯化的酶液，最适温度下保温12h。用无水乙醇将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(hpaec-pad)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：木聚糖酶ctxyn10a降解榉木木聚糖的产物主要是木二糖和木一糖。产物中木二糖含量为68％，木一糖含量为24％。该实验结果表明，木聚糖酶ctxyn10a可用于生产木二糖和木一糖等相关产品。序列表<110>中国农业科学院饲料所<120>一种中性高温木聚糖酶及其编码基因和其应用<160>5<210>1<211>1202<212>dna<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>1atgcgtttcactgaggtcttcactgctcttacgctggccgcttcggcggttgcccaccct60tcggctcccaaggacaagaagggtttggccactgctatgaaggctcgtggaagggagttt120atcggcacagcccttacactgtacgtggttgattgatctctcaaggatttcgactttttt180gctgacttcaagattccagtcgcggcaacgagaccgaagaagccattgctcgcaacaacg240ccgacttcaactctttcacgccagagaatgcaatgaagtgggaggccattgagcctaacc300gcaacaacttcaccttcagcgacgccgaccgctaccgcgactgggccaaggccaataaga360aggaaatccactgccacactcttgtctggcactctcagctccctccttgggtcgctgctg420gcaactacgacaacaagaccctgatagggatcatggaaaaccacatcaagaacgtggctg480gccgctacaaggacgtgtgcacccgctgggagtaagtggacccgacttttttttctcgac540tttcgacgaacttttttccggacttgcaacgaaccatcaactaacaccataacagcgtag600tcaacgaggcgttggaggaggacggtacctaccgctcctcacccttctacgacaccatcg660gcgaagctttcatcccaatcgccttcaaattcgccaagaagtacagccccaagtccgagc720tcttctacaacgactacaacctcgagtacaatggcaacaagaccctcggcgccaagcgca780tcgtcaagctggtccagagctacggcgtgcacatcgacggcgtgggtctgcaagcccact840tggcccaggaagtcaccccgaccgccggcgccctgcccgaccaagccactctcgagaccg900ttctcagaggcttcacttccctggacgtcgatgttgtttacaccgagattgatatccgca960tgaacacccccagcaccccggccaagctcaagacacaggccaaggctttcgagactgttg1020ctcgcagctgtcttgctgtcaagaggtgcattggaatgaccgtttggggtatttcagacg1080ctttctcgtggatccctggtgtattccctggtgagggcgctgcgcttctttgggacgaga1140accttaagaagaagccggcttacgatggcttctacaagggcatcaagggtggcaagaagt1200ga1202<210>2<211>1059<212>dna<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>2atgcgtttcactgaggtcttcactgctcttacgctggccgcttcggcggttgcccaccct60tcggctcccaaggacaagaagggtttggccactgctatgaaggctcgtggaagggagttt120atcggcacagcccttacacttcgcggcaacgagaccgaagaagccattgctcgcaacaac180gccgacttcaactctttcacgccagagaatgcaatgaagtgggaggccattgagcctaac240cgcaacaacttcaccttcagcgacgccgaccgctaccgcgactgggccaaggccaataag300aaggaaatccactgccacactcttgtctggcactctcagctccctccttgggtcgctgct360ggcaactacgacaacaagaccctgatagggatcatggaaaaccacatcaagaacgtggct420ggccgctacaaggacgtgtgcacccgctgggacgtagtcaacgaggcgttggaggaggac480ggtacctaccgctcctcacccttctacgacaccatcggcgaagctttcatcccaatcgcc540ttcaaattcgccaagaagtacagccccaagtccgagctcttctacaacgactacaacctc600gagtacaatggcaacaagaccctcggcgccaagcgcatcgtcaagctggtccagagctac660ggcgtgcacatcgacggcgtgggtctgcaagcccacttggcccaggaagtcaccccgacc720gccggcgccctgcccgaccaagccactctcgagaccgttctcagaggcttcacttccctg780gacgtcgatgttgtttacaccgagattgatatccgcatgaacacccccagcaccccggcc840aagctcaagacacaggccaaggctttcgagactgttgctcgcagctgtcttgctgtcaag900aggtgcattggaatgaccgtttggggtatttcagacgctttctcgtggatccctggtgta960ttccctggtgagggcgctgcgcttctttgggacgagaaccttaagaagaagccggcttac1020gatggcttctacaagggcatcaagggtggcaagaagtga1059<210>3<211>352<212>prt<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>3metargphethrgluvalphethralaleuthrleualaalaserala151015valalahisproseralaprolysasplyslysglyleualathrala202530metlysalaargglyargglupheileglythralaleuthrleuarg354045glyasngluthrgluglualailealaargasnasnalaasppheasn505560serphethrprogluasnalametlystrpglualailegluproasn65707580argasnasnphethrpheseraspalaaspargtyrargasptrpala859095lysalaasnlyslysgluilehiscyshisthrleuvaltrphisser100105110glnleuproprotrpvalalaalaglyasntyraspasnlysthrleu115120125ileglyilemetgluasnhisilelysasnvalalaglyargtyrlys130135140aspvalcysthrargtrpaspvalvalasnglualaleuglugluasp145150155160glythrtyrargserserprophetyraspthrileglyglualaphe165170175ileproilealaphelysphealalyslystyrserprolysserglu180185190leuphetyrasnasptyrasnleuglutyrasnglyasnlysthrleu195200205glyalalysargilevallysleuvalglnsertyrglyvalhisile210215220aspglyvalglyleuglnalahisleualaglngluvalthrprothr225230235240alaglyalaleuproaspglnalathrleugluthrvalleuarggly245250255phethrserleuaspvalaspvalvaltyrthrgluileaspilearg260265270metasnthrproserthrproalalysleulysthrglnalalysala275280285phegluthrvalalaargsercysleualavallysargcysilegly290295300metthrvaltrpglyileseraspalaphesertrpileproglyval305310315320pheproglygluglyalaalaleuleutrpaspgluasnleulyslys325330335lysproalatyraspglyphetyrlysglyilelysglyglylyslys340345350<210>4<211>18<212>prt<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>4metargphethrgluvalphethralaleuthrleualaalaserala151015valala<210>5<211>334<212>prt<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>5hisproseralaprolysasplyslysglyleualathralametlys151015alaargglyargglupheileglythralaleuthrleuargglyasn202530gluthrgluglualailealaargasnasnalaasppheasnserphe354045thrprogluasnalametlystrpglualailegluproasnargasn505560asnphethrpheseraspalaaspargtyrargasptrpalalysala65707580asnlyslysgluilehiscyshisthrleuvaltrphisserglnleu859095proprotrpvalalaalaglyasntyraspasnlysthrleuilegly100105110ilemetgluasnhisilelysasnvalalaglyargtyrlysaspval115120125cysthrargtrpaspvalvalasnglualaleuglugluaspglythr130135140tyrargserserprophetyraspthrileglyglualapheilepro14515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