解淀粉芽孢杆菌及培养芽孢和菌剂的制备方法与应用与流程

本发明涉及一种深海分离解淀粉芽孢杆菌的高密度培养及芽孢制剂制备与应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

芽孢杆菌(bacilussp.)在自然界中广泛存在，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。通过成功定殖至植物根际、体表或体内，芽孢杆菌与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，抑制植物病原菌，包括根部、叶部、枝干、花部和收获后果实等多种病害，是一种较理想的生防微生物(ongena,etal.,2008)。

至今发现bacilus属的拮抗细菌能产生100多种抗菌物质，大部分为肽类抗生素，分子量为300-3000da，它们可能含有l/d-氨基酸和非蛋白氨基酸，一般能抵抗蛋白酶的降解。其中分子量1000da左右的环肽或环脂肽，诸如iturins,surfactins,fengycins为芽孢杆菌主要产生种类。这些环脂肽类物质都由一个氨基酸环和一条脂肪链组成。对植物病原真菌有较强抗菌活性(lanzotti,etal.,2011)。很多研究表明，芽孢杆菌作为活体微生物制剂对植物病原菌进行生物防治时，其抗菌作用源于其产生的脂肽类抗生素。此外，芽孢杆菌的脂肽类物质不仅能直接发挥抗菌作用，还能激发宿主植物对植物病原真菌的防御机制，诱导植物体产生系统抗性(inducedsystemicresistance,isr)作用。而isr也是生防细菌重要的防病机制之一。研究发现豆类、西红柿等能够感应surfactins和fengycins类化合物，并且将后者作为信号激活其防御机制，即植物体产生了isr(ongena,etal.，2007)。

更有研究工作表明，脂肽还影响其产生菌的生态适应性-促进根部芽孢杆菌菌落的建立(使其在根部周围永久存在)。微生物产生三大类脂肽的作用表明，脂肽对于生防菌发挥防病促生作用非常重要，且往往是多种化合物协同发挥作用，包括抗菌、诱导植物抗性和帮助细菌在植物根际的定殖等。因此，生防菌如能同时作为植物根际促生菌((plantgrowth-promotingrhizobacterium,pgpr)，相较于用化学农药难以奏效土传病害的防治具有特别的优势。对土传病害的防治来说，能在根际生长的微生物才是理想的生防因子。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株深海分离的解淀粉芽孢杆菌及其高密度培养的制剂制备方法与应用。由该菌株在该方法培养下能够产生高密度芽孢，在代谢过程中产生少量fengycins类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的fengycins。由该解淀粉芽孢杆菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，具有成本低、生防高效、无残留、对人畜安全的特点。单独或与其他药剂复配或化肥包膜，通过喷施、灌根或施肥、追肥来防治植物真菌性病害，达到提高植物产量和提高品质的目的。

本发明的技术方案：一株深海分离的解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌(bacilusamyloliquefaciens)b10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为cctccno：m2017486。该菌株b10可以利用广泛的碳、氮源通过液体发酵产生芽孢，并在代谢过程中产生少量fengycins类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的fengycins(20-35mg/l)。

所述的解淀粉芽孢杆菌的高密度培养芽孢制剂制备方法，是通过以下步骤来完成：

(1)斜面菌体活化及种子准备

无菌操作接种b10菌株保藏菌种，划线于牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平皿，培养基组成以g/l计为：牛肉膏3，蛋白胨5，陈海水或人工海水1000，琼脂15-20，ph7.0-7.2；25-50℃培养24-48h；然后挑取单菌落划线接种牛肉膏蛋白胨斜面，25-50℃培养24-48h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，准备移种；准备如500ml三角摇瓶，装量100ml，培养基组成组以g/l计为：玉米面10-25，豆饼粉0.1–5，麸皮1-10，k2hpo40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，ph6.0-7.0；以体积比1-10％的接种量接入，摇床120-200rpm在25-50℃培养24-48h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，将摇瓶在80℃水浴中加热10min，准备移种；

(2)种子罐培养

于种子摇瓶选用3000ml三角瓶，装液量1000ml，以体积比1-10％接入上述种子，摇床120-200rpm在25-50℃培养24-48h，以此做种，以体积比1-10％接入种子罐培养，种子罐选10l、20l、30l、50l或100l,种子罐的装量体积比为60-70％；

培养基组成以g/l计为：玉米面10-25，豆饼粉0.1-5麸皮1-10，k2hpo40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，ph6.0-7.0，豆油3-5或泡敌0.1-0.5；

种子罐培养条件为：搅拌转速150-300rpm，通气量0.5-1m³/h,do保持30％以上，培养温度25-50℃，培养时间15-52h；

(3)发酵罐培养

种子培养液以体积比1-10％接入发酵罐中，选用1t、2t、5t或10t体积发酵罐，发酵罐的装量体积比为60-70％；

发酵罐培养基组成：发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/l计为：碳源10-25，氮源1-5,麸皮2-5，k2hpo40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，ph6.0-7.0，豆油3-5或泡敌0.1-0.5；

发酵罐培养条件为：搅拌转速≥150rpm，通气量1-2m³/h,do保持30％以上，培养温度25-50℃，培养时间15-52h；15h开始取发酵液镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，可即放罐结束培养；取样测定芽孢数量，测得发酵液芽孢数量达1×10⁹cfu/ml以上。

(4)芽孢收集及菌剂制备

将培养液泵入连续式离心机进行固液分离，获得芽孢，将芽孢与乳糖以质量比1:(1-3)的比例混合，在40-60℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过100目筛，按1:(1-10)的比例加入载体硅藻土、乳糖、淀粉、高岭土、轻质碳酸钙、膨润土、草炭土中的一种或多种；加入助剂包括润湿剂和分散剂，依照上述物料质量分别以1-3％的比例加入，其中润湿剂选自十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠中一种，分散剂选自羧甲基纤维素、多聚硫磷酸钠、黄原胶、morwetd-500中的一种或多种，混合后制成的制剂，芽孢含量达到1×10⁹cfu/ml以上。

所述的制备方法，其解淀粉芽孢杆菌液体发酵的碳源和氮源选择十分广泛，碳源选用玉米粉、麸皮、葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉中的一种或几种，氮源选用豆饼粉、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、玉米浆粉、花生饼粉中的一种或几种。

(5)产脂肽培养基发酵培养产生fengycins

将解淀粉芽孢杆菌芽孢接入下述产脂肽培养基中，培养基以g/l计为：蔗糖20，nh4no32，kh2po43，na2hpo41，mgso4·7h2o0.2，酵母膏0.2，cacl27μg,mnso4·4h2o10μg，ph7.0-7.2；培养温度28℃，时间48h。

fengycins检测：用0.5mol/lnaoh溶液将细菌培养液调节ph至8.0，4000rpm离心30min；取上清液，用6n盐酸调节上清液ph至2.0，静置于4℃冰箱中过夜；过夜后的发酵上清液于4000rpm离心30min，弃上清液取沉淀，将沉淀用ph为2.0的盐酸洗涤两次后，用甲醇多次萃取，萃取液在re52-99旋转蒸发仪中于35℃减压蒸干溶剂，得到脂肽粗提物。

将粗脂肽溶解于甲醇中，配制成1mg/ml甲醇溶液，采用反相高效液相色谱分析对比不同粗脂肽包含的物质产生的峰形差异，所用分析柱为acclaim120反相c18分析柱(4.6mm×250mm)，条件：进样量：10μl，检测波长：210nm，梯度洗脱：a相：甲醇，b相：0.05％三氟乙酸(tfa)水溶液，30min内：a：80％→100％，流速：1ml/min，温度：30℃(紫外检测波长220nm，高压液相色谱图如附图1所示)。从三次的独立重复试验中得出的数据计算图谱中fengycin类物质的峰面积(mau*min)，通过标准曲线计算出b10的发酵液中可提取的fengycin的含量。该活性脂肽产物对多种植物病原真菌有较强杀菌活性。

fengycin的标准曲线：将纯化之后的或标品fengycin配置成不同浓度的甲醇溶液，取10μl进行高压液相色谱的测定(紫外检测波长220nm)。将不同浓度的fengycin在高压液相色谱中的峰面积计算出来，然后绘制峰面积(mau*min)和进样量(μg)的线性图(如附图2所示)。

本发明的有益效果：

1.深海分离的解淀粉芽孢杆菌可以利用广泛的碳源和氮源经以发酵产生高密度的芽孢，罐发酵可以达到1×10⁹cfu/ml以上。

2.解淀粉芽孢杆菌代谢过程中产生少量fengycins类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的fengycins。该类化合物对多种植物病原菌具有较强杀菌活性，应用范围广，为该菌生物防治植物真菌病害的主要作用物质，同时具有对植物诱导抗性活性。

3.解淀粉芽孢杆菌芽孢制剂作为生物农药或生物肥料，单独或与其他药剂复配或化肥包膜，通过喷施、灌根或施肥、追肥来防治植物真菌性病害，达到提高植物产量和提高品质的目的。具有成本低、生防高效、无残留、对人畜安全的特点。所制备解淀粉芽孢杆菌制剂在防治植物土传病害和地上部分病害均可应用，部分病害选自枯萎病、黄萎病、立枯病、纹枯病、白粉病、霜霉病、炭疽病。

生物材料样品保藏

一株深海分离解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌(bacilusamyloliquefaciens)b10，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年9月11日，编号为cctccno：m2017486。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌b10脂肽粗提物中fengycins的hplc图谱；

图2为fengycin的标准曲线。

具体实施方式

实施例1：高密度深海解淀粉芽孢杆菌的培养

(1)斜面菌体活化及种子准备

无菌操作接种b10菌株保藏菌种，划线于牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平皿，培养基组成以g/l计为：牛肉膏3，蛋白胨5，陈海水或人工海水1000，琼脂18，ph7.0；28℃培养24h；然后挑取单菌落划线接种牛肉膏蛋白胨斜面，28℃培养24h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，准备移种；准备500ml三角摇瓶，装量100ml，培养基组成组以g/l计为：玉米面17，豆饼粉1,麸皮3.4，k2hpo40.5，碳酸钙0.7，ph6.7；以体积比8％的接种量接入，摇床180rpm在36℃培养24h以上，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，将摇瓶在80℃水浴中加热10min，准备移种；

(2)50l种子罐培养

种子摇瓶选用3000ml三角瓶，装液量1000ml，以体积比8％接入上述种子，摇床180rpm在36℃培养24h，以此做种，以体积比8％接入50l种子罐培养，种子罐的装量体积比为70％，即50l发酵罐装培养基35l(消后体积)；

培养基组成以g/l计为：玉米面17，豆饼粉1,麸皮3.4，k2hpo40.5，碳酸钙0.7，ph6.7，豆油5；

种子罐培养条件为：搅拌转速220rpm，通气量0.8m³/h,do保持30％以上，培养温度36℃，培养时间24h；

(3)1t发酵罐培养

种子培养液以体积比5％接入发酵罐中，选用1t体积发酵罐，发酵罐的装量体积比为70％，即1t发酵罐装培养基700l(消后体积)；

发酵罐培养基组成：发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/l计为：玉米面17，豆饼粉1,麸皮3.4，k2hpo40.5，碳酸钙0.7，ph6.7，泡敌0.15；

发酵罐培养条件为：搅拌转速180rpm，通气量1.5m³/h,do保持30％以上，培养温度36℃，培养时间28h；15h开始取发酵液镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，可即放罐结束培养；取样测定芽孢数量，测得发酵液芽孢数量达1×10⁹cfu/ml以上。

实施例2：芽孢杆菌芽孢制剂的制备

将培养液泵入连续式离心机15000rpm进行固液分离，获得芽孢，将芽孢与乳糖以质量比1:2的比例混合，在50℃干燥22h，粉碎机粉碎，过100目筛，加入载体(硅藻土、乳糖、淀粉、高岭土、轻质碳酸钙、膨润土、草炭土中的一种或多种)，在此实施例中为按芽孢和乳糖总量与载体质量比1:5的比例加入载体，载体为1:1质量比例的轻质碳酸钙和硅藻土；加入助剂包括润湿剂和分散剂(其中润湿剂选自十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠中一种或二种以上，分散剂选自羧甲基纤维素、多聚硫磷酸钠、黄原胶、morwetd-500中的一种或二种以上)，在此实施例中为依照上述加入载体后物料质量分别以2％的比例分别加入十二烷基磺酸钠和羧甲基纤维素，充分混合后制成的制剂，芽孢含量达到1×10¹⁰cfu/ml以上。

实施列3：解淀粉芽孢杆菌培养产生fengycins

(1)培养种子液：无菌操作接种b10菌株保藏菌种，划线于牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平皿，培养基组成以g/l计为：牛肉膏3，蛋白胨5，陈海水(或人工海水)1000，琼脂18，ph7.0；28℃培养24h；然后挑取单菌落划线接种牛肉膏蛋白胨斜面，28℃培养24h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，准备移种；准备500ml三角摇瓶，装量100ml，培养基组成组以g/l计为：玉米面17，豆饼粉1,麸皮3.4，k2hpo40.5，碳酸钙0.7，ph6.5；以体积比8％的接种量接入，摇床180rpm在36℃培养24h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，将摇瓶在80℃水浴中加热10min，准备移种；

(2)罐发酵培养：将培养好的种子液按体积比5％的接种量接种于内装6l灭菌(于121℃灭菌30min，冷却)发酵培养基(蔗糖2％，kh2po40.3％,na2hpo41％,nh4no30.2％,mgso4.7h2o0.02％,酵母粉0.02％,cacl20.7μg/100ml,mnso4.h2o1μg/100ml,初始ph7.0，余量为水)的10l发酵生物应器中，在罐温28±1℃下，罐压0.05mpa、通风量为6l/min、搅拌速度为200rpm，通气搅拌发酵48h即可放罐，此发酵液可用于提取粗脂肽。

(3)粗脂肽的提取：用质量浓度2％的naoh溶液调发酵液的ph至8.0，然后在常温下于4000rpm离心30min，除去菌体及其它固形物；所得到的发酵上清液用6n盐酸调ph至2.0，于4℃冰箱内放置过夜，次日于4000rpm离心30min，收集沉淀，并用ph2.0的稀盐酸反复洗涤沉淀三次，以除去表面残余上清。所得沉淀物用甲醇提取，反复提取三次后将提取液旋转蒸发除去甲醇，干燥后即得到粗脂肽。

(4)fengycin的测定：将粗脂肽溶解于甲醇中，配制成1mg/ml甲醇溶液，采用反相高效液相色谱分析对比不同粗脂肽包含的物质产生的峰形差异，所用分析柱为acclaim120反相c18分析柱(4.6mm×250mm)，条件：进样量：10μl，检测波长：210nm，梯度洗脱：a相：甲醇，b相：0.05％(v/v)tfa水溶液，30min内：a：80％→100％，流速：1ml/min，温度：30℃(紫外检测波长220nm，高压液相色谱图如附图1所示)。从三次的独立重复试验中得出的数据计算图谱中fengycin类物质的峰面积(mau*min)，通过标准曲线计算出b10的发酵液中可提取的fengycin的含量是29.14(±8.8)mg/l发酵液。

(5)fengycin的标准曲线：将纯化之后的或标品fengycin配置成不同浓度的甲醇溶液，取10微升进行高压液相色谱的测定(紫外检测波长220nm)。将不同浓度的fengycin在高压液相色谱中的峰面积计算出来，然后绘制峰面积(mau*min)和进样量(μg)的线性图(如附图2所示)。

(6)粗脂肽抗菌活性测定：配制1mg/ml的粗脂肽溶液(溶剂：ph＝8.5的nahco3溶液，)；ph＝8.5的nahco3溶液(对照)，加样量：50μl，至少3个重复。采用挖块法，将活化好的直径约为3mm的待测病原真菌至于psa平板中央，待其长至2cm大小时，在菌块周围放置牛津杯。28℃恒温培养2-6d，待有明显抑菌圈产生后，用游标卡尺测量产生的抑菌圈直径。测定得到部分有活性的结果如表1所示。

表1解淀粉芽孢杆菌产生粗脂肽的抗菌谱

附注：nd代表未测定

实施例4：解淀粉芽孢杆菌制剂的生物活性

1)对尖孢镰刀菌的抑菌效果通过生长速度法测定样品的菌丝生抑制率：通过在pda培养基中加入测试样品，测定样品(试验样品实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌b10芽孢制剂、对照组甲基托布津)对尖孢镰孢(黄瓜枯萎病)菌丝生长的抑制作用。试验样品解淀粉芽孢杆菌b10芽孢制剂为加入0.1％的吐温-80自来水配制，浓度为15.56×10⁴个孢子/ml、62.5×10⁴个孢子/ml、250×10⁴个孢子/ml，对照组甲基托布津的浓度均为400μg/ml、100μg/ml、25μg/ml。

在试验浓度下，解淀粉芽孢杆菌b10芽孢制剂对尖孢镰孢的菌丝生长表现出良好的抑制作用，结果见表2。

表2解淀粉芽孢杆菌b10对尖孢镰刀菌的抑菌效果

注：表中甲基托布津的浓度均为25μg/ml、100μg/ml、400μg/ml。

2)对水稻纹枯病的防治效果通过寄主植物培养方法测定：温室内培养水稻(水稻品种：空育131)长至2叶期，备用。准确称取制剂样品，加入0.1％的吐温-80自来水配制成13.3×10⁴个孢子/ml、40×10⁴个孢子/ml、120×10⁴个孢子/ml的药液用于水稻纹枯病活体苗杀菌活性研究。对照药剂井冈霉素的浓度为25mg/l。喷雾处理：喷雾器类型为立体作物喷雾机，喷雾压力为1.5kg/cm2，喷液量约为675l/hm2。将水稻纹枯病菌菌饼接种于稻苗基部，并在温室内保湿培养，5d后调查样品的杀菌活性。盆栽试验是根据对照的发病程度，采用目测方法，调查试验样品的杀菌活性，结果用100～0来表示，以“100”级代表无病，“0”级代表最严重的发病程度。

在试验浓度下，解淀粉芽孢杆菌b10芽孢制剂对水稻纹枯病有明显防治效果，见表3。

表3解淀粉芽孢杆菌b10对水稻纹枯病水稻纹枯病(rhizoctoniasolani)的防治效果

注：表中井冈霉素的浓度为25μg/ml。

实施例5：解淀粉芽孢杆菌制剂田间应用

实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌制剂对棉花真菌病害的防治

棉花品种：新陆中46，前茬作物为棉花，种植方式为膜下滴灌种植，一膜四行种植方式，亩株数为1.5-1.7万株，播种前，磷酸二铵35kg/亩，钾肥5kg/亩，2016年4月27日播种，棉花长势良好，栽培措施同常规技术一致。

试验设2个处理，1个药剂处理和1个空白对照，共设置3次重复，其中药剂处理面积3亩，对照面积3亩，随机区组排列。在棉花苗期，用解淀粉芽孢杆菌b10制剂1000倍液，于苗期2叶面喷施；以相邻不喷施该药剂处理的对照田3亩，同时调查其株高、苗期立枯病、枯黄萎病、果台数、发病情况及其他长势情况。

调查方法、药效计算方法

调查方法：在喷药5天后调查处理棉花苗期情况及在立枯病、枯黄萎病发病高峰时期，在处理与对照区域进行调查，即5月27日、6月3日、6月9日、8月25日各调查一次，每处理取三点调查方法，每点取100株。

为计算出药效，分别计算出个小区病情指数，并按照以下公式计算：

病株率(％)＝发病株数/调查总株数×100；

防治效果＝[(ck发病株数－处理发病株数)/ck发病株数]×100

对棉花真菌病害的防治情况

b10制剂1000倍液苗期喷施在低温冷害后，棉花恢复较快，长势优于对照。施用10天后对棉花株高、茎粗、根长进行的调查，结果处理株高较对照高3.24cm,茎粗较对照粗0.01cm,根长较对照高出0.46cm。对棉花立枯病、炭疽病及枯黄萎有良好的防效，如下表所示：

表4解淀粉芽孢杆菌b10对棉花立枯病、炭疽病及枯黄萎防效

从表4可知，b10制剂1000倍液对棉花立枯病防效为67.06％，对炭疽病防效为78.21％；对苗期枯黄萎病防效达62.03％。田间测产结果较对照增产2.31％。