一种靶向沉默HDAC1基因的LV‑HDAC1shRNA慢病毒合成方法及应用与流程

本发明涉及一种生物技术领域，尤其是涉及一种靶向沉默hdac1基因的lv-hdac1shrna慢病毒合成方法，本发明还涉及将该慢病毒作为高效调控胞内hdac1表达的表观遗传修饰药物的应用。

背景技术：

近年来，干细胞替代疗法为包括创伤性脑损伤（tbi）在内的中枢神经损伤疾病的治疗带来希望。脐带源性间充质干细胞(huc-msc)具有一定的增殖分化能力，是伦理争议小、临床应用价值高的种子细胞。但鉴于干细胞在体内外增殖和分化效率有限，目前亟需更为安全、有效的诱导调控方式提高其成神经分化潜能。

学者struhlk提出：组蛋白乙酰化修饰的表观遗传干预手段，可调控细胞内乙酰化酶（hat）和去乙酰化酶（hdac）的动态平衡来调控干细胞的增殖和定向分化。本申请的发明人团队前期研究表明，与未分化的干细胞相比，已分化的成熟神经元中hdac1的表达量降低。学者吕建祎认为：影响干细胞分化、增殖的阻遏复合物上，hdac1、2都有表达；且学者macdonaldjl指出：敲除hdac2可能会抑制神经祖细胞的增殖。这与本申请发明人团队的前期研究结果一致。这表明，靶向调控hdac1有助于干细胞神经命运决定的启动。

目前，调控细胞组蛋白乙酰化水平的常用手段是使用hdac抑制剂。但是仍存在很多不足：1.广谱性的hdac抑制剂特异性不强，且可能存在剂量依赖性，损害脑认知能力；2.特异性的hdac1抑制剂虽可改善胞内hdac1水平，但细胞传代、增殖后，干预效果呈现递减效应；3.hdac抑制剂价格昂贵，体内实验成本高。因此，有效稳定的靶向干预hdac1对于调控干细胞神经分化潜能十分重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对组蛋白去乙酰化酶1（hdac1）抑制剂存在的不足，提供一种靶向沉默hdac1基因的lv-hdac1shrna慢病毒合成方法；本发明还提供合成的lv-hdac1shrna慢病毒作为高效调控胞内hdac1表达的表观遗传修饰药物的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

1、本发明所述的靶向沉默hdac1基因的lv-hdac1shrna慢病毒合成方法，包括下述步骤：

第一步，genbank上检索人hdac1的mrna序列，合成特异性的shrna片段；

第二步，用lipofectamin2000转染sirna到hek293细胞中，置于co2培养箱培养72h，提取细胞总rna；利用实时荧光pcr技术筛选具有最佳干扰hdac1效率最高的shrna；

第三步，利用mu6-mcs-ubi-egfp工具载体质粒、phelper1.0载体质粒、phelper2.0载体质粒，合成慢病毒lv-hdac1shrna。

2、本发明合成的lv-hdac1shrna慢病毒作为高效调控胞内hdac1表达的表观遗传修饰药物的应用。

2.1本发明采取上述慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-msc筛选可靶向沉默hdac1基因、调控胞内乙酰化水平、增殖良好的hdac1shrna-msc细胞株，评估其周期、凋亡、迁移能力：

（1）将huc-mscs细胞按3~5×10⁴ml^-1密度接种于96孔板中的12个孔内，体积为90μl，细胞培养箱中培养24h；

（2）利用慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-mscs，在倒置荧光显微镜下，通过比较各组细胞感染效果，确认huc-mscs的感染条件和感染参数；

（3） 使用已确定复感染指数的慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-mscs，流式分选获取稳定整合慢病毒lv-hdac1shrna细胞，记作hdac1shrna-msc细胞；

（4）荧光定量pcr、westernblot检测慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞内hdac1基因沉默情况、乙酰化水平；

（5）cck8法测定慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞的增殖曲线；

（6）pi染色检测慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞周期；

（7）sa-β-gal实验检测hdac1shrna-msc细胞衰老情况；

（8）caspase3检测评估hdac1shrna-msc细胞凋亡；

（9）transwell迁移实验检测hdac1shrna-msc细胞细胞迁移。

2.2本发明用神经分化诱导培养基诱导msc和hdac1shrna-msc细胞，qrt-pcr、免疫荧光评估慢病毒lv-hdac1shrna对huc-mscs神经诱导分化的影响：

（1）利用复合诱导培养基对msc和hdac1shrna-msc细胞进行神经分化诱导；

（2）提取诱导分化后的msc、hdac1shrna-msc组细胞rna，用荧光定量pcr检测慢病毒lv-hdac1shrna对huc-mscs细胞神经分化相关基因mrna水平的影响；

（3）免疫荧光检测诱导神经元样细胞神经元迁移蛋白dcx、神经元特异性烯醇化酶nse表达情况：dcx表达阳性者为神经前体细胞,nse表达阳性者为神经元样细胞。

2.3侧脑室移植hdac1shrna-msc细胞，利用qrt-pcr检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况，利用新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况：

（1）侧脑室移植hdac1shrna-msc细胞，qrt-pcr检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况；

（2）利用新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况。

本发明的优点在于：

1、合成的lv-hdac1shrna慢病毒携带gfp荧光标签，便于跟踪、选择和富集转染的细胞；且有较高的转染效率，可长时间维持基因沉默；采用第2代系统的慢病毒载体，所收集的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

2、慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-mscs，hdac1基因表达水平明显下调，h3k9ac表达显著增加。慢病毒改变huc-mscs细胞乙酰化水平的同时，可明显促进其增殖和神经分化潜能的提高，更有利于后续细胞移植治疗；

3、侧脑室移植lv-hdac1shrna感染的huc-mscs，可以通过提高神经分化相关基因与神经营养因子的表达，继而改善tbi小鼠学习记忆能力，促进其神经修复。

附图说明

图1是本发明制备的shrna3转染人脐带间充质干细胞后，应用荧光定量pcr、westernblot检测shrna3干扰hdac1基因表达效率的结果。

图2 是本发明制备的mu6-mcs-ubi-egfp-hdac1shrna3慢病毒载体质粒结构图。

图3是采用本发明制备的慢病毒lv-hdac1shrna感染分选收获的hdac1shrna-msc细胞，倒置荧光显微镜下细胞形态学照片（100x）。

图4是采用本发明制备的慢病毒lv-hdac1shrna感染分选收获的hdac1shrna-msc细胞应用荧光定量pcr、westernblot检测hdac1基因沉默情况、细胞乙酰化水平结果。

图5是采用本发明制备的慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞应用cck8法测定的增殖曲线。

图6是采用本发明制备的慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞应用pi染色法测定的细胞周期结果。

图7是采用本发明制备的慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞应用sa-β-gal法测定的细胞衰老结果。

图8是采用本发明制备的慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞应用caspase3检测的细胞凋亡结果。

图9是采用本发明制备的慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞应用transwell迁移实验检测的细胞迁移结果。

图10是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞4d后，应用荧光定量pcr检测神经分化相关基因mrna水平影响的结果。

图11是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞4d后，dcx、nse阳性细胞免疫荧光染色结果（x200）。

图12是侧脑室移植慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞治疗脑损伤模型小鼠28d后，应用荧光定量pcr技术检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子表达情况的结果。

图13是侧脑室移植慢病毒lv-hdac1shrna感染的hdac1shrna-msc细胞治疗脑损伤模型小鼠28d后，应用新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况的结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更详细的说明。其中采用的实验方法，若无特别说明，均为常规方法；实验所用的器具、仪器、试剂均可通过商业途径获得。

实施例1：合成、筛选具有稳定靶向沉默能力的lv-hdac1shrna慢病毒

（1）genbank上检索人hdac1的mrna序列（nm_004964.2），送吉玛基因合成3条特异性的shrna片段，分别记作shrna1、shrna2、shrna3，序列信息详见表1；

（2）按sirna:lipofectamin2000（1:0.05）转染hek293细胞，置于co2培养箱培养72h，提取细胞总rna；利用实时荧光pcr技术（引物见表2，结果见图1-a）、westernblot检测筛选出了具有最佳干扰hdac1效率最高的shrna片段（图1-b,c,c为b的灰度分析结果），即shrna3。注：*：与shrna1组相比，p<0.05；#，与shrna2组相比，p<0.05。

（3）把shrna3正义链和反义链溶于退火缓冲液中，90℃水浴15min，冷却至室温，合成双链dnaoligo片段。用hpai和xhoi酶双酶切mu6-mcs-ubi-egfp工具载体质粒并回收；缓冲液中用t4dna连接酶将线性化mu6-mcs-ubi-egfp质粒和已退火dnaoligo片段16℃过夜连接，反应体系如下：

（4）取得到连接液转化ecoli感受态细胞，将pcr鉴定后的阳性克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的u6-mcs-ubi-egfp-hdac1shrna3慢病毒载体质粒（图2）。

（5）离心管中混匀dna溶液（mu6-mcs-ubi-egfp-hdac1shrna3载体质粒20μg、phelper1.0载体质粒15μg、phelper2.0载体质粒15μg），用转染试剂定容至1ml，室温孵育15min。

（6）混合液缓慢滴加至293t细胞培养液中，混匀，静置于37℃、5%co2细胞培养箱中培养。

（7）培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃。

（8）缓慢加入含10%血清的细胞培养基20ml，于37℃、5%co2培养箱内继续培养48-72h。

（9）根据细胞状态，收集转染后48h（转染即可计为0h）的293t细胞上清液。

（10）于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片。

（11）以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。

（12）分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃。

（13）离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液（可用pbs或细胞培养基替代），轻轻反复吹打重悬。

（14）经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清按要求分装，即为慢病毒lv-hdac1shrna。

实施例2：慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-msc，筛选hdac1shrna-msc细胞株

采用实施例1配制的慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-msc，筛选可靶向沉默hdac1基因、调控胞内乙酰化水平、增殖良好的hdac1shrna-msc稳定株，具体步骤如下：

（1）将huc-mscs细胞按3~5×10⁴ml^-1密度接种于96孔板中的12个孔内，体积为90μl，细胞培养箱中培养24h；

（2）感染试剂的配制：

配制polybrene(m)：使用completemedium稀释polybrene，至终浓度50μg/ml；

配制polybrene(e)：使用eni.s稀释polybrene，至终浓度50μg/ml；

使用eni.s将病毒稀释为三种滴度：a组1×10⁸tu/ml、b组1×10⁷tu/ml、c组1×10⁶tu/ml。

（3）以横坐标从左向右为：completemedium、polybrene(m)、eni.spolybrene(e)， 纵坐标从上至下为：a组1×10⁸tu/ml、b组1×10⁷tu/ml、c组1×10⁶tu/ml，按表3《感染条件筛选表》分别更换培养液和加入病毒液进行细胞感染；

（4）混匀后继续培养，8-10h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基；

（5）感染3-4天后，观察各组荧光表达情况。其中，每隔1天换液1次，以保持细胞活性；

（6） 在倒置荧光显微镜下，确认huc-mscs复感染指数（multiplicityofinfection，moi）为10，慢病毒lv-hdac1shrna感染p3代huc-mscs2~3天，传代1次后，流式分选获取稳定整合慢病毒lv-hdac1shrna细胞系，倒置荧光显微镜存留荧光照片后（图3），记作hdac1shrna-msc细胞。

（7） 提取msc、hdac1shrna-msc组细胞rna和蛋白，利用荧光定量pcr（引物见表2）检测hdac1基因沉默情况、westernblot检测慢病毒lv-hdac1shrna对huc-mscs细胞乙酰化影响，结果显示：与mscs组相比，hdac1shrna-msc组蛋白去乙酰化酶hdac1在mrna水平的表达明显下调（图4-a，p<0.05）；huc-msc经慢病毒感染后，hdac1蛋白表达下调，h3k9ac表达上调，且差异显著（图4-b，c，p<0.05）。注：*：mscs组相比，p<0.05。

（8）取状态良好的p4代msc、hdac1shrna-msc组细胞用2.5g/l的胰酶消化离心后，将少许细胞悬液滴加细胞计数盖片边缘，进行细胞计数；根据测定的计数结果，用培养基重悬为密度为2×10⁴ml^-1的单细胞悬液。96孔板中，按1500个细胞每孔进行接种，置于37℃、5％co2细胞培养箱中过夜孵育。使用cck8法检测msc、hdac1shrna-msc组细胞增殖情况，结果显示：与对照组相比，感染慢病毒lv-hdac1shrna的细胞有先缓后增的增殖趋势，但无统计学差异（图5）。

（9）将状态良好的p4代msc、hdac1shrna-msc组细胞，培养24h后，用胰蛋白酶消化离心后，弃上清；将细胞沉淀用1ml预冷pbs溶液重悬、清洗后，离心去上清；用70%乙醇固定细胞24h后，离心去上清；在避光条件下，各组细胞分别加入0.5ml的pi染色液，于37℃孵育30min，流式细胞仪检测细胞周期。流式结果显示：较mscs组，hdac1shrna-msc组细胞，g0/g1期下调（由89.245%降至75.861%），s期上调（由8.662%升至20.254%），与细胞增殖联系密切（图6）。

（10）用生长状态良好的p4代msc、hdac1shrna-msc组细胞，以每孔10⁵个细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁，完全伸展开后更换培养基。弃去细胞培养液，每孔加入1ml清理液，清洗生长中的细胞表面；弃去清理液，每孔再加入1ml固定液，覆盖整个生长表面，室温孵育10min；弃去固定液，每孔再加入1ml酸性液，清洗细胞表面；弃去酸性液，再次用酸性液清洗细胞一次；弃去酸性液，每孔加入1ml预热30min后的配置好的的β-gal染色工作液，放入37℃培养箱孵育7h，光学显微镜下观察并计数蓝染细胞（蓝染程度与细胞衰老程度相关性），结果显示，hdac1shrna-msc细胞蓝染率比msc细胞高，细胞衰老亦有增加（图7a，b）。注：*：mscs组相比，p<0.05。

（11）用生长状态良好的p4代msc、hdac1shrna-msc组细胞，取密度为1*10⁵/孔每组设置3个复孔,每孔100μl,用含血清的dmem-f12培养48h。均匀混合caspase3底物和缓冲液，取100μl加入各孔中，孵育1h后酶标仪检测od405nm处的吸光值，结果显示：与msc组相比，hdac1shrna-msc组48h时，caspase3催化产生的pna产生的吸光度有显著增强（图8），细胞凋亡有所增多，但无显著差异。

（12）用生长状态良好的p4代msc、hdac1shrna-msc组细胞，取密度为2*10⁵/孔取细胞悬液200μl接种于transwell小室的上室，将600μl含20%胎牛血清的dmem-f12培养基加入下室，每组设三个复孔；常规培养24h后，用棉签擦去transwell小室上室内面的细胞，4%多聚甲醛固定15min，0.1%结晶紫溶液染色15min，pbs洗3遍，随机取10个视野显微镜下观察、计数拍照。结果显示：较msc组，hdac1shrna-msc组细胞，细胞迁移数目有显著增强（图9）。注：**：mscs组相比，p<0.001。

实施例3：复合诱导培养基神经分化诱导msc和hdac1shrna-msc细胞，评估慢病毒对mscs神经分化的影响

本发明用神经分化诱导培养基诱导msc和hdac1shrna-msc细胞，qrt-pcr、免疫荧光评估慢病毒lv-hdac1shrna对huc-mscs影响，具体步骤如下：

（1）用dmem-lg培养基调整msc和hdac1shrna-msc细胞密度为2×10⁵ml^-1，恒温培养至60%汇聚度，da分化培养液预诱导2天、db分化培养液分化诱导1天、dc分化培养液维持诱导1天，完成神经分化诱导，其中诱导培养基特征为：

da分化培养液是由每1000mldmem-lg培养基中添加40mlfbs和10μgbfgf组成，其中bfgf的终浓度达10ng/ml；

db分化培养液是由每1000ml的dmem-lg培养基中添加50mlcerebrolysin、4mgforskolin、5mginsulin、0.36mghydrocortisone、1.86gkcl、7gnacl、2.2gnahco3、190mgnah2po4、95mgmgcl2、222mgcacl2、1.8gd-glucose组成；其中各组分的终浓度达到5%cerebrolysin、10μmforskolin、5μg/mlinsulin、1μmhydrocortisone、2.5mmkcl、120mmnacl、26mmnahco3、1.25mmnah2po4、1mmmgcl2、2mmcacl2、10mmd-glucose；

dc分化培养液是由每1000ml的dmem-f12培养基中添加10μgbfgf、10μgegf、10ml100xn2、20ml50xb27、0.3gl-glutamine组成；其中各组分的终浓度达到：10ng/mlegf、10ng/mlbfgf、1xn2、1xb27、2mml-glutamine；

（2）提取诱导分化后的mscs、dmscs、hdac1shrna-msc组细胞rna，用荧光定量pcr检测慢病毒lv-hdac1shrna对huc-mscs细胞神经分化相关基因mrna水平的影响，结果显示：与对照组相比，经神经诱导后重组慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-mscs细胞dcx、nse表达增加，且除ngn1外神经分化相关基因mash1、ngn2表达普遍显著上调（图10，p<0.05）。注：*：p<0.05。

（3）免疫荧光检测msc、dmscs、hdac1shrna-msc组细胞神经元迁移蛋白dcx、神经元特异性烯醇化酶nse表达情况：dcx表达阳性者为神经前体细胞,nse表达阳性者为神经元样细胞。步骤如下：

a.用pbs漂洗不同分化方案诱导完毕后48孔板3遍，4%多聚甲醛于4℃过夜固定。

b.用0.2%tritonx-100室温通透10min，pbs润洗3次，每次10分钟。

c.用5%bsa室温封闭30min，分别加入鼠抗dcx单抗（稀释比例1：50）、兔抗nse抗体（稀释比例1：100稀释），置于4℃孵育过夜（pbs替代一抗作阴性对照）。

d.次日，用pbs漂洗3次，每次10min，各组分别按200μl/孔加入fitc标记羊抗鼠或羊抗兔igg二抗，室温避光孵育1h。

.pbs润洗3次，加dapi染色，封片，倒置荧光显微镜上镜观察，计数。

免疫荧光结果显示：重组慢病毒lv-hdac1shrna感染huc-mscs细胞经神经诱导4d后，dcx、nse阳性表达率分别为(45.9±3.614)%、(89.1±1.387)%，向神经元样细胞分化更显著，免疫荧光照片如图11所示，具有统计学意义。

实施例4：侧脑室移植hdac1shrna-msc细胞，qrt-pcr检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况，新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况。

（1）饲养24只c57bl/6j小鼠一周后制作脑损伤小鼠模型，分为四组：

a.sham组：只打开骨窗，不进行脑损伤，不移植细胞，共6只；

b.vehicle组：中度脑损伤模型，不移植细胞，仅侧脑室注射生理盐水，共6只；

c.mscs组：中度脑损伤模型，移植huc-mscs，共6只小鼠；

d.hdac1shrna-msc组：中度脑损伤模型，移植lv-hdac1shrna感染后的hdac1shrna-msc，共6只小鼠。

（2）造模前，更换垫料1次，并禁食禁水24h，所涉及的动物操作程序符合动物保护与伦理要求。所有实验动物均购自市场商业化的实验动物技术有限公司。

a.脑损伤动物模型制作：采用自由落体脑皮质损伤模型，步骤如下：

1）术前10%水合氯醛按0.04ml/10g对小鼠给予麻醉后，头部备皮、消毒。

2）脑立体定位仪上俯卧位固定小鼠，校零各轴读数，确保小鼠头部水平。

3）用手术刀沿脑中线纵切5cm开口，钝性分离皮下组织、暴露颅骨。在前囱后1.5mm、中线旁侧1.5mm处环钻开3mm直径骨窗，保证硬脑膜完好。

4）立体定位仪上，距骨窗20cm高度释放20g撞针（直径2mm）制作2mm深度脑损伤模型。

b.侧脑室移植诱导分化的细胞:

1）牙科钻在前囟后2mm、旁开1.5mm处建立直径1mm小孔；

2）脑立体定位仪上，5min内用微量注射针在左侧脑室（前囟后2mm、旁开1.5mm、深度2mm）移植5×10⁴个细胞，留针5min后，缓慢拨出，消毒缝合

（3）qrt-pcr检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况：

小鼠动物行为学实验结束后，麻醉处死，取出脑组织，将损伤侧组织匀浆后通过rna提取试剂盒获取总rna。以gapdh为内参，使用荧光定量pcr仪检测各组小鼠脑内dcx、map2、bdnf、ngf、nt3基因的表达情况,引物见表4。

结果显示：与vehicle组相比，治疗28d后，mscs、hdac1shrna-msc组小鼠损伤侧dcx、map2表达水平明显升高（p<0.05），且后者神经元相关基因表达显著上调（图12，p<0.05）。与vehicle组相比，治疗28d后，mscs、hdac1shrna-msc组小鼠脑内神经营养因子表达水平明显升高（p<0.05），且后者海马内神经营养因子bdnf、ngf、nt3基因表达明显上调（图12，p<0.05）。注：*：与sham组相比，p<0.05；#：与vehicle组相比，p<0.05；

（3）新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况：脑外伤后28d，本实验采取新事物识别实验检测动物学习记忆能力。

.为了保证实验数据真实有效，实验过程应严格按照以下步骤进行：

1）训练前72h，每天轻柔抚摸实验小鼠1min，消除其与测试者间陌生感。

2）训练前24小时，将动物放一个测试用50cm×50cm×25cm不透明箱子中，适应测试环境10min。

3）训练前准备a，b，c三个物体，其中a，b物体为体积约4×4×4cm3红色立方体，c物体是直径4cm的绿色球形物体。实验开始后，首先将a、b放入箱中在一侧壁的左右两端；将小鼠背朝两物体放入场内后，开启录像设备，离开测试房间，记录实验动物用鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2~3cm范围内探究的时间。10min后，把小鼠放回笼子。1h后，用c替换a，并重新让小鼠在此箱中探索5分钟，重复观察相同指标。待全部实验结束后，将小鼠送回饲养房。

4）通过公式辨别指数=新物体所用时间/(新物体所用时间+旧物体所用时间)×100%，分析小鼠的辨别指数。

b.通过统计其探索新旧事物所用时间后发现：与vehicle组相比，经细胞治疗后mscs、hdac1shrna-msc小鼠新物体鉴别指数显著增加，二者间hdac1shrna-msc组变化较大（图13，p<0.05）。注：*：与sham组相比，p<0.05、**：与sham组相比，p<0.01；#：与vehicle组相比，p<0.05。

采用spss17.0进行数据分析，实验数据用表示，组间数据用检测，多组数据采用方差分析，检验水准α=0.05。