一种宁南霉素的纯化方法与流程

本发明涉及微生物源生物杀菌剂领域，特别涉及一种宁南霉素的纯化方法。

背景技术：

宁南霉素是中国科学院成都生物研究所历经七五、八五、九五国家科技攻关并研制成功的专利技术产品，这种菌是在四川省宁南县土壤分离而得，故将其发酵产物命名为宁南霉素。

宁南霉素ningnanmycin，由中国科学院成都生物研究所研制成功的创新生物农药，1997年获得国家发明专利，证书号zl93104287.9，由黑龙江强尔生化技术开发有限公司(1997年更名为德强生物股份有限公司)工业化生产成功，现已开发出2％水剂、8％水剂、10％可溶性粉剂、苦·宁种衣剂等宁南霉素系列产品，在烟草花叶病毒病、番茄病毒病、辣椒病毒病、水稻立枯病、大豆根腐病、水稻条纹叶枯病、苹果斑点落叶病、黄瓜白粉病上取得了登记，此外在防治油菜菌核病、荔枝霜疫霉病，其它作物病毒病、茎腐病、蔓枯病、白粉病等多种病害上也已大面积推广应用。

在原研专利：一种抗生素新农药—宁南霉素(zl93104287.9)分离和鉴定了宁南霉素，公开的生产工艺流程为：斜面菌种—>一级种子—>二级种子—>发酵罐—>发酵罐—>板框过滤—>薄膜浓缩(2～3倍)—>浓缩液加0.1-0.3苯甲酸钠—>装瓶—>成品，给出了水剂工艺但未有高纯度原药纯化工艺。

在《宁南霉素(16a-6)性质的初步鉴定》提供了一种纸层析色谱分离鉴定宁南霉素，《宁南霉素产生菌的选育和发酵条件研究》提供了一种发酵工业大规模发酵生产宁南霉素的选育和生产方法，但未有提供纯化工艺。

高效液相色谱hplc检测方法参考了《宁南霉素液相检测条件的确定》进行改进，《宁南霉素产业化研究进展》报道的工艺，只是简单的发酵也经过处理后得到水剂或者高浓度固体剂，也并未给出纯化方法。

《诺尔斯链霉菌西昌变种发酵液宁南霉素分离纯化工艺及其性质研究》中研究了利用离子交换柱层析从发酵液中初步分离经过前处理的宁南霉素，确定了树脂分离的工艺条件，并利用颗粒活性炭进行40分钟脱色，再利用有机溶剂沉淀分离浓缩，然后再利用氧化铝吸附层析分离宁南霉素，并对最佳分离纯化条件进行了筛选，最后利用结晶和重结晶精制得宁南霉素。发明人前期通过该工艺获得纯品用于确证，和抑菌实验，纯度符合实验要求但收率低，不符合工业化大量需要原药纯品量的生产需求。(可以从后面的附图看出有的杂质和主峰很近，较难分离到极高纯度的，需要重复结晶才行。)

本发明可以大量制备得高纯度的宁南霉素批次间稳定，产品可以提供医药新适应症用途研究(一般需要至少公斤量以上的产品)提供可能，以便减少杂质等因素导致研究数据不准确和毒副作用。由上背景对比，本发明的技术不同于上述的技术操作，得到的有益效果，产品纯度高，可以为其他医药用途提供低廉高品质原料。产品收率提高，这个工序操作虽然会有部分废水产生，但在整体工业生产中可以经过回收套用等步骤节约用水，产生的废水量不高，使用的工艺都是低能耗的绿色生产工艺技术—膜过滤。

技术实现要素：

为了解决背景技术中的技术问题，本发明是这样实现的：

一种宁南霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

含有宁南霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至3.5～4.5并静置；然后向发酵液中加入硅藻土助滤剂并搅拌，固液分离过滤得清液；

硅藻土助滤剂是一种抗生素发酵领域常规过滤加的助滤剂。菌体有时会粘稠不利于过滤分离，在板框过滤等固液分离时，菌体压缩会挤压在滤布上导致流出液体不通畅。适量加入硅藻土助滤剂可以隔开菌体，有利于固液分离，同时避免产生过多固体废弃物。

与加热菌液灭菌的方式相比，此操作顺序可以避免加热导致菌体应激内含物释放，进而导致后续处理难、杂质多，能耗高的问题。

层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为10～11，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；

由于发酵液调节后的酸会与菌体代谢物发生作用，初始调节的ph与最后清液的ph不会是同一个值的，一般固液分离后ph大约在5左右。因此上柱不会导致目标产物被酸性直接洗脱下来，而在这个范围，却可以达到较好的杂质去除及产物纯化的目的。

常规的阳离子交换树脂操作工艺是酸处理后，洗涤成中性，然后上样，进行交换吸附，然后用酸解析或者铵或者盐解析。本案的技术特征在于使用的是氨水处理后的阳离子交换树脂，铵根与阳离子交换树脂结合后，当宁南霉素通过树脂与铵进行置换，杂蛋白、色素等杂质交换的少，能达到较好的纯化目的。

上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用中性水冲洗2～5个柱体积；

春雷霉素的基团以及杂质与树脂的结合能力(范德华力)差异较小，需用盐酸水冲洗3～5个柱体积才可以把杂质、色素等去除的较干净。而宁南霉素的基团以及杂质与树脂的结合能力(范德华力)差异较大，直接用水冲洗冲洗2～5个柱体积就可以把杂质、色素等去除的较干净。

洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.01mol/l～0.1mol/l氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至3.5～4.5；

先用氨水洗脱2～3个柱体积，颜色较深(含有杂质与色素)排到废液处理系统，然后继续解析。当用氨水洗脱至4～8个柱体积，解析液中宁南霉素含量迅速升高；收集第4～8个柱体积(第4～8个柱体积中有高浓度的宁南霉素)的解析液。这就是为什么用氨水解析的目的，操作快；相比用酸解析，虽然酸解析对宁南霉素稳定性好，但洗脱时间长，解析出来的浓度不高，色素和杂质较多，颜色淡黄。

用盐酸将解析液的ph调至3.5～4.5是为了稳使宁南霉素更加稳定。若不用盐酸调节，在碱性环境下会被降解破坏，所以操作要及时，用氨水解析会比氯化铵或者盐酸样品出来较快，浓度较集中。

浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入用ph为4的盐酸水洗2～3次以除去多余的铵盐；继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至宁南霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为宁南霉素。

优选地，步骤1)静置时间为30min。

优选地，步骤1)中硅藻土助滤剂的加入量占链霉菌发酵液重量比的0.1％。

优选地，步骤1)搅拌时间为10min。

优选地，步骤2)浸泡阳离子交换树脂的酸液ph为1.0。

优选地，步骤2)所述的阳离子交换树脂为磺酸根强阳离子交换树脂或者上海华震树脂科技有限公司生产的hz008型号阳离子交换树脂。

优选地，步骤3)协调控制以下三个参数：清液通过层析介质的流速、阳离子交换树脂的使用量、层析柱的连接方式，避免清液因接近吸附或操作不当饱和时流出层析柱。

试验中，可以协调控制使得清液通过层析介质的流速2bv/h～5bv/h、阳离子交换树脂的使用量为10ml～20ml树脂/1g宁南霉素、层析柱为串联连接方式。

优选地，步骤4)先用氨水洗脱2～3个柱体积，然后继续解析，收集含有宁南霉素的第4～8个柱体积的解析液。

优选地，步骤5)中当宁南霉素浓缩60mg/ml～100mg/ml时采取降温的方式结晶析出宁南霉素。

优选地，步骤5)中当宁南霉素浓缩40mg/ml～100mg/ml时采取加入乙醇或丙酮有机溶剂结晶析出宁南霉素。

试验中，浓度可以通过液相色谱跟踪检测。有机溶剂与浓缩液的体积比为1：2～3时，析晶效果最好。

本发明有益效果在于：制备的南宁霉素纯度较高、收率较高，且整个纯化过程绿色环保。

附图说明

图1为宁南霉素二极管阵列检测器扫描产品峰紫外波长图谱；

图2为宁南霉素发酵液经过处理后离子交换层析之前hplc；

图3为宁南霉素发酵液经过常规离子交换柱法纯化后的产品hplc；

图4为宁南霉素发酵液经过本工艺纯化后的产品hplc；

图5为宁南霉素发酵液经过本工艺纯化后的质谱图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

实施例1

一种宁南霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

1)含有宁南霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至3.5并静置；然后向发酵液中加入硅藻土助滤剂并搅拌，固液分离过滤得清液；

2)层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为10，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；

3)上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用中性水冲洗2个柱体积；

4)洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.01mol/l氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至3.5；

5)浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入用ph为4的盐酸水洗2次以除去多余的铵盐；继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至宁南霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为宁南霉素。

实施例2

一种宁南霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

1)含有宁南霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至4.5并静置；然后向发酵液中加入硅藻土助滤剂并搅拌，固液分离过滤得清液；

2)层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为11，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；

3)上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用中性水冲洗5个柱体积；

4)洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.1mol/l氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至4.5；

5)浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入用ph为4的盐酸水洗3次以除去多余的铵盐；继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至宁南霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为宁南霉素。

实施例3

实施例3在实施例1的基础上，进一步限定步骤1)静置时间为30min。

实施例4

实施例4在实施例2的基础上，进一步限定步骤1)中硅藻土助滤剂的加入量占链霉菌发酵液重量比的0.1％。

实施例5

实施例5在实施例1的基础上，进一步限定步骤1)搅拌时间为10min。

实施例6

实施例6在实施例2的基础上，进一步限定步骤2)浸泡阳离子交换树脂的酸液ph为1.0。

实施例7

实施例7在实施例1的基础上，进一步限定步骤2)所述的阳离子交换树脂为磺酸根强阳离子交换树脂或者上海华震树脂科技有限公司生产的hz008型号阳离子交换树脂。

实施例8

实施例8在实施例2的基础上，进一步限定步骤3)协调控制以下三个参数：清液通过层析介质的流速、阳离子交换树脂的使用量、层析柱的连接方式，避免清液因接近吸附或操作不当饱和时流出层析柱。

实施例9

实施例9在实施例1的基础上，进一步限定步骤4)先用氨水洗脱3个柱体积，然后继续解析，收集含有宁南霉素的第6个柱体积的解析液。

实施例10

实施例10在实施例9的基础上，进一步限定步骤4)先用氨水洗脱2个柱体积，然后继续解析，收集含有宁南霉素的第8个柱体积的解析液。

实施例11

实施例11在实施例2的基础上，进一步限定步骤5)中当宁南霉素浓缩60mg/ml时采取降温的方式结晶析出宁南霉素。

实施例12

实施例12在实施例11的基础上，进一步限定步骤5)中当宁南霉素浓缩100mg/ml时采取降温的方式结晶析出宁南霉素。

实施例13

实施例13在实施例2的基础上，进一步限定步骤5)中当宁南霉素浓缩40mg/ml时采取加入乙醇有机溶剂结晶析出宁南霉素。

实施例14

实施例14在实施例11的基础上，进一步限定步骤5)中当宁南霉素浓缩100mg/ml时采取加入丙酮有机溶剂结晶析出宁南霉素。

实施例15

一种宁南霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

1)含有宁南霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至4并静置；然后向发酵液中加入硅藻土助滤剂并搅拌，固液分离过滤得清液；步骤1)静置时间为30min，步骤1)中硅藻土助滤剂的加入量占链霉菌发酵液重量比的0.1％，步骤1)搅拌时间为10min。

2)层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为10.5，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；步骤2)浸泡阳离子交换树脂的酸液ph为1.0，步骤2)所述的阳离子交换树脂为磺酸根强阳离子交换树脂或者上海华震树脂科技有限公司生产的hz008型号阳离子交换树脂。

3)上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用中性水冲洗4个柱体积；步骤3)协调控制以下三个参数：清液通过层析介质的流速、阳离子交换树脂的使用量、层析柱的连接方式，避免清液因接近吸附或操作不当饱和时流出层析柱。

4)洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.05mol/l氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至4.0；

5)浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入用ph为4的盐酸水洗3次以除去多余的铵盐；继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至宁南霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为宁南霉素。步骤5)中当宁南霉素浓缩80mg/ml时采取降温的方式结晶析出宁南霉素。或者步骤5)中当宁南霉素浓缩60mg/ml时采取加入丙酮有机溶剂结晶析出宁南霉素。

取实施例15中的宁南霉素，作如下检测，检测结果详见附图1、附图2、附图3、附图4、附图5。由附图对比可知，本发明纯化的南宁霉素具有较高的纯度。

宁南霉素高效液相色谱检测方法：参考文献《宁南霉素液相检测条件的确定》改进，色谱条件：十八烷基键合硅胶(ods-c18)4.6*250mm，5um，流动相：体积比乙腈：50mm磷酸二氢铵-磷酸水溶液(磷酸调节ph＝2.5)＝5：95，流速：1.0ml/min，波长268nm(参考已经报道文献检测波长，另附二极管阵列检测器对产品峰的紫外吸收图谱确证，及附加对产品的质谱确证)。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。