抗CK7蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合ck7蛋白的单克隆抗体umab161、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术：

cks(细胞角蛋白)主要分布于上皮细胞，是上皮组织分化的基本标记物。它是角质细胞中的主要骨架蛋白，主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。cks家族至少包含20种不同分子，包括酸性角蛋白(i型角蛋白，角蛋白9-23)和碱性角蛋白(ii型角蛋白，角蛋白1至8)，其表达取决于细胞类型和分化位置，是一种常用的肿瘤免疫组织化学标记物，在许多上皮肿瘤细胞的鉴别诊断中扮演重要角色。研究表明，角蛋白基因突变与皮肤病、肝脏和胰腺疾病以及炎性肠道疾病有关。

ck7又名krt7或scl，是cks家族中的一员，属于ii型角蛋白。ck7主要表达在简单上皮细胞、间皮细胞、尿路上皮细胞和假复层上皮细胞，在胃窝、肠和分层鳞状上皮细胞中的表达低或不可检测。因大多数上皮癌细胞均表达ck7，所以其与ck20的协调表达通常用作各种上皮细胞癌症的诊断标记。目前临床上常用免疫组织化学(ihc)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而ihc实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对ck7蛋白的单克隆抗体对ihc检测ck7表达水平具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的ck7蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测ck7蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，保藏日期为2017年4月6日，保藏编号为cgmccno.13820。

本发明还提供了一种特异性结合ck7蛋白的单克隆抗体umab161，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据ck7orf核苷酸序列(ck7orf核苷酸序列如seqidno.1所示，1410bp；ck7氨基酸序列如seqidno.2所示)

设计引物pcr扩增ck7orf第1bp位到第345bp位序列和第1023bp位到第1410bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点sgfi和mlui，插入表达载体pet23a-n-his，构建ck7重组表达质粒pet23a-his-rck7

(2)ck7重组蛋白的表达与纯化：将ck7重组表达质粒转化ecoli，裂解离心获得可溶性蛋白，镍亲和层析柱纯化，获得纯化的ck7重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的ck7重组蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗ck7特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为umab161，亚型鉴定为igg1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得ck7单克隆抗体umab161。分别通过westernblot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体umab161在制备用于检测ck7蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体umab161，可检测组织细胞中ck7的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与ck7的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等相关肿瘤组织。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为cgmccno.13820)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体umab161。本发明还提供了单克隆抗体umab161在制备用于检测ck7蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体umab161的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体umab161在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与ck7蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了ck7蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤浸润细胞内ck7蛋白表达水平，可应用于肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等相关肿瘤免疫微环境的检测。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株umab161的分类命名为：鼠抗人细胞角蛋白7(ck7)单克隆杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：cgmcc；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2017年4月6日；

保藏编号：cgmccno.13820。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为orf区；

图2示实施例2重组ck7蛋白westernblot检测结果图，以anti-his检测重组ck7蛋白在ecoli裂解液中的表达，其中左侧泳道为转化空载体的ecoli裂解液为抗原的检测结果、右侧泳道为转化pet23a-his-rck7质粒的ecoli裂解液抗原的检测结果；

图3示实施例2重组ck7蛋白sds-page结果图，用镍亲和层析柱纯化重组ck7蛋白，纯化后的蛋白通过sds-page胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4示实施例3以单克隆抗体umab161识别293t细胞过表达的cks家族完整蛋白的westernblot检测结果图。从左到右依次为转染krt5、krt6、krt7、krt8、krt17、krt18、krt19、krt20、krt12、krt15重组表达质粒的细胞裂解液。

图5示实施例3以单克隆抗体umab161识别9种不同肿瘤细胞系中内源ck7蛋白的westernblot检测结果图。从左到右细胞裂解液依次为1：hepag2，2：hela，3：sv-t2，4：a549，5：cos7，6：jurkat，7：mdck，8：pc12，9：mcf7。

图6示实施例3以单克隆抗体umab161识别10种不同人组织裂解液中内源ck7蛋白的westernblot检测结果图。从左到右人组织裂解液分别为1：睾丸，2：网膜，3：子宫，4：乳腺，5：脑，6：肝，7：卵巢，8：甲状腺，9：结肠，10：脾。

图7示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人结肠免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图8示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肾脏免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图9示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肾癌免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图10示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肝脏免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图11示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肺脏免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图12示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肺癌免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图13示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人卵巢癌免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图14示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人胰腺免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图15示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人胰腺癌免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图16示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人甲状腺免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图17示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人前列腺免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图18示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人前列腺癌免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图19示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人膀胱免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图20示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人膀胱癌免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图21示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人皮肤免疫组化结果图(一抗为ck7单克隆抗体umab161)；

图22示实施例5人宫颈癌细胞hela免疫荧光染色结果图(左上角为鬼笔环肽phalloidin标记的微丝，右上角一抗为ck7单克隆抗体umab161，左下角为dapi核染，右下角为重叠图)；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、ck7重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒rc201124(含ck7orf1410bp)为模板，设计引物并分别引入酶切位点sgfi和mlui，克隆入表达载体pet23a-n-his，建立ck7重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、ck7重组蛋白的表达与纯化

1、转化e.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒dna轻混匀，冰浴30min后42℃热激90s，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗生素lb培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

2、裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至od值达到0.4～0.6时加入iptg(终浓度1mm)诱导培养7h。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-his抗体wb验证ck7蛋白的表达，见图2。

3、镍亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后进行sds-page鉴定，将符合要求的洗脱蛋白合并并加入10％甘油，纯化后的重组ck7蛋白用sds-page鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pet23a-his-rck7质粒的e.coli裂解液中wb检测后在27kd处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明细胞中重组ck7蛋白特异表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在sds-page胶27kd处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的ck7重组蛋白。

实施例3、ck7单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的ck7蛋白片段对balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的ck7抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为30μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为30μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用ck7纯化重组蛋白进行elisa测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为umab161。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株umab161产生的单抗为igg1，采用proteing进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、wb检测、分装、冻存在-20℃。其中wb检测结果见图4——图6。

由图4结果可见，umab161能够很好的识别ck7全长蛋白，弱交叉识别krt12、krt15及krt19全长蛋白；由图5结果可见，umab161特异识别hela及a549细胞中的内源ck7蛋白；由图6结果可见，umab161特异识别网膜组织中的内源ck7蛋白，分子量与预期分子量大小一致，表明单克隆抗体umab161能特异地westernblot检测完整的ck7蛋白。

实施例4、单克隆抗体umab161为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的人肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等组织进行石蜡包埋，使用finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次。

3、加入抗原修复液(0.01m，ph6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(pbs+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入ck7单抗(umab161)，稀释比：1:200，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。pbst(0.02％tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加polink-试剂盒2(catlogno.d37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用pbs洗涤3次，每次5min。滴加polink-2试剂盒(catlogno.d37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用pbs洗涤3次，每次5min。

8、应用dab溶液(中杉金桥zli-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图7——图21。

(2)、实验结果：

由图7——图21结果可见，人肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等组织中可见到特异性细胞质染色。结果与ck7在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体umab161可用于免疫组织化学检测ck7蛋白的水平。

实施例5、单克隆抗体umab161为一抗的免疫荧光检测

1)、实验方法：

1、细胞铺版：取体外培养的人宫颈癌细胞hela平铺到24孔板中，放置培养箱培养24小时。

2、去除培养基，用预热的pbs洗涤一次，制作细胞单层培养物。

3、固定：4％的多聚甲醛(pbs配制)室温固定10分钟。

4、去除固定液，pbs洗涤3次。若不立刻使用，浸泡在nan3/pbs中保存于4℃。

5、穿透：室温下用0.1％triton-x-100(pbs配制)穿透打孔5分钟，pbs洗涤3次。

6、加上封闭液(pbs+2％bsa)，37℃孵育60分钟。

7、加入ck7单抗(umab161)，稀释比：1:50，使用封闭液进行稀释，37℃孵育60分钟。pbs洗涤3次。

8、加入alexaaffinipuregoatanti-mouseigg(h+l)(jacksonimmunoresearch115-545-003)，稀释比：1:500，使用封闭液进行稀释，室温避光孵育60分钟。pbs洗涤3次。

9、加入alexa594-phalloidin(鬼笔环肽)标记微丝。

10、dapi(hh3342)复染细胞核3分钟，镜检。

(2)、实验结果：

结果如图8所示，在hela细胞中可见到特异性胞质染色，表明单克隆抗体umab161可用于免疫荧光检测ck7蛋白的水平。

sequencelisting

<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120>抗ck7蛋白单克隆抗体及其用途

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<211>1410

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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origin

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