用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物、检测方法及试剂盒。
背景技术：
：猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)为圆环病毒科圆环病毒属的一种小而无囊膜、二十面体对称、环状、共价闭合的单股dna病毒。病毒粒子直径平均为17nm，以滚环方式进行复制，是目前发现的最小的无囊膜dna病毒。brain、allan等认为可根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列可将猪圆环病毒分成两种基因型，即猪圆环病毒1型(pcv1)和猪圆环病毒2型(pcv2)。pcv1于1974年首次在pk细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。pcv2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(porcinecircovirusassociateddiseases，pcvad)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征(pmws)、猪皮炎肾病综合征(pdns)、猪呼吸道综合征(prdc)、母猪繁殖障碍症、增生性肠炎、坏死性间质性肺炎、仔猪先天性震颤等，表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。近来，一种新型的猪圆环病毒3型病毒在美国首次被报道，该病毒基因组全长2.0kb，其基因编码两个主要蛋白：cap蛋白和rep蛋白，两者在核酸链上处于相反方向，其能引起猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心脏和多系统炎症等症状。目前检测pcv的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及pcr检测等。但病毒分离、血清学检测方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。而pcr检测的方法主要以某一病毒类型的单一检测为主，不能进行多种病毒类型的联合pcr检测，并且检测灵敏性与特异性也参差不齐。由于pcv2和pcv3能引发猪圆环病毒相关疾病，若能建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的pcv2和pcv3联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。技术实现要素：为解决以上问题，本发明提供用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物、检测方法及试剂盒，建立一种能够同时鉴别诊断pcv2和pcv3病毒的双重pcr检测方法，且具有很高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。本发明第一方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物，所述引物根据检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的高度保守的特异性序列设计双重pcr引物，其中，猪圆环病毒2型的检测引物，由seqidno：3所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：4所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环病毒3型的检测引物，由seqidno：11所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：12所示的核苷酸序列的反向引物组成。上述的检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。本发明第二方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品制备基因组总dna；2)以制备的基因组dna为模板，利用如权利要求1所述的双重pcr引物，在同一反应体系中进行双重pcr扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。在本发明一实施例中，所述用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr反应体系总体积为50μl，包括：1)10μm的seqidno：3、seqidno：4、seqidno：11、seqidno：12所示核苷酸序列各1μl；2)10×expcrbμffer5.0μl；3)dntpmixtμre4.0μl；4)extaqdna聚合酶1.0μl；5)rnasefreeddh2032.0μl；6)待测样品的dna模板4μl。在本发明一实施例中，所述用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr反应条件包括：94℃预变性4min后进入循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环结束后；72℃终延伸10min。在本发明一实施例中，所述的用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr检测方法，其检测灵敏度可达102拷贝/μl。本发明第三方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr检测试剂盒，包括如本发明第一方面所述的检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物，还包括10×pcrbuffer、dntp、mgcl2、taq酶、阳性质控品、阴性质控品。在本发明一实施例中，所述的用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr检测试剂盒可特异性检测鉴定猪圆环病毒2型和圆环病毒3型，不能检测出猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪蓝耳病病毒、猪三角冠状病毒中的一种或多种。本发明第四方面提供一种如本发明第一方面所述的双重pcr引物、如本发明第二方面所述的双重pcr检测方法或如本发明第三方面所述的双重pcr检测试剂盒在猪圆环病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。附图说明图1为本发明实施例提供的双重pcr检测的引物筛选电泳图，其中，m为dl2000dnamarks，1-9分别为阴性对照、pcv2-2-f/r与pcv3-4-f/r、pcv2-1-f/r与pcv3-4-f/r、pcv2-2-f/r与pcv3-3-f/r、pcv2-2-f/r与pcv3-5-f/r、pcv2-3-f/r与pcv3-4-f/r、pcv2-3-f/r与pcv3-5-f/r、pcv2-2-f/r与pcv3-1-f/r、pcv2-2-f/r与pcv3-2-f/r、pcv2-2-f/r与pcv3-6-f/r；图2为本发明实施例提供的双重pcr检测的引物浓度优化电泳图，其中，m为dl2000dnamarks，1为阴性对照，2-6为pcv2与pcv3引物的加入量，其加入体积分别为0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl、1.2μl；图3为为本发明实施例提供的双重pcr检测的退火温度优化电泳图，其中，m为dl2000dnamarks，1为阴性对照，2-9为不同退火温度，分别为60.1℃、59.3℃、58.0℃、56.0℃、53.5℃、51.6℃、50.3℃、49.6℃；图4为本发明实施例提供的双重pcr检测的特异性试验的电泳图，其中泳道2为猪圆环病毒2型感染的电泳结果，泳道3为猪圆环病毒3型感染的电泳结果，泳道4为猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型混合感染的电泳结果，5、6、7、8、9分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪塞内加谷病毒、猪蓝耳病病毒、猪丁型冠状病毒的电泳结果，显示未检出；图5为本发明实施例提供的双重pcr检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-10分别为109拷贝/μl、108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl。具体实施方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。实施例1猪圆环病毒2型和3型双重pcr方法特异性引物筛选及体系优化1)猪圆环病毒2型和3型双重pcr引物设计根据genebank公布的猪圆环病毒2型(porcinecircovirus2)和猪圆环病3型(porcinecircovirus3)两种病原菌基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列利用primer5.0软件设计了特异性引物。引物均在北京睿博兴科生物技术有限公司合成，具体序列见表1：表1针对猪圆环病毒2型和猪圆环病3型的特异性引物：2)猪圆环病毒2型和3型双重pcr的反应体系及反应条件猪圆环病毒2型和3型双重pcr的反应体系见表2：表2猪圆环病毒2型和3型双重pcr的反应体系反应试剂加入体积10×pcrbufferpcr扩增反应液5.0μldntpmixture4.0μl10μm猪圆环病毒2型和3型引物各1.0μlpcr扩增酶1.0μl核酸模板(猪圆环病毒2型和3型)各2.0μl补水至50μl反应条件：94℃预变性4min后进入循环，94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：如图1所示，pcv2-2-f/r与pcv3-3-f/r特异性条带较亮、清晰，因此，筛选pcv2-2-f/r与pcv3-3-f/r为猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重pcr鉴定引物。3)猪圆环病毒2型和3型双重pcr的引物浓度优化对筛选所得的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重pcr引物pcv2-2-f/r与pcv3-3-f/r做引物浓度优化实验，分别往上述pcr反应体系加入10μm猪圆环病毒2型和3型引物各为0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl、1.2μl，对应的引物浓度为0.08μmol/l、0.12μmol/l、0.16μmol/l、0.2μmol/l和0.24μmol/l，按上述pcr反应条件进行扩增，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图2所示，在猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型引物量分别为1.0μl时，条带较亮、清晰，确定双重pcr各引物加入量分别为1.0μl，即引物浓度为0.2μmol/l为最优。4)猪圆环病毒2型和3型双重pcr的退火温度优化根据引物设计时primer5.0给出的参考值，将退火温度梯度设定为49.6℃、50.3℃、51.6℃、53.5℃、56.0℃、58.0℃、59.3℃、60.1℃这8个梯度分别于cdna模板进行pcr扩增。结果：如图3所示，在退火温度为56.0℃时，条带较亮、清晰，因此，最佳退火温度为56.0℃。实施例2本发明试剂盒的性能验证1)特异性试验采用建立的多重pcr方法对猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪塞内加谷病毒(svv)、猪蓝耳病病毒(prrsv)、猪丁型冠状病毒(pdcov)进行扩增，并选择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。结果如图4所示，猪圆环病毒2型的目的片段大小为511bp；猪圆环病毒3型的目的片段大小为701bp；而猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型混合感染目的片段大小有两条，分别为511bp和701bp；tgev、pedv、svv、prrsv、pdcov病毒均未见特异性条带扩增。2)敏感性试验将猪圆环病毒2型扩增出的511bp片段和猪圆环病毒3型基因连接至pmd19-t载体，转化大肠杆菌dh5a，挑取阳性菌落培养，使用质粒纯化试剂盒(plasmidminikitⅰ,购自omega公司)制备纯化的质粒并进行核酸定量，计算出拷贝数，按照1010拷贝/μl～101拷贝/μl的浓度进行10倍梯度稀释，分别取2μl各稀释度的质粒dna作为模板，按步骤3)所述优化好的反应体系及反应条件进行双重pcr的扩增灵敏度检测。结果可知该双重pcr方法最低可检测到100个拷贝的病毒dna。结果如图5所示，以pcv2和pcv3的混合质粒10倍倍比稀释后作为模板，用建立好的多重pcr方法进行扩增，扩增结果显示pcv2最低检测量为3.192×102拷贝/μl，pcv3最低检测量为2.667×102拷贝/μl。3)多重pcr重复性试验利用建立的多重pcr，用优化后条件每隔一周重复检测一次，连续检测3次，以检测结果的可靠性。以pcv2和pcv3的混合质粒108～101拷贝/μl为模板，利用建立好的多重pcr方法每隔1周扩增一次，连续扩增4周。结果表明4次扩增结果一样，表明该多重pcr方法具有较高的可重复性。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>华南农业大学<120>用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物、检测方法及试剂盒<130>2017<160>18<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgaataatccttccgaagac21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtaagttgccttctttactgc21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcagtaaagaaggcaacttac21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcagttgaggagtaccattcc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcagcagcaacatgcccagc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctccatgtctttctttaccc20<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7taccagatcggatcttcaagc21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ctccatgtctttctttaccc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ctcggtgaagcgcttacccg20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aaccatcccaccaaggcccc20<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aatctattgtggagtgtggag21<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ccactcctccggtacaacatt21<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tagtattacccggcacctcggaac24<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gcaataattgtacacaagtgca22<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15aatgttgtaccggaggagtgg21<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16cttcaggacactcgtagcaccac23<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17tagtattacccggcacctcg20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gcccggcaccaaaatgagac20当前第1页12