一种采血卡快速提取试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种采血卡快速提取试剂盒。本发明还涉及使用磁珠法提取采血卡的方法。

背景技术：

在现代疾病诊断当中，核酸占据着非常重要的地位，其中dna的作用更显突出，采血卡是用于保存血液dna的一种重要手段。采血卡的稳定性高，与直接抽提样品的pcr结果一致。且采血卡可在干燥条件下对血液样本进行保存并阻止细菌和真菌的生长，方便收集，运输和存档。另外在pcr分子诊断过程中，获得的dna的总拷贝数和质量会直接影响到后续检验实验的结果，所以，便于保存且获得有效、可靠的dna是pcr分子诊断的关键。

虽然普通血液样本提取核酸的方法能够获得质量较好的核酸，但是普通血液样本不容易保存，且传统提取过程中用到的化学物质却有着不可忽视的毒性，而且整个提取过程耗时较长，浪费大量的时间和人力物力。进一步来说，现在普及的柱提法核酸提取试剂也能获得质量很好的核酸，毒性也可以忽略，但是耗费的时间同样不可忽视。而现今的试剂盒中，大部分都采用了蛋白酶k分解蛋白质。蛋白酶k的效率虽然不低，但本身也属于蛋白质，性能容易受外界环境ph值，温度等因素影响，导致提取的效率会不稳定，进而导致同批次之间存在差异性。

技术实现要素：

为了解决上述技术中的缺陷，本发明所提供的技术是试剂盒中以三(2-羧乙基)膦代替传统使用的蛋白酶k，能够解决传统蛋白酶k的缺陷。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种采血卡快速提取试剂盒，其试剂盒的组成为：血片消化液、裂解液、结合液、磁珠、三(2-羧乙基)膦、洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3、洗脱液。

进一步的，所述的血片消化液其目的为将采血卡进行消化，释放出细胞。其中各成分分别为：tris-hcl（ph3.3-4.4）的浓度为1-3mol/l,edta（ph8.0-10.0）的浓度为0.5-0.8mol/l，nacl的浓度为0.1-0.3mol/l，sds的浓度为20-40g/l。

进一步的，所述的裂解液其目的为强力快速裂解样本释放大量的dna。其中各成分分别为：tris-hcl的浓度为12-14mmol/l，ph为2.8-3.2；异硫氰酸胍的浓度为11-15mmol/l；氢氧化钠浓度为2-4.5mmol/l；np-40的浓度为6-10%；sds的浓度为2-5%；谷胱甘肽的浓度为1-4mol/l；十二烷基肌酸钠浓度为1-4mol/l；peg600的浓度为2-10%。

进一步的，所述的结合液作用为能够快速为磁珠结合核酸提供稳定的环境，增强核酸与磁珠结合的效率。其中各成分分别为：tris-hcl的浓度为6-10mmol/l，ph为3-5.4；异丙醇的浓度为75-85%。

进一步的，所述的洗涤液1其作用为洗去附着的其他蛋白质。其中各成分分别为：tris-hcl的浓度为60-70mmol/l，ph为4-5.5；无水乙醇的浓度为45-60%。

进一步的，所述的洗涤液2其作用为洗去附着的其他盐成分，其中各成分分别为：cacl2的浓度为6-10mmol/l；无水乙醇的浓度为70-80%。

进一步的，所述的洗涤液3其作用为梯度洗去其中的盐成分，其中各成分分别为：65-80%的乙醇。

进一步的，所述的洗脱液作用为将核酸从磁珠上洗脱至洗脱液中，其中各成分分别为：tris-hcl的浓度为30-45mmol/l，ph为8-9；edta-2na的浓度为3-5mmol/l。

进一步的，所述的试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是磁珠；第3列和第9列预分装的是洗涤液2；第4列和第10列预分装的是洗涤液3；第5列和第11列预分装的是洗涤液1；第6列和第12列预分装的是洗脱液。

进一步的，所述的配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32，一次性可提取32人份，耗时30分钟，提取程序为下表：

。

本发明方案中，需将采血卡进行预处理，待取得其中细胞后，取其上清液置于预分装板中可直接进行抽提纯化。本发明试剂盒可用于多个物种的采血卡dna提取，如人类，啮齿类，鸟类等多种生物，本发明可用于手工提取，也可配合全自动核酸提取仪使用。使用本发明试剂盒，提取的dna，可应用于pcr扩增，基因突变筛查，基因文库建立，基因分型，基因测序等科研或法医鉴定或临床疾病分析。

本发明试剂盒中加入peg6000作为分散剂，使裂解液中各成分更加均匀。本发明试剂盒中用三(2-羧乙基)膦代替传统使用的蛋白酶k，可以更高效地提取采血卡中的dna，且三(2-羧乙基)膦是一种非常有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂如dtt相比，三(2-羧乙基)膦不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉。因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究常常优先选择三(2-羧乙基)膦。

本发明的主要优势在于：

（1）提高提取效率

与传统柱提法试剂和使用蛋白酶k的试剂盒相比，（如biobase公司的upureswabdnakit）本试剂盒中含有的裂解液中的peg6000和三(2-羧乙基)膦，与传统的蛋白酶k相比，三(2-羧乙基)膦的提取效率更高，适用范围更加广泛，并且由于三(2-羧乙基)膦不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉，对于后续的实验影响相对较少，能够强力快速裂解样本释放大量的dna，可以更高效地提取采血卡中的dna。结合液能够快速为磁珠结合核酸提供稳定的环境，大大地增强了提取效率。

（2）缩短提取时间

本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，人工操作时间只有几分钟，32个样本的提取全程能在30min以内完成，相对于柱提法等传统试剂，大大缩减了提取所需时间。

（3）自动化程度高，减少人为失误和实验误差

本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，配合达安smart32全自动提取仪，可以一次提取32人份，减少大量人工操作所带来的误差，操作简单,除加样和加结合液外其他实验操作均由仪器完成，大大解放了人力，减少了人工操作时间,并降低了操作中带入的人为失误和误差。

（4）裂解效率高

本发明试剂盒中用三(2-羧乙基)膦代替传统使用的蛋白酶k，可以更高效地提取采血卡中的dna。试剂盒中加入peg6000作为分散剂，使裂解液中各成分更加均匀，裂解效率更高。

附图说明

图1为本发明方法提取核酸时使用的96孔深孔板的俯视图；

图2为按照本发明方法向96孔深孔板各排中注入试剂的示意图。

具体实施方式：

实施例1：一种采血卡快速提取试剂盒的配制方法：

a.血片消化液的配置：先在容量瓶中加入浓度为1mol/l的tris-hcl（ph4.4）；待tris-hcl混匀后，加入浓度为0.5mol/l的edta（ph8.0）；待edta混匀后，加入浓度为0.1mol/l的nacl；待nacl混匀后，加入浓度为20g/l的sds，加入无菌水至所需体积。

b.三(2-羧乙基)膦选择的浓度为0.5mol/l。

c.裂解液的配置：先在容量瓶中加入称取的异硫氰酸胍，加入浓度为12mmol/l、ph为3.2的tris-hcl；加入浓度为4.5mmol/l的氢氧化钠；待异硫氰酸胍全溶解后，加入浓度为6%的np-40混匀；待np-40混匀后加入浓度为2%的sds混匀，加入浓度为1mol/l的谷胱甘肽混匀，加入浓度为1mol/l的十二烷基肌酸钠，加入浓度为2%的peg6000，加入无菌水至所需体积。

d.结合液的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为10mmol/l，ph为3；异丙醇的浓度为75%，加入无菌水至所需的体积。

e.洗涤液1的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为60mmol/l、ph为5.5的tris-hcl；加入浓度为45%的乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。

f.洗涤液2的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为6mmol/l的cacl2；加入浓度为70%的乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。

g.洗涤液3的配置：加入浓度为80%的乙醇。

h.洗脱液的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为30mmol/l、ph为8.0的tris-hcl；加入浓度为3mmol/l的edta-2na的；混匀，加入无菌水至所需体积。

i.往96深孔板的第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是磁珠；第3列和第9列预分装的是洗涤液2；第4列和第10列预分装的是洗涤液3；第5列和第11列预分装的是洗涤液1；第6列和第12列预分装的是洗脱液。

j.封膜：在热封仪上，利用热封仪将96孔板封住。

实施例2：一种采血卡快速提取试剂盒的配制方法：

a.血片消化液的配置：先在容量瓶中加入浓度为3mol/l的tris-hcl（ph3.2）；待tris-hcl混匀后，加入浓度为0.8mol/l的edta（ph10.0）；待edta混匀后，加入浓度为0.3mol/l的nacl；待nacl混匀后，加入浓度为40g/l的sds，加入无菌水至所需体积。

b.三(2-羧乙基)膦选择的浓度为0.8mol/l。

c.裂解液的配置：先在容量瓶中加入称取的异硫氰酸胍，加入浓度为14mmol/l、ph为2.8的tris-hcl；加入浓度为2mmol/l的氢氧化钠；待异硫氰酸胍全溶解后，加入浓度为10%的np-40混匀；待np-40混匀后加入浓度为2%的sds混匀，加入浓度为4mol/l的谷胱甘肽混匀，加入浓度为4mol/l的十二烷基肌酸钠，加入浓度为10%的peg6000，加入无菌水至所需体积。

d.结合液的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为6mmol/l，ph为5.4；异丙醇的浓度为85%，加入无菌水至所需的体积。

e.洗涤液1的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为70mmol/l、ph为4.0的tris-hcl；加入浓度为60%的乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。

f.洗涤液2的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为10mmol/l的cacl2；加入浓度为80%的乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。

g.洗涤液3的配置：加入浓度为65%的乙醇。

h.洗脱液的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为45mmol/l、ph为9.0的tris-hcl；加入浓度为5mmol/l的edta-2na的；混匀，加入无菌水至所需体积。

i.往96深孔板的第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是磁珠；第3列和第9列预分装的是洗涤液2；第4列和第10列预分装的是洗涤液3；第5列和第11列预分装的是洗涤液1；第6列和第12列预分装的是洗脱液。

j.封膜：在热封仪上，利用热封仪将96孔板封住。

实施例3：一种采血卡快速提取试剂盒的应用

以采血卡为样本，先将把干浴锅调到56℃，再把采血卡的整个血斑剪成碎片，把碎片转移至1.5mlep管中。然后加入400μl血片消化液，50μl三(2-羧乙基)膦，震荡混匀后置于56℃中温浴1h，每15min混匀一次。最后12000rpm离心1min，抽取200μl上清作为检测样本。

将本发明试剂盒跟biobase公司的upureswabdnakit试剂盒分别分开对相同的待检测样本做实验。表1为实验的提取步骤，表2为本发明实施例1配制的试剂盒核酸的提取结果，表3为本发明实施例2配制的试剂盒核酸的提取结果，表4为biobase公司的upureswabdnakit试剂盒的核酸提取结果。

将96孔预分装深孔板上下颠倒混匀，置于离心机中，1000rpm瞬时离心10秒，使液体落回至分装板底部。将96孔预分装深孔板的封膜小心撕开，在预分装板的第1列和第7列加入200µl的待测样本。将8孔磁套棒和96孔预分装深孔板置于smart32核酸提取仪器中后，启动程序开始提取。仪器运行10分钟后，仪器暂停，往样本孔中添加200μl结合液后，继续往后提取程序。提取结束后，第6列和第12列中即为核酸溶液。

表1

表2

表3

表4

实验测了20个样本，本发明跟biobase公司的upureswabdnakit相比，本发明试剂盒提取得到的核酸浓度平均要高出6ng/µl，本发明的260/280（核酸/蛋白质）的比值高0.2-0.3。证明本试剂盒提取出来的核酸比biobase公司的upureswabdnakit的蛋白质含量要低，提取出来的核酸纯度更高。从而验证本发明试剂盒中用三(2-羧乙基)膦代替蛋白酶k，和在裂解液中加入peg6000作为分散剂，能获得更好更稳定的提取效率。

当然，本发明创造并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。