本发明涉及一种鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异引物对中华绒螯蟹标本快速鉴别的方法。
背景技术：
中华绒螯蟹(学名：eriocheirsinensis)栖于淡水湖泊河流。每年6至7月间新生幼蟹溯河进入淡水后，栖于江河、湖荡的岸边。喜掘穴而居，或隐藏在石砾、水草丛中。掘穴时主要靠1对螯足，步足只起辅助作用。以水生植物、底栖动物、有机碎屑及动物尸体为食。取食时靠螯足捕捉，然后将食物送至口边。营养条件好时，当年幼蟹体重可达50至70克，最大可达150克，且性腺成熟，可与2龄蟹一起参加生殖洄游。如放养密度大或生长慢，则2龄时性腺也难以成熟，不能参加生殖洄游。目前，对中华绒螯蟹的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。由于长江上游水坝修筑导致产卵地遭到破坏；加之外来物种的入侵及水体污染导致中华绒螯蟹的生存环境遭受严重破坏，所以中华绒螯蟹的种群数量日益下降。因此，对中华绒螯蟹地方特有种进行有效鉴定以及物种保护已经刻不容缓。
dna条形码技术(dnabarcoding)是指用基因组内一段标准的、短的dna片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。dna条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。dna条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。dna条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用dna条形码技术，可以很好的对中华绒螯蟹进行快速、有效的鉴定。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。
技术实现要素：
本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种快速鉴别中华绒螯蟹的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物，该引物的核苷酸序列如下：
上游引物pxf:5’-acttggtggtttaaacttaaccc-3’；
下游引物pxr:5’-attgaattagtatagaaagggag-3’。
该对分子特异性引物是采用普通pcr技术，经过对中华绒螯蟹标本的核糖体its区序列的克隆序列，然后通过ncbi的序列比对设计的，上述引物具有极高的专一性，用此对引物进行pcr扩增，可以获得200bp左右的特异性片段。
本发明还涉及上述的分子特异性标记引物(pxf/pxr)在鉴别中华绒螯蟹中的应用。
本发明还涉及上述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别中华绒螯蟹的试剂盒中的应用。
一种用于鉴别中华绒螯蟹的试剂盒，该试剂盒中包含上述的分子特异性标记引物。该试剂盒中还包含pcr常用试剂。
一种快速鉴别中华绒螯蟹的方法，以待测样本的基因组dna为模板，以上述的分子特异性标记引物(pxf/pxr)作为扩增引物进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现dna目的条带，则待测样本为中华绒螯蟹。所述的dna目的条带为200±10bp的dna目的条带。
上述pcr扩增的反应程序为：94℃变性5min；94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。
上述方法中扩增的选择、基因组dna提取、pcr反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。
需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于中华绒螯蟹的形态学特征初步的判断，再将判断为中华绒螯蟹的标本运用本发明方法鉴别。
对本发明所述快速鉴别中华绒螯蟹方法进行验证的具体步骤如下：
(1)从浸泡标本中剪取中华绒螯蟹的部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。
(2)生物公司试剂盒方法提取样品中的基因组dna，于-20℃保存备用。
(3)以步骤(2)提取的基因组dna为模板，以所述分子特异性标记引物(pxf/pxr)作为扩增引物，进行pcr扩增：
pcr反应体系(总体积为25μl)组成为：
pcr反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min)；72℃条件下延伸10min。
取2μlpcr产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120v，200ma，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示，检出大小约为200±10bp的条带，可初步判定待测样本为中华绒螯蟹。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明的分子特异性标记引物(pxf/pxr)可对中华绒螯蟹进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别中华绒螯蟹的有效辅助手段。
附图说明
图1是采用本发明的核酸分子特异性标记引物对中华绒螯蟹进行pcr扩增的电泳图。
其中，m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段；5,6为阴性对照。
具体实施方式
本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别中华绒螯蟹，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
(1)待测中华绒螯蟹基因组dna的提取
取中华绒螯蟹组织样品，剪碎后使用基因组dna提取试剂盒进行提取，利用1.5％琼脂糖胶对所得dna进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测dna浓度，于-20℃冰箱存放备用。
(2)设计合成特异性pcr扩增引物
设计合成基于中华绒螯蟹的特异性引物，上游引物pxf：5’-acttggtggtttaaacttaaccc-3’和下游引物pxr：5’-attgaattagtatagaaagggag-3’，由技术人员设计，并由引物设计公司合成。
(3)分子特异性标记引物(pxf/pxr)的pcr扩增
pcr反应体系25μl：10×pcrbuffer2.5μl，dntps0.5μl，taq(5u/μl)0.2μl，mgcl21.5μl，pxf引物(10μm)1μl，pxr引物(10μm)1μl，dna模板(约10ng/μl)1μl，ddh2o17.3μl。
pcr反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min)；72℃条件下延伸10min。
(4)电泳检测：
取2μlpcr产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120v，200ma，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。
m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段；5,6为阴性对照。由图1可见，扩增出分子量约为200bp左右的特异性dna条带。。
实施例2：
用实施例1的方法进行中华绒螯蟹、日本绒螯蟹、梭子蟹三种蟹类检测，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，在实验人员未知物种名称的情况下开展实验，结果表明仅仅有一种蟹可扩增出分子量约为200bp左右的特异性dna条带，另两种蟹类样本不能扩增出，检测结果与取样人记录信息完全一致。可表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别中华绒螯蟹。
实施例3：
从蟹类组织样本中选取2组肌肉组织样，保存在95％酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的蟹类，其中一组为中华绒螯蟹(5个样品)，另一组为其他品种(5个样品)，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，pcr产物测序结果显示其中一组的5个样品能够扩增出200bp左右的特异性dna条带为中华绒螯蟹的组织样本，另一组的5个样品为非中华绒螯蟹的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致。
上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>镇江华大检测有限公司
<120>鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法
<160>2
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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acttggtggtttaaacttaaccc23
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