本发明涉及用于敲除ccr5基因的grna、表达载体、基因编辑系统、试剂盒及它们的相关用途，属于基因工程领域。
背景技术：
：获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)感染所引起的免疫系统疾病，是一种危害性极大的全球化传染病。hiv以人体免疫系统中最重要的t淋巴细胞作为主要攻击对象，造成免疫功能丧失，从而易患各种疾病，死亡率高达99％-100％。hiv在人体内的潜伏期能长达8-10年，很多hiv感染者在发展成艾滋病患者之前可以无病症的生活，但病毒在人体内始终存在并不可治愈。虽然全世界众多医学研究人员专注于艾滋病的预防和治疗，但至今尚未研制出特效药物，由于hiv的变异极其迅速，因此也还没有可用于预防的有效疫苗。对于hiv感染的治疗，目前的主要策略是最大限度和持久的降低病毒载量、获得免疫功能重建和维持免疫功能、提高生活质量，以及降低hiv相关的发病率和死亡率。抗逆转录病毒治疗(anti-retroviraltherapy，art)是近年来广泛使用的治疗手段，它有效抑制hiv在体内的复制，减少体内病毒载量，从而延长感染者的寿命。但药物副作用、病毒的耐药性突变、终身服药的依从性等都是抗逆转录病毒治疗在临床使用上不可避免的问题。而以基因为基础的治疗方法可以持续的抑制病毒从而减少治疗干预措施，是一种非常有前景的治疗方式。随着基因编辑技术的兴起，多国科学家都尝试通过zfn、talent、crispr-cas9等基因编辑技术，敲除hiv入侵和整合过程中的关键基因，从而干预病毒的转录、复制和扩散。全球首例hiv感染的治愈发生在“柏林病人”身上，他接受了一名ccr5-δ32基因突变纯合体捐献者的骨髓移植，此后的五年都没有在其身上检测到hiv病毒的踪迹。hiv-1主要有r5-嗜性和x4-嗜性两种，对应的辅助受体分别为ccr5和cxcr4，r5-嗜性病毒是目前最普遍感染且在感染的前期起主导作用的病毒类型。通过基因编辑的方式敲除或抑制细胞(如cd4+t细胞、淋巴细胞、骨髓干细胞等)表面的hiv病毒辅助受体ccr5的表达，抑制病毒扩散从而延缓和治疗艾滋病，已经成为hiv基因治疗研究的常见思路。对hiv感染基因治疗手段的发展经历了两个阶段：一，基于rna的治疗方法，即一种下调相关基因表达量的方法，如shrna、sirna、反义rna等；二，基于蛋白质的治疗方法，即对相关基因的敲除，如zfn(zincfingernuclease)、criapr/cas9，talen(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)等。其中crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)-cas(crispr-associatedendonuclease)系统是基因治疗领域的新成员，是一款强大的基因编辑工具。有别于zfn和talen需要研究者根据目的基因设计和生产一对特异性的核酸酶，crispr更简单，具有更广泛的适应性适应前景更广泛。crispr是在细菌体内发现的一种抵抗外来病毒入侵的系统，科学家在多种细菌中均发现了crispr，但目前最常用，研究最成熟的是酿脓链球菌streptococcuspyogenes的crispr系统。它由一段crrna和tracrrna的嵌合体(crrna-tracrrnachimera)和一个ⅱ类crispr系统的非特异性的内切核酸酶9(cas9)组成，其中的rna嵌合体由一段cas9绑定序列grnascaffold和一段20nt左右的靶向结合目的基因/位点的rna向导序列(guiderna，grna)构成。靶序列末端的pam(5’-ngg-3’)序列(protospaceradjacentmotif)为cas9识别位点,是实现剪切功能的关键。只要根据目的基因设计特异性的grna序列，即可引导cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(doublestrandbreak,dsb)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologousend-joining，nhej)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。因为酿脓链球菌cas9的pam序列只有三个核苷酸，grna识别的靶序列也只是20个核苷酸，虽然设计和使用起来简便，但是非特异结合(脱靶)的几率也相对较大。脱靶即rna嵌合体和cas9蛋白非特异的结合于除目的基因以外的基因组的其他位点，可能导致非预期的基因突变，对人体造成不可预估和不可控制的影响。脱靶效率对于基因治疗来说，是临床使用上的安全隐患，也是限制该技术发展和应用的主要原因。nickase(缺口酶)是cas9蛋白的d10a突变型，它保留了结合grna从而靶定目的基因的功能，但是不能产生双链断裂，只能在识别位点附近产生一个单链缺口。切口酶配合一对grna(分别位于正义链和反义链)使用，可分别在相对的两条dna链上产生切口，从而形成功能性的双链断裂。随后细胞通过nhej机制修复基因并引入插入/缺失突变，达到基因敲除的目的。nickase配合一对分别位于目的基因正义链和反义链的grna使用，将特异性识别的靶序列从一段20nt的核苷酸序列扩增到两段共40nt的核苷酸序列，同时两段靶序列的3’-端都要求有pam序列。这种设计最大限度的降低了crispr技术的脱靶效应，大大减少了非预期的脱靶基因修饰。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能有效敲除ccr5基因的crispr-cas9基因编辑系统，在有效敲除ccr5基因的同时使得设计和使用大大简化。另外，本发明还提供一种既能有效敲除ccr5基因，又能将脱靶效率降到最低的crispr-nickase基因编辑系统，从而降低crispr技术在hiv基因治疗中使用的安全风险，提高临床应用的可行性。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明通过使用crispr-cas9技术来编辑、敲除ccr5基因，只要在pam序列(5’-ngg-3’)的5’-端根据ccr5的核苷酸序列设计20nt的特异性grna序列，即可引导cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(doublestrandbreak,dsb)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologousend-joining，nhej)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。相比起zfn技术，本方案设计简便，靶位点可选性大，系统构建容易，使用成本低，但是，但正由于crispr-cas9对于目的基因的识别只依赖20nt的核苷酸序列，相较zfn来说，存在更高的脱靶风险。通过nickase蛋白(cas9的d10a突变体)结合一对rna嵌合体可以大大降低潜在的脱靶风险。nickase，即缺口酶，它保留了cas9对rna嵌合体的识别能力，但只能对靶序列的一条核苷酸链进行切割，使基因组的dna双链产生一个缺口而得名。联合使用一对rna嵌合体分别结合于靶基因的正义联合反义链，通过nickase的作用分别在两条链上各产生一个缺口，形成带粘性末端的双链断裂，然后细胞通过nhej机制将双链修复并引入突变，即可与crispr-cas9一样实现基因敲除。但双rna嵌合体的使用让grna和靶序列的识别位点从20nt扩大到40nt，大大的减少了潜在的脱靶可能性。一方面，本发明的目的在于提供一种用于敲除ccr5基因的grna，所述grna的靶序列如seqidno:1-seqidno:114中的一种所示。另一方面，本发明提供一种用于敲除ccr5基因的表达载体，所述表达载体表达上述的grna。另一方面，本发明提供一种用于敲除ccr5基因的crispr-cas9系统，所述crispr-cas9系统包括上述的grna和cas9蛋白。另一方面，本发明提供一种用于敲除ccr5基因的试剂盒，所述试剂盒包括表达cas9蛋白和上述grna的载体。另一方面，本发明提供一种用于敲除ccr5基因的grna组合物，所述grna组合物由靶序列如seqidno:29所示的grna和靶序列如seqidno:98所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:35所示的grna和靶序列如seqidno:98所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:36所示的grna和靶序列如seqidno:98所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:37所示的grna和靶序列如seqidno:98所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:36所示的grna和靶序列如seqidno:99所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:53所示的grna和靶序列如seqidno:104所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:45所示的grna和靶序列如seqidno:104所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:48所示的grna和靶序列如seqidno:104所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:49所示的grna和靶序列如seqidno:104所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:46所示的grna和靶序列如seqidno:108所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:46所示的grna和靶序列如seqidno:109所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:46所示的grna和靶序列如seqidno:110所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:46所示的grna和靶序列如seqidno:104所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:53所示的grna和靶序列如seqidno:109所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:53所示的grna和靶序列如seqidno:110所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:53所示的grna和靶序列如seqidno:113所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:54所示的grna和靶序列如seqidno:109所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:54所示的grna和靶序列如seqidno:110所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:54所示的grna和靶序列如seqidno:113所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:55所示的grna和靶序列如seqidno:109所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:58所示的grna和靶序列如seqidno:110所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:62所示的grna和靶序列如seqidno:113所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:60所示的grna和靶序列如seqidno:113所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:52所示的grna和靶序列如seqidno:113所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:115所示的grna和靶序列如seqidno:101所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:115所示的grna和靶序列如seqidno:102所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:115所示的grna和靶序列如seqidno:104所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:115所示的grna和靶序列如seqidno:105所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:67所示的grna和靶序列如seqidno:114所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:25所示的grna和靶序列如seqidno:93所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:116所示的grna和靶序列如seqidno:96所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:116所示的grna和靶序列如seqidno:97所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:116所示的grna和靶序列如seqidno:100所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:117所示的grna和靶序列如seqidno:96所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:117所示的grna和靶序列如seqidno:97所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:117所示的grna和靶序列如seqidno:100所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:118所示的grna和靶序列如seqidno:119所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:120所示的grna和靶序列如seqidno:121所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:122所示的grna和靶序列如seqidno:98所示的grna组成，或由靶序列如seqidno:49所示的grna和靶序列如seqidno:123所示的grna组成。另一方面，本发明提供一种用于敲除ccr5基因的crispr-nickase系统，所述crispr-nickase系统包括上述所述的一种grna组合物和nickase蛋白。nickase，即缺口酶，它保留了cas9对rna嵌合体的识别能力，但只能对靶序列的一条核苷酸链进行切割，使基因组的dna双链产生一个缺口而得名。另一方面，本发明提供一种用于敲除ccr5基因的表达载体，所述表达载体表达上述所述的一种grna组合物。另一方面，本发明提供一种用于敲除ccr5基因的试剂盒，所述试剂盒包括表达nickase蛋白和上述所述的一种grna组合物的载体。另一方面，本发明提供一种grna在制备用于预防或治疗hiv感染的药物中的用途。另一方面，本发明提供一种grna组合物在制备用于预防或治疗hiv感染的药物中的用途。本发明的有益效果在于：本发明筛选出切割效率高的靶位点以及设计、制备出特异靶向目标基因的grna，通过crispr-cas9技术有效敲除ccr5基因，以及通过crispr-nickase基因编辑技术，敲除细胞表面的hiv病毒辅助受体ccr5，在有效进行ccr5基因敲除的前提下大大减少脱靶效率，提高临床使用的可行性，降低安全风险。附图说明图1为本发明所述用于敲除ccr5基因的crispr-nickase系统的作用原理示意图；图2为本发明实施例1所述px458-grna质粒图谱；图3为本发明实施例1所述crispr-cas9grna筛选t7核酸内切酶1酶切检测电泳图；图4为本发明实施例2所述lentispcas9nd10a-blast载体的质粒图谱；图5为本发明实施例2所述crispr-nickasegrna组合筛选t7核酸内切酶1酶切检测电泳图；图6为本发明实施例3所述px461载体的质粒图谱；图7为本发明实施例3所述crispr-nickasegrna组合筛选t7核酸内切酶1酶切检测电泳图；图8为本发明实施例4中seqidno:36对应的单菌落随机挑选54个进行测序后的结果；图9为本发明实施例4中seqidno:53对应的单菌落随机挑选57个进行测序后的结果；图10为本发明实施例4中grna组合seqidno:120和seqidno:121对应的单菌落随机挑选35个进行测序后的结果；图11为本发明实施例5中杂交结果。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例中使用到的实验材料包含：商品化的crispr-cas9载体，如px458；crispr-nickase载体，如lenticas9n(d10a)-blast、px461；hek293t细胞；hepg2细胞；大肠杆菌感受态细胞top10。本发明所述用于敲除ccr5基因的crispr-nickase系统的作用原理示意图如图1所示。实施例1grna初步筛选1、grna准备(1)根据ccr5基因的序列(包括外显子和与外显子比邻的内含子序列)设计20nt的grna序列；(2)分别合成grna正义链和反义链(正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤g，则在正义链的5’-端加caccg；在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤g，则在反义链的3’-端加c)；(3)将上述grna正义链和反义链混合，90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理，合成带粘性末端的双链grna。2、载体准备(1)px458质粒扩增和提取，并测定质粒浓度；(2)采用限制性内切酶bbsi对px458进行酶切，37℃酶切1h后加loadingbuffer终止反应。(3)琼脂糖凝胶电泳回收线性化质粒px458，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。3、连接转化(1)将切胶回收的线性化px458载体与退火后的grna双链进行连接反应，连接成功的px458-grna的质粒图谱如图2所示；(2)热击法转化大肠杆菌感受态细胞top10，转化后向每个离心管加入无菌的lb液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。(3)将复苏后的top10细胞涂布lb固体平板(amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到lb液体培养基(amp+)中扩大培养。(5)使用引物seqf(5’-atttttgtgatgctcgtcag-3’)(seqinno:124)，对上述菌液分别测序；(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。4、细胞转染(1)hek293t和hepg2细胞铺板；(2)采用lipofectamine3000试剂盒将3(6)中提取的质粒分别转染hek293t或hepg2细胞；特别注意的是，hek293t细胞ccr5基因的其中一个等位基因在δ32区存在突变，故对δ32区内的grna的突变效率分析不宜采用hek293t细胞，本方案中，我们对δ32区内的grna的突变效率分析使用hepg2细胞。转染方法同hek293t。(3)转染后的细胞培养48小时，收集细胞。5、t7e1酶切分析突变效率(1)将上述4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；(2)分别在grna结合位点上下游设计pcr引物,如表1所示，将ccr5基因分成5个区，每个区内共用一对引物，其中t4区因跨越δ32区，故又细分为p1区位于δ32区5’-端，p1区位于δ32区3’-端，t4-3147-l和t4-3923-r覆盖δ32区；表1t7e1酶切分析引物列表(3)分别使用pcr法扩增带有靶位点的目的片段；(4)纯化回收pcr产物，并测定产物浓度；(5)将上述纯化的pcr产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；(6)上述每管退火产物分别加入t7核酸内切酶1(t7e1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照组(不加t7e1，用ddh2o代替)，37℃酶切1h。(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，如图3：(a)(b)(c)为t1区的检测结果；(d)(e)为t2区的检测结果；(f)(g)(h)为t3区的检测结果；(i)(j)(k)(l)为t4区的检测结果；(m)(n)(o)为t5区的检测结果。其中，(l)显示的是覆盖δ32区的检测结果，该区以hepg2为检测细胞系，m表示dna分子量对照品marker，图3使用的是takara公司的dl1,000dnamarker。图3中有下划线标记的泳道为t7e1酶切效率比较高的片段，说明该泳道所对应的grna对ccr5基因的切割效率较高。根据t7e1酶切的结果，选择切割效率高(即电泳图中酶切效果较明显)的grna(有下划线标记的)，作为候选grna，进行下一步筛选。上述候选的grna，如图3所示，分别为f5、f6、f7、f8、f9、f14、f16、f17、f19、f20、f23、f25、f26、f27、f29、f32、f33、f35、f38、f42、f43、f44、f46、f52、f55、f57、f59、f60、f69、f70、f71、f73、f74、f75、f80、f85、f86、f87、f88、f94、f95、f96、f99、f100、f103、f104、f105、f106、f107、f109、f110、f111、f112、f113、f114、f115、f116、f117、f119、f120、f121、f122、f123、f125、f126、f127、f128、f129、f130、f131、f132、r1、r2、r3、r8、r9、r10、r12、r13、r17、r26、r27、r38、r39、r40、r42、r44、r45、r46、r48、r49、r50、r51、r53、r68、r69、r70、r74、r80、r85、r90、r92、r95、r96、r97、r98、r99、r101、r102、r103、r104、r110、r112、r122，对应为本发明所述seqidno:1-seqidno:114。实施例2grna组合筛选1、含grna的重组片段准备(1)选取上述经t7e1分析突变效率较高的grna，在其结合的靶序列的dna互补链上相距200bp以内选取配对的grna，配对组合如下表：)表2grna配对组合(2)选择实施例1中构建的px458-grna质粒(grna为seqidno:1-seqidno:115中的任意一个)为模板，用引物lenti-u6-l(5’-gtacgggccagatatacgcgtcacctctgacttgagcgtc-3’)(seqinno:139)和引物lenti-grna-r(5’-caataatcaatgtcaacgcgtctagagccatttgtctgcag-3’)(seqinno:140)分别进行pcr扩增，纯化回收pcr片段并测定浓度；2、载体准备(1)扩增并提取质粒lentispcas9nd10a-blast(图4)；(2)以限制性内切酶mlui-hf对lentispcas9nd10a-blast进行酶切，37℃酶切2h后，65℃失活20min，得到线性化的lentispcas9nd10a-blast；3、重组反应(1)将线性化的lentispcas9nd10a-blast和1(2)中得到的pcr产物进行重组；(2)重组反应产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞top10，转化后向每个离心管加入无菌的lb液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。(3)将复苏后的top10细胞涂布lb固体平板(amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到lb液体培养基(amp)中扩大培养。(5)使用引物lentid10a-f(5’-cagtacaatctgctctgatg-3’)(seqinno:141)，对上述菌液分别测序；(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。4、细胞转染(1)细胞铺板；(2)采用lipofectamine3000试剂盒将3(6)中提取的质粒按表2配对方案分别共转染hek293t细胞或hepg2细胞；特别注意的是，hek293t细胞ccr5基因的其中一个等位基因在δ32区存在突变，故对δ32区内的grna的突变效率分析不宜采用hek293t细胞，本方案中，我们对δ32区内的grna的突变效率分析使用hepg2细胞。转染方法同hek293t。(3)转染后的细胞培养48小时，收集细胞。5、t7e1酶切分析突变效率(1)将上述4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；(2)分别在grna结合位点上下游设计pcr引物(如表1)；(3)分别使用pcr法扩增带有靶位点的目的片段；(4)纯化回收pcr产物，并测定产物浓度；(5)将上述纯化的pcr产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；(6)上述每管退火产物分别加入t7核酸内切酶1(t7e1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照组(不加t7e1，用ddh2o代替)，37℃酶切1h。(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。如图5所示，(a)(b)(c)(d)四个电泳图均为grna配对组合对ccr5基因的突变效率的检测结果，其中(a)(d)所采用的细胞系为hepg2，(b)(c)所采用的细胞系为293t，电泳通道以实验所用的各grna组合为命名，×代表该样品经过t7e1酶切处理，m表示dna分子量对照品marker，图5使用的marker是从康为世纪公司采购的100bpladder。由图可见本发明所选的grna配对组合对ccr5基因基本都具有切割效率，切割效率较高(即电泳图中酶切效果较明显)的grna由下划线标记。实施例3grna组合筛选1、grna组合的准备(1)选取实施例1中经t7e1分析突变效率较高的grna，在其结合的靶序列的dna互补链上相距200bp以内选取配对的grna，配对组合如表2所示；表3grna配对组合(2)从实施例1的1(2)所合成的grna正义链和反义链中选出上述配对所需的片段，按照实施例1的1(3)的方法退火合成带粘性末端的双链grna。2、载体准备(1)px461质粒(如图6)扩增和提取，并测定质粒浓度；(2)采用限制性内切酶bbsi对px461进行酶切，37℃酶切1h后加loadingbuffer终止反应。(3)琼脂糖凝胶电泳回收线性化质粒px461，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。3、连接转化(1)将切胶回收的线性化px461载体与退火后的grna双链进行连接反应；(2)热击法转化大肠杆菌感受态细胞top10，转化后向每个离心管加入无菌的lb液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。(3)将复苏后的top10细胞涂布lb固体平板(amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到lb液体培养基(amp+)中扩大培养。(5)使用引物seqf(5’-atttttgtgatgctcgtcag-3’)，对上述菌液分别测序；(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。4、细胞转染(1)hek293t细胞铺板；(2)采用lipofectamine3000试剂盒将3(6)中提取的质粒分别转染hek293t细胞；(3)转染后的细胞培养48小时，收集细胞。5、t7e1酶切分析突变效率(1)将上述4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；(2)分别在grna结合位点上下游设计pcr引物,如表1中t4-p1区和t4-p2区引物所示；(3)分别使用pcr法扩增带有靶位点的目的片段；(4)纯化回收pcr产物，并测定产物浓度；(5)将上述纯化的pcr产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；(6)上述每管退火产物分别加入t7核酸内切酶1(t7e1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照组(不加t7e1，用ddh2o代替)，37℃酶切1h。(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，如图7所示。图7为grna配对组合对ccr5基因的突变效率的检测结果，电泳通道以实验所用的各grna组合为命名，×代表该样品经过t7e1酶切处理，p1-mock和p1-ck表示以t4-p1区引物进行pcr所得的mock组和空白对照组，p2-mock和p2-ck表示以t4-p2区引物进行pcr所得的mock组和空白对照组。由图可见本发明所选的grna配对组合对ccr5基因基本都具有切割效率，其中grna组合seqidno:116和seqidno:97，seqidno:116和seqidno:100，seqidno:117和seqidno:100，seqidno:120和seqidno:121，seqidno:122和seqidno:99，seqidno:49和seqidno:123(分别对应泳道116+97、116+100、117+100、120+121、122+98、49+123)切割效率较高。从中选择一对grna组合，进一步采用sanger测序法分析其对ccr5基因的突变效率和突变类型。实施例4测序分析ccr5基因突变效率和突变类型在实施例1和实施例3筛选出来的切割效果较优的grna和grna组合中随机选取2个grna和一组grna组合，采用crispr-cas9基因编辑系统，靶向突变ccr5基因，并用sanger测序的方法进一步确认对ccr5基因的突变效率和突变类型。1、将实施例1和实施例3中步骤5(4)所得的纯化后的pcr产物，测定浓度备用；2、选用康为世纪masterpcrmix给pcr产物3’-末端加一个腺嘌呤(a)：取2.1中的pcr产物2μg按照1:1(v:v)比例与masterpcrmix混合，72℃反应30min；3、用1％琼脂糖凝胶电泳2.2中的反应产物，切胶回收目的片段并测定回收产物浓度；4、用takarapmdtm18-tvectorcloningkit进行连接反应：按下表配制反应体系，16℃反应30min；表4连接pmdtm18-t载体的反应体系ddh2o补齐至10μlpmd18-tvector(5×)1μl(10ng)目的片段0.1pmol～0.3pmolsolutioni5μl5、上述连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞top10，转化后向每个离心管加入无菌的lb液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏；6、将复苏后的top10细胞涂布lb固体平板(amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h；7、随机挑取平板上长出来的单菌落，进行sanger测序。本实验选取seqidno:36、seqidno:53，以及grna组合seqidno:120和seqidno:121，分别进行分析，结果如下：(1)seqidno:36对应的单菌落随机挑选54个进行测序，其中无效测序1个(t载自连)，发生突变的24个，即突变效率为45.3％，突变类型如图8所示；(2)seqidno:53对应的单菌落随机挑选57个进行测序，其中无效测序7个(t载自连)，发生突变的31个，即突变效率为62％，突变类型如图9所示；(3)grna组合seqidno:120和seqidno:121对应的单菌落随机挑选35个进行测序，其中无效测序1个(t载自连)，发生突变的7个，即突变效率为20.59％，突变类型如图10所示。图8、图9、图10中，wildtype表示野生型(即mock组)的grna结合位点附近的dna序列；左侧数字代表随机挑选的菌落编号；“-”表示碱基缺失，每一个“-”对应一个碱基；加粗的字母“n”为grna识别的靶序列；加粗并灰底的字母“ngg”表示pam序列；灰色字体并灰色背景的字母“n”表示碱基替换或插入碱基的突变类型。由图8、图9、图10分析可知，实施例1中筛选的grna(以seqidno:36、seqidno:53为例)及实施例2、3中筛选的grna组合(以grna组合seqidno:120和seqidno:121为例)，均能对ccr5基因进行有效突变。实施例5蛋白水平分析ccr5敲除效率1、总蛋白抽提(1)按1ml裂解液加10μlpmsf(100mm)和10μlcocktail，摇匀置于冰上(pmsf要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。(2)每管细胞加100μl含pmsf和的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解要经常来回摇动。(3)裂解完后于4℃下14000rpm离心5min。(提前开离心机预冷)。(4)将离心后的上清分装转移倒干净的离心管中放于-80℃保存备用。2、蛋白样品初步定量采用蛋白质定量的经典方法bca法，测定上述抽提的各组细胞样品的蛋白质浓度。将各组样品的蛋白质浓度调整成一致。将调整好的样品和5×上样缓冲液按4：1混合，煮沸10min，缓慢恢复室温后，稍离心，放于-20℃保存备用。3、sds-page电泳，各样品上样体积保持一致，分离胶浓度10％，80v恒压电泳至溴酚蓝进入分离胶后，120v恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部停止电泳。4、蛋白质转移(1)pvdf膜甲醇预处理3～5秒，放至转膜缓冲液浸润半小时。(2)取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层，滤纸，凝胶，pvdf膜，滤纸，凝胶转印堆积层这样的“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除。(3)按正负极方向放置转印夹。(4)低温条件下，100v恒压根据蛋白分子量每1kda转膜1分钟来进行转膜。5、免疫印记(1)取出杂交膜，tbst漂洗5min，1次。(2)5％脱脂奶粉溶液室温封闭1小时。(3)tbst洗膜10min，1次。(4)用一抗稀释液，在4℃孵育过夜(所用的一抗为proteintech公司生产的ccr5抗体，稀释倍数1：1000)。(5)tbst洗膜10min，4次。(6)用二抗稀释液37℃孵育1h(所用的二抗为southernbiotech公司生产的goatanti-rabbitigg(h+l),mouse/humanads-hrp，稀释倍数1：20000)。(7)tbst洗膜10min，4次。(8)将杂交膜置于一透明塑料板上，注意不要让膜干燥。(9)用一干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。(10)用试剂盒提供的滤纸吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒，显影。6、杂交结果见图11，灰度分析结果见表5。其中以gapdh基因作为内参。表5grna和grna组合物对ccr5基因的敲除效率分析综合图11的杂交结果，以及表5的灰度值分析结果，可见实施例1中筛选的grna(以seqidno:36、seqidno:53为例)及实施例2、3中筛选的grna组合(以grna组合seqidno:120和seqidno:121为例)，均能对ccr5基因进行有效敲除。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质。序列表<110>广东赤萌医疗科技有限公司<120>一种用于敲除ccr5基因的grna、表达载体、敲除系统、试剂盒<160>141<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gaaaatccccactaagatcc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2aaaatccccactaagatcct20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3atcctgggtccagaaaaaga20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tcctgggtccagaaaaagat20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gttaaaactctttagacaac20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ttgggtggtgagcatctgtg20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7gggtggtgagcatctgtgtg20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8ggtggtgagcatctgtgtgg20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tgagcatctgtgtgggggtt20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10gagcatctgtgtgggggttg20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tgtgggggttggggtgggat20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12tgggggttggggtgggatag20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13ttggggtgggataggg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