增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法与流程

本发明涉及的是生物医药领域，具体说是一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法，主要是通过在珍贵束丝放线菌atcc31280的糖基转移酶表达基因中断缺失突变株nxj-22中，利用强启动子kasop*过量表达后修饰基因asm10，增强安丝菌素甲基转移效率，提高安丝菌素生物合成能力，进而提高安丝菌素产量。

背景技术：

安丝菌素是由珍贵束丝放线菌（actinosynnemapretiosum）产生的一种大环内酰胺类抗生素，它能够与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管组装，从而抑制肿瘤细胞分裂。来自immunogen，inc.公司的chari等人通过在c-3位酯链上连接二硫键形成的dm1分子，经dtt还原后可与不同的抗体连接形成抗体结合分子。目前，安丝菌素多种dm1抗体结合分子已经进入不同的临床实验阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的trastuzumabemtansine（即t-dm1）已经成药上市。除了抗肿瘤活性外，安丝菌素还能抑制真核生物，如真菌，酵母，昆虫等。

安丝菌素生物合成主要包括三部分：起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸（ahba）的合成，聚酮链的延伸（i型聚酮合酶催化）和复杂的后修饰途径，包括：氯代、氧甲基化、氨甲酰化、酰化、环氧化、n-甲基化（sam依赖）或者糖基化形成安丝菌素，其中由糖基转移酶asm25催化的n-糖基化反应为n-甲基化反应的竞争途径，生成分支产物-糖基化安丝菌素。虽然可通过糖基转移酶表达基因进行中断缺失，得到的突变株nxj-22，使n位糖基化对n位甲基化途径的竞争被消除，但是，n位甲基化效率仍旧较低。通过现有技术公开的内容可知，后修饰途径的效率对于终产物的产量和活性都有着至关重要的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高产安丝菌素的菌株、该突变株的制备方法以及通过该突变株高产安丝菌素的方法。该突变株基于过量表达n位甲基转移酶表达基因asm10，通过加倍安丝菌素生物合成途径中的限速步骤基因，增强甲基转移酶基因表达水平，从而提高安丝菌素的产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株，其技术要点是：所述菌株的n位甲基转移酶过量表达。

进一步的，突变株由菌株atcc31280过量表达后获得。

另一方面，本发明提供了该增强转录水平的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：

步骤1），构建用于加倍甲基转移酶基因asm10的整合型质粒载体；

步骤2），将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌nxj-22中进行同源重组，并筛选基因过量表达的突变株。

进一步的，步骤1）中，质粒载体由质粒pdr3-k*重组获得。

进一步的，基因asm10来源于珍贵束丝放线菌atcc31565。

进一步的，在起始密码子前插入rbs位点序列atctgagttgaagaggtgacgtc。

进一步的，步骤3)中，通过抗性筛选和pcr验证获得过量表达asm10基因的突变株。

进一步的，质粒载体的构建通过在质粒的spei/ecori位点插入asm10的pcr片段（spei/ecori）。

此外，本发明还提供了一种采用上述突变株制备安丝菌素的方法，其技术要点是，包括以下步骤：将活化后的asm10基因过量表达突变株的菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220r/min条件下培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220r/min的转速下培养24h；按10%的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220r/min的转速下发酵7d后收集发酵液并进行萃取。

进一步的，上述安丝菌素的制备方法中：

一级种子培养基包括tsb3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖5w/v%；

或者二级种子培养基包括tsb3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖2.5w/v%，异丁醇0.05v/v%，异丙醇0.05v/v%，淀粉1w/v%；

或者发酵培养基包括酵母提取物0.8w/v%，麦芽提取物1w/v%，蔗糖1.5w/v%，异丁醇0.5v/v%，异丙醇1.2v/v%，淀粉2.5w/v%，mgcl22mmol/l。

本发明的有益效果：现有技术中，通常选用的受体菌为a.pretiosumatcc31565，以asm10基因回补所用载体为pib139，所用启动子为perme*，而本发明所用受体菌为atcc31280衍生的突变株，asm10基因过量表达所用载体为pdr3-k*，所用启动子为kasop*。通过上述方法，相较于现有技术asm10基因回补到突变株中时，ap-3产量恢复到与野生型相近水平；而通过本发明的方法在asm10基因过量表达后，ap-3产量对比对照菌株提高至少173%。

综上所述，在珍贵束丝放线菌atcc31280的糖基转移酶基因中断缺失突变株nxj-22中，利用整合型载体pdr3-k*(φc31整合位点，pset152衍生，带有kasop*强启动子），在nxj-22染色体上插入一个拷贝的甲基转移酶表达基因asm10(来源于珍贵束丝放线菌atcc31565），增强asm10的转录水平，较对照菌株（空白载体整合菌株）提高173%以上，最终产量达到141.8mg/l，通过本发明可显著提高安丝菌素的发酵产量。

附图说明

图1为asm10基因加倍质粒构建示意图；

图2为asm10基因过表达突变株与对照菌株转录水平对比示意图；

图3为asm10基因加倍突变株与对照菌株安丝菌素发酵产量示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。虽然以下给出了本发明优化的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例1

本实施例为制备基因asm10过量表达的突变株的具体过程。具体包括以下步骤：

步骤1），构建质粒plq586：以珍贵束丝放线菌atcc31565基因组dna作为模板，使用引物asm10-f/r，通过pcr扩增得到asm10片段（885bp），在序列两端引入spei/ecori酶切位点，并在起始密码子前插入rbs序列（atctgagttgaagaggtgacgtc）。在质粒pdr3-k*的spei/ecori位点插入asm10(spei/ecori))，得到质粒plq586。

*本发明涉及的各内切酶识别位点（酶切位点）如下：

步骤1)所用到的引物序列为：

*步骤1）中基因片段制备所采用的pcr体系及条件：

pcr反应体系：dna模板30ng，引物30pmol，50%dmso3ml，25mmmg²⁺2ml，缓冲液3ml，kod聚合酶1个单位，加纯水补齐至30ml；

pcr条件：95℃5min；95℃30s；60℃30s；68℃2min；循环30次；68℃10min。

步骤2），将步骤1）构建得到的过量表达（基因加倍）的质粒载体plq586通过接合转移导入受体菌nxj-22中进行同源重组，并通过pcr验证筛选正确的接合子，从而得到asm10基因加倍（过量表达）的突变株。具体包括以下步骤：

将基因asm10过量表达的质粒plq586转化进入宿主et12567（含有puz8002质粒）中。取et12567于含有apr、kan和chl三种抗生素的lb中，37°c过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10%的比例转接一次并培养2.5h，然后用新鲜的lb溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时制备突变株nxj-22的新鲜菌丝体（约16h培养物），用lb溶液漂洗2~3次之后，将其与之前制备的宿主菌et12567混合(菌丝体细胞和宿主菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mm镁离子的ymg平板，待平板吹干后转移至37°c培养箱倒置培养12h后取出平板，分别取阿泊拉霉素和萘啶酮酸两种抗生素的储存液各40ml加入1.5ml无菌水中混匀后覆盖在ymg平板上，将平板晾干后转移至30°c培养箱中倒置培养。一般3~5d后可见平板上有单菌落接合子长出，将其通过平板涂布于含有阿泊拉霉素和萘啶酮酸两种抗生素的ymg平板扩大培养，通过菌丝体pcr验证筛选得到asm10基因加倍的突变株。

*步骤2）中通过pcr验证筛选时所采用的pcr体系及条件：

pcr体系：dna模板10~100ng，引物30pmol，50%dmso3ml，缓冲液3ml，taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30ml；

pcr条件：95℃5min；95℃30秒；58℃30s；72℃1min；循环30次；72℃10min。

实施例2

本实施例为通过基因asm10过量表达的突变株生物合成安丝菌素的发酵过程。具体步骤如下：将asm10过量表达的菌株涂布于固体ymg培养基上活化，30℃培养2d后，挑取少量菌丝体接种至一级种子培养基中，30℃、220r/min条件下培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220r/min条件下培养24h；按10%的接种量转接至发酵培养基，25℃、220r/min条件下发酵7d后收集发酵液进行萃取和化合物检测。

表1种子培养基及发酵培养基的成分构成

实施例3

本实施例为通过荧光定量pcr测定基因加倍菌株中加倍基因转录水平的方法。（用于rna提取的样品一般都保存在redzol溶液中。rna提取过程要求低温，离心过程除特殊说明，均在4°c、12000r/min的条件下进行。）

具体步骤为：取已经破碎处理的样品500ml加入100ml氯仿涡旋振荡混匀，离心15min后吸取上清液，加入100ml无水乙醇并混匀后将样品吸入离心柱（北京赛百盛基因技术有限公司）中，静置2min，离心1min，弃液体，用漂洗液（washingbuffer，北京赛百盛基因技术有限公司)漂洗两次，弃液体，将离心柱置于收集管中继续离心2min。换用新的收集管，往离心柱中加入60mldepc处理过的水，离心2min，将rna样品从离心柱上洗脱下来。用nanodrop2000型核酸蛋白分析仪测定rna的浓度和od260/280，提取后的rna样品-80°c保存。rna样品的消化反应体系可参照下表配制：

反应体系置于37°c孵育4h后每个反应体系加入5ml50mmedta后65°c加热10min即可终止消化，消化好的rna样品-80°c保存。rna经过逆转录后就得到cdna，可用于后续的基因转录分析。将得到的cdna利用荧光定量pcr进行检测，试剂盒可选用fermentas公司的maximasybrgreen/roxqpcrmaxtermix(2×)。

测定基因转录水平时使用的引物：

图2为asm10基因加倍突变株与对照菌株的荧光定量pcr结果。结果表明突变株和对照相比，目的基因在加倍突变株中的转录水平对比对照提高大约22倍，说明asm10基因已经被成功加倍。

实施例4

本实施例为利用hplc检测安丝菌素的发酵产量的方法。具体为：采用安捷伦公司的agilent1200系列hplc进行色谱分析，并采用dad二极管阵列检测器测定236nm下的色谱吸收峰。

其中，hplc参数如下：

色谱柱：agilentzorbaxsb-c18,2.1´150mm,3.5µm；

流动相流速：0.1ml/min；

流动相：水溶液和hplc级甲醇梯度洗脱。

柱温：室温。

图3为asm10基因加倍突变株和安丝菌素发酵水平检测。结果表明突变株的产量对比野生型菌株提高173%以上，最终产量达到141.8mg/l。

本发明所涉及的菌株atcc31280已在文献《panwenqin,kangqianjin,wanglei,bailinquan*&dengzixin:asm8,aspecificlal-typeactivatorof3-amino-5-hydroxybenzoatebiosynthesisinansamitocinproduction.sciencechinalifesciences2013（7）：601-608》中记载。

本发明所涉及的菌株atcc31565已在申请公开号cn101103120a的发明专利申请中公开。

序列表

<110>辽宁斯韦尔生物科技有限公司

上海交通大学

<120>增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法

<130>17-0837

<141>2017-09-25

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>885

<212>dna

<213>珍贵束丝放线菌asm10(actinosynnemapretiosum)

<400>1

atgagcctcccagcggactcaccaccgccggggccggtggagatgcccgacgagagctgg60

acgtcgctgggcaacgcgggggcgcgggcgcaggagtccgcgcgggccgaccggttgttc120

gacgacccgctggcgcgggcgttcctggacgcggcggggacggggaacccgctgctgccc180

gaccggggtggcggtgatccggggctgctcgggcagatcacggacgtcatcgtggtcaag240

acggtgttcttcgacgcggtgctggcgcgggcggcggcggccggggtgcggcaggtggtg300

ctgctggccgccgggttggacgcccgcgcgttccggctgccctggcccgagggggtggtg360

gtgttcgaggtggacctgccggacgtgctggggttcaaggagcgcgtggtgcgggaggtc420

ggggcggagccctcgtgcgaccggcgggtcgtcgcggcggacctgcgctcggactgggtg480

gccgcgctggtcgccgccgggctggaccgggaggccccggtggcctggctggcggagggc540

gcgctggggctgctggacgaggccgggtgcgaggagctgatggcggcggtgctcggggcc600

tccgcggcggggagccggttcgcgctcgaccacacccacgacgggtggaaggccggggag660

gcgctgggcgggtacctggaggggaccggggtctgcttggccgacctggtgaaggggggt720

ccgcgggagccgggcggggcgtggttggcgcggcacgggtggcgggtggcggagtacgac780

gtcgtggcggaggcggcacggcacgggcggcccgcgccgaccctgttccgggtgccggag840

cggcgggcgaacgcgacgatcctgttcgaggccgagctggggtag885

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>位点(rbs)

<400>8

atctgagttgaagaggtgacgtc23

<210>8

<211>28

<212>dna

<213>引物(asm10-r)

<400>8

atagaattcctaccccagctcggcctcg28

<210>6

<211>47

<212>dna

<213>引物(asm10-f)

<400>6

ataactagtatctgagttgaagaggtgacgtcatgagcctcccagcg47

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>引物(asm10-rt-f)

<400>2

tctgcccgagcagccccggat21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>引物(asm10-rt-r)

<400>3

acgagagctggacgtcgctg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>引物(hrdb-rt-f)

<400>4

gttcccccaaggcgaagaag20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>引物(hrdb-rt-r)

<400>5

gcttggcgttctcctcctcg20