多核苷酸改组方法与流程

文档序号：19157090发布日期：2019-11-16 00:57阅读：826来源：国知局

背景技术：

a.技术领域

蛋白质是高度通用的生物分子，其执行宽范围的功能，所述功能的范围从天然催化作用(酶)、表位识别(抗体)到结构性功能。酶以高速率执行非常特异性反应的能力使得它们越来越可用于各种领域，包括技术用途(造纸和纺织工业)、食品和饲料工业(奶制品、烘焙、酿造、果汁生产、淀粉加工)、有机合成工业、化妆品、医学和生物技术。就此而言，工业酶已经彻底改变了我们的日常生活。抗体结合特异性表位并且被开发成为诊断工具和治疗药物。结构性蛋白质在细胞或组织的结构中具有重要的功能。最熟知的实例是胶原蛋白，其丰富地存在于我们的骨骼和皮肤中。

自然界已经配置了蛋白质来执行其天然功能，这些天然功能通过达尔文进化来优化。然而，在蛋白质的天然功能与科学家和工程师所设想的应用之间大多数情况下存在着极大的矛盾。因此，天然蛋白质不得不被改造以引入新的或所需要的性质以用于各种各样的应用(lutz,2010)。用于蛋白质工程的稳健的和通用的技术因此在促进蛋白质用于市场的可能性方面具有至关重要的地位。

b.相关技术的描述

蛋白质工程领域在过去二十年中已经经历了极大的技术转变。实际上，体外蛋白质工程在实验室规模上模拟天然蛋白质进化动力。垂直进化或适应进化暗示在蛋白质编码序列中基因突变的积累，产生了具有改变的性质的蛋白质。此过程可以在体外通过定点诱变来进行以修饰所选择的氨基酸提高催化性质(例如，反应速率)或生物物理性质(例如，稳定性)(合理设计)。然而，定点诱变仅当三维结构和/或酶机制已知时才有意义，并且此信息经常是不可获得的。随着开发用于随机诱变的技术用于定向进化，此要求被避开了。有趣的是，证明随机诱变与定点诱变是互补的，因为经常选择到在离催化性氨基酸更远的位点处的非预期氨基酸中的突变体。

蛋白质进化新功能的另一主要机制受遗传片段交换(改组/水平转移)驱动(lutz和benkovic,2000)。这样，形成了具有新功能的完全改变的蛋白质。利用体外蛋白质工程仅可以将这种进化动力模拟到有限的程度。通过限制性内切/连接进行的结构域互换允许使用传统的分子克隆技术以合理的方式将来自不同来源的蛋白质编码片段进行重组。要求是缺少在此克隆过程中所使用的限制性位点的识别位点。当来自不同来源的多个片段被随机组装并且需要许多种不同的限制性内切酶时，此要求变得特别繁琐。dna改组是一种允许亲代序列的随机改组的方法，但该方法仅适用于密切相关的基因(>70％序列同一性，家族改组)。然而，具有低序列同一性的不相关基因的片段的无限制性改组具有以最破坏性的方式设计新蛋白质功能的可能性。技术上的难题已经阻碍了此领域中的进展。由于缺少基因片段之间的同源性，传统的重组是不可能的。已经报道采用两种方法(shiprec和itchy)来从关系遥远的序列形成杂合蛋白质(ostermeier等人，1999；sieber等人,2001；patrick和gerth,2014)。然而，两种方法限于由来源于两个亲代基因的两个片段的杂合体。scratchy是基于itchy的更复杂的方法，并且scope允许多个片段的重组，但那些片段仍然仅来源于两个亲代基因(kawarasaki等人，2003；o’maille等人,2002)。goldengate改组是一种允许以合理方式和随机方式两种方式改组来自亲代基因的片段的方法。不同亲代基因的片段之间的接头是在每个接头处所有亲代基因中存在的四个保守核苷酸。为了鉴定潜在的接头位点，需要这些基因之间具有足够高的同源性。goldengate改组依赖iis型限制性内切酶的独特特性，即，在识别位点外的裂解。这允许在识别位点位于片段的末端处时移除该识别位点。这种特性允许在一个试管中同时进行限制性内切/连接，用于无疤痕组装体中的多个基因片段的组装的一步反应(engler等人,2009)。不受限制地，将来自许多不同来源的大量不相关基因片段大规模改组以形成新型酶仍然是蛋白质工程领域中的空白。类似于随机诱变，预期不相关片段的随机改组将一般产生许多意想不到的新型的改良的嵌合蛋白质，所述嵌合蛋白质组合了以前不能合理想到的片段。

本发明提供了用于制备在用于生成产物多核苷酸的方法中使用的载体(称为tile载体，其特别适合用作编码蛋白质单元的多核苷酸的储备和/或供体载体)的有效方法，其中所述产物多核苷酸包含两个或更多个所述编码蛋白质单元的多核苷酸的组合。优选地，所述编码蛋白质单元的多核苷酸在所述产物多核苷酸内组合使得它们的序列整合在单一阅读框内。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种制备tile载体的方法，所述tile载体是包含选择性标记和编码多核苷酸的载体，其中所述编码多核苷酸的前面和后面紧接着iis型识别序列,其中所述前面的和后面的识别序列被相同的iis型限制性内切酶识别，但具有相反的方向。更具体地，所述前面的和后面的iis型识别序列的位置和方向提供了所述tile载体被相应的iis型限制性内切酶裂解，导致在其各个末端含有具有已知的方向和长度的突出端序列同时缺少所述前面的和后面的iis型识别序列的所述编码多核苷酸序列的释放。

本发明的第二个目的是提供使用如前面所述获得的tile载体连接两个或更多个编码多核苷酸以形成产物多核苷酸的方法。典型地，所述产物多核苷酸整合在载体中。

从下面给出的详述中本发明的应用性的更多范围将显而易见。然而，应该理解的是，详述和具体实施例，在显示本发明的优选实施方案的同时，仅通过说明的方式给出，因为从此详述中在本发明的精神和范围内的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。要理解的是，前面的一般描述和下面的详述两者都仅是示例性的和解释性的，不是对如权利要求所保护的本发明的限制。

本发明可以进一步总结为下面的叙述。

1.一种制备tile载体(24)的方法，所述tile载体(24)包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着iis型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10),其中所述前面的和后面的识别序列被相同的iis型限制性内切酶识别，但具有相反的方向，

其中所述tile载体(24)可以使用识别所述前面的和后面的识别位点的iis型限制性内切酶裂解，导致在其各末端具有已知的突出端序列的所述编码多核苷酸序列(10)的释放，所述释放的编码多核苷酸序列缺少所述前面的和后面的iis型识别序列；

所述方法包括下列步骤：

a)提供初始编码多核苷酸(8)并用第一末端序列(16)和第二末端序列(17)延伸所述多核苷酸的各个末端，其中所述末端序列中每一个包含下列元件：

i.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)邻接所述初始编码多核苷酸的各个末端并在所述初始编码多核苷酸的开放阅读框的框内加入；

ii.邻接所述编码延伸序列的第一iis型识别序列(12)，其中所述第一识别序列被定向成使得识别所述第一识别位点的iis型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列(11)内裂解从而产生突出端，并且其中所述第一末端序列和第二末端序列的所述第一iis型识别序列(12)被相同的iis型酶识别，但具有相反的方向；

iii.邻接所述第一iis型识别序列或在所述第一iis型识别序列内的间隔区序列(13)；

iv.邻接所述间隔区序列的第二iis型识别序列(14)，其中所述第二识别序列被定向成使得识别所述第二识别序列的iis型限制性内切酶能够裂解所述间隔区序列从而产生间隔区突出端，并且其中所述第二iis型识别序列不被识别所述第一iis型识别序列的iis型酶识别；

v.尾序列(15)，所述尾序列(15)具有足够的长度以便允许iis型限制性内切酶与所述第二识别序列结合；

b)提供接收载体(1)，所述接收载体(1)包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含定位于第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)之间的选择性标记(6)，使得所述载体能够使用识别所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)的iis型识别酶裂解，从而形成：

■填充序列(2)，所述填充序列(2)包含所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)；和

■选择性载体片段(7)，所述选择性载体片段(7)包含所述选择性标记(6)但缺少所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)并且具有非互补的末端突出端，其中一个突出端与在使用识别所述第一末端序列(16)的所述第二iis型识别序列(14)的iis型识别酶裂解所述第一末端序列(16)后获得的间隔区突出端互补，而另一突出端序列与通过使用识别所述第二末端序列的所述第二iis型识别序列(14)的iis型限制性内切酶裂解所述第二末端序列(17)获得的间隔区突出端互补；

c)孵育混合物，其中所述混合物包含：

i.步骤(a)的延伸的初始编码多核苷酸；

ii.步骤(b)的接收载体；

iii.识别所述延伸的初始编码多核苷酸的末端序列的所述第二iis型识别序列(14)的iis型限制性内切酶；

iv.识别所述接收载体的所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)的iis型限制性内切酶；

v.dna连接酶。

2.根据叙述1所述的方法，其中所述接收载体的所述填充片段(2)包含反向选择性标记(5)。

3.根据叙述1或2所述的方法，其中延伸的多核苷酸的第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的所述第二iis型识别序列(14)被相同的iis型酶识别。

4.根据叙述3所述的方法，其中所述接收载体的所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)被相同的iis型酶识别，但具有相反的方向。

5.根据叙述4所述的方法，其中所述接收载体的所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)与所述延伸的初始编码多核苷酸的所述第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的第二iis型识别序列(14)一样被相同的iis型酶识别。

6.根据叙述5所述的方法，其中所述接收载体(1)包含两个多克隆位点,第一个多克隆位点包含一系列多个不同的iis型识别序列，并且第二个多克隆位点包含与所述第一个多克隆位点中的那些一样被相同的iis型酶识别的方向相反的iis型识别序列，其中所述多克隆位点包含所述接收载体(1)的所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)，所述接收载体(1)的所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)与所述延伸的初始编码多核苷酸的所述第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的第二iis型识别序列(14)一样被相同的iis型酶识别。

7.根据叙述1-6中任一项所述的方法，其中用所述末端序列(16,17)延伸的所述初始编码多核苷酸(8)使用dna合成法制备。

8.根据叙述1-6中任一项所述的方法，其中所述初始编码多核苷酸(8)利用所述末端序列(16,17)使用聚合酶链式反应(pcr)延伸，其中所述pcr涉及使用在所述初始编码多核苷酸的各个末端上退火的加尾的正向引物和反向引物，其中所述正向引物的尾部添加所述第一末端序列(16)，所述反向引物的尾部添加所述第二末端序列(17)。

9.根据叙述8所述的方法，其中所述pcr是易错pcr，由此生成大量载体，所述载体由于包含所述初始编码多核苷酸的随机突变体而彼此不同。可选地，所述叙述8中的所述pcr涉及定点诱变pcr，允许在所述初始编码序列内引入预定的突变。

10.根据叙述1-9中任一项所述的方法，其中所述方法包括在包含在所述tile载体中的所述初始编码多核苷酸的序列内引入定向突变的附加步骤，所述附加步骤包括使用kunkel法、利用错配引物的pcr定向诱变或全质粒诱变法(例如quickchange法)。

11.一种tile载体(24)，包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着第一iis型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10)，其中所述前面的和后面的iis型识别序列(12)被相同的iis型限制性内切酶识别但具有相反的方向；所述tile载体(24)的特征在于所述编码多核苷酸序列(10)包含初始多核苷酸序列(8)，所述初始多核苷酸序列(8)的前面和后面紧接着两个编码延伸序列(11)(3xn),所述两个编码延伸序列(11)(3xn)在所述初始编码序列(8)的开放阅读框的框内。

12.一种多核苷酸序列，包含初始编码多核苷酸序列(8)以及第一和第二末端序列(16,17)，其中所述第一和第二末端序列(16,17)中的每一个包含下列元件：

i.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)紧接在所述初始编码多核苷酸(8)的前面和后面并在所述初始编码多核苷酸(8)的开放阅读框的框内；

ii.邻接所述编码延伸序列(11)(3xn)的第一iis型识别序列(12)，其中所述第一iis型识别序列(12)被定向成使得识别所述第一iis型识别位点的iis型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列(11)(3xn)内裂解，产生突出端，并且其中所述第一和第二末端序列的所述第一iis型识别序列(12)被相同的iis型酶识别，但具有相反的方向；

iii.邻接所述第一iis型识别序列(12)或在所述第一iis型识别序列(12)内的间隔区序列(13)；

iv.邻接所述间隔区序列(13)的第二iis型识别序列(14)，其中所述第二iis型识别序列(14)被定向成使得识别所述所述第二iis型识别序列(14)的iis型限制性内切酶能够裂解所述间隔区序列(13)从而产生间隔区突出端，并且其中所述第一和第二末端序列的所述第二iis型识别序列(14)不被识别所述第一iis型识别序列(12)的iis型酶识别；

v.尾序列(15)，所述尾序列(15)具有足够的长度以便允许iis型限制性内切酶与所述第二识别序列(14)结合。

13.一种连接两个或更多个编码多核苷酸以形成被整合在载体中的产物多核苷酸的方法，所述方法包括孵育混合物，所述混合物包含：

i.两个或更多个tile载体，优选地所述tile载体根据叙述1-10中任一项所述的方法获得，每个载体包含编码多核苷酸序列(10)，所述编码多核苷酸序列(10)包含两个编码延伸序列(11)(3xn),其中所述编码多核苷酸序列(10)的前面和后面紧接着所述iis型识别序列(12)，其中所述载体的所述前面的和后面的识别序列(12)被相同的iis型限制性内切酶识别；

ii.iis型限制性内切酶，所述iis型限制性内切酶识别所述tile载体内的所述前面的和后面的iis型识别序列(12)并且从每个所述载体中裂解出编码多核苷酸序列(10),其中每个释放的编码多核苷酸的至少一个突出端与另一个释放的编码多核苷酸的至少一个突出端互补；

iii.目的载体(18)，所述目的载体(18)包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含定位于两个第一iis型识别序列(21)之间的选择性标记(23)，其中所述第一iis型识别序列(21)被相同的iis型限制性内切酶识别，但具有相反的方向，使得所述载体能够使用识别所述第一iis型识别序列的iis型限制性内切酶裂解以形成：

■填充序列(20)，所述填充序列(20)包含所述第一iis型识别序列(21)，优选地所述填充序列进一步包含反向选择性标记(5)；和

■选择性载体片段(19)，所述选择性载体片段(19)包含所述选择性标记(23)但缺少所述第一iis型识别序列(21)并具有非互补的末端突出端，其中一个突出端与所述释放的编码多核苷酸中的任一个的至少一个突出端互补，同时另一个突出端与所述释放的编码多核苷酸中的任一个的至少另一个突出端互补；

iv.识别所述目的载体的所述第一iis型识别序列(21)的iis型限制性内切酶；

v.dna连接酶。

14.根据叙述13所述的方法，其中所述编码多核苷酸被组合在所述产物多核苷酸内的单一阅读框中。

15.根据叙述13或14所述的方法，其中所述目的载体的所述第一iis型识别序列(21)被相同的识别所述tile载体的所述前面的和后面的识别序列(12)的iis型限制性内切酶识别。

16.根据叙述13-15所述的方法，其中所述tile载体被设计成释放包含突出端序列的编码核苷酸，诱导包含预定数目的连接的编码多核苷酸的产物核苷酸的形成，并且其中所述释放的编码多核苷酸的突出端序列预先确定所述编码多核苷酸在所述产物核苷酸中所述编码多核苷酸的顺序内的位置。

17.根据叙述16所述的方法，其中所述tile载体提供两个或更多个释放的编码多核苷酸，所述两个或更多个释放的编码多核苷酸的核苷酸序列不同但共有相同的突出端序列，其中所述方法导致形成不同的产物核苷酸，所述不同的产物核苷酸在所述产物核苷酸中由所述不同的释放的编码多核苷酸的所述共有的突出端序列所限定的位置处的核苷酸序列发生变化。

18.根据叙述17所述的方法，其中核苷酸序列不同但共有相同的突出端序列的所述释放的编码多核苷酸包含编码给定蛋白质单元的多核苷酸的不同变体或突变体。

19.根据叙述17所述的方法，其中核苷酸序列不同但共有相同的突出端序列的所述释放的编码多核苷酸包含编码不同蛋白质单元的不同的多核苷酸。

20.一种目的载体(18)，包含选择性标记(23)、两个第一iis型识别序列(21)和反向选择性标记，其特征在于：

-所述选择性标记(23)被定位在两个(3xn)序列(p1和pn+1)之间，所述(3xn)序列中的每个后面接着第一iis型识别序列(21)；

-所述两个第一iis型识别序列(21)被相同的识别所述两个第一iis型识别序列(21)的iis型限制性内切酶识别。

21.一种接收载体(1)，包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含位于两个多克隆位点之间的选择性标记(6)，第一个多克隆位点包含一系列多个不同的iis型识别序列且第二个多克隆位点包含与所述第一个多克隆位点中的那些一样被相同的iis型酶识别的方向相反的iis型识别序列，其中所述多克隆位点包含第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)；使得所述载体能够使用识别所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)的iis型识别酶裂解以形成：

包含所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)的填充序列(2)；和

包含所述选择性标记(6)但缺少所述第一和第二iis型识别序列并且具有非互补的末端突出端的选择性载体片段(7)。

附图说明

图1:基于iis型限制性内切酶的versatile改组。

a.非回文iis型识别位点(▲)从tile的末端移除形成核苷酸突出端(编码延伸序列)。当这些片段在各个目的载体中连接时，当移除iis型识别位点时它们不能被再消化，由此允许同时进行限制性内切和连接反应。iis型限制性位点的正确设计和核苷酸突出端的选择产生稳定的死端产物(dead-endproduct)，即所需的构建体。

b.在versatile改组中，选择形成的突出端使得其被包埋在编码1至n个氨基酸的至少3个核苷酸中，所述核苷酸以定向的方式连接邻近的tile。精心选择的核苷酸接头的作用作为编码延伸序列(正方形、菱形、球形、多边形)起作用，限定了tile组装体的最终次序。

图2:通过重叠延伸的拼接。

a.soepcr概述:在第一pcr中，生成具有包含突变的内部bsai识别序列的互补末端的两个片段。所述突变理想地是编码序列中的沉默突变。在第二pcr中，这些片段将杂交，并且随着加入正向引物(a)和反向引物(d)，重新生成缺少内部识别位点的原始序列。

b.用于第二pcr(触减pcr)的温度程序方案。降低的退火温度使得能够发现两个生成的片段的重叠区杂交的最适温度。

c.对于ead10和ead16两者使用的soe引物的表(bsai识别序列加下划线并且点突变以粗体指示)。

图3:pvtse接收载体主链和利用ipcr线性化。通过插入4个不同的插入盒生成4个不同的pvtse，每个插入盒具有各自的编码延伸序列(pn)和侧翼的bsai识别位点：pvtse1:p1,p2；pvtse2:p2,p3:pvtse3:p3,p4；pvtse4:p4,p5。pvtse通过ipcr线性化，以这种方式使得线性化载体的末端由编码延伸序列组成。这通过使用与各个编码延伸序列互补的引物和邻接的bsai识别位点来完成，如图中所示。下表显示了不同的编码延伸序列、非回文bsai识别位点以及它们相应的核苷酸和氨基酸序列。

图4:接收载体pvtseii和pvtseiii的示意性图示。

图5:与vts相容的不同的目的载体的示意性概述。

图6:半理性versatile改组的长度分布。使用r脚本计算的理论预测值由浅灰色曲线表示。概念证明的实验数据以深灰色曲线表示。曲线是非连续的(non-contentious)。

图7:在位置1处存在的不同的肽的数目。浅灰色条代表在第一个组装体中发现的肽，深灰色条显示第二个组装体的肽。

图8:随机versatile改组的长度分布。浅灰色曲线表示使用r脚本计算的理论预测值。概念证明的实验数据以深灰色曲线表示。曲线是相对相似的。

图9:组合物plvtsd1和pyvtsd1概况。

图10:a.工程化细胞内溶素(h11–46kda)的大规模表达，从工程化细胞内溶素通过versatile改组生成编码序列。b.泳道1:低分子量蛋白梯度，泳道2:流穿液，泳道3:洗涤液，泳道4:第一次洗脱液，泳道5:第二次洗脱液，泳道6:经透析的洗脱液1，泳道7:经透析的洗脱液2，泳道8:pageruler预染的蛋白梯度。

图11:对小规模表达的96种不同的经vts生成的蛋白的平行sds-page纯化级分(来自thermoscientific的hispur^tmni-nta旋转盘)。泳道1:蛋白质1,泳道2:蛋白质2,泳道3:蛋白质3,泳道4:蛋白质4,泳道5:pageruler预染的蛋白梯度，泳道6:蛋白质5,泳道7:蛋白质6,泳道8:蛋白质7,泳道9:蛋白质8,泳道10:蛋白质9,泳道11:蛋白质10,泳道12:蛋白质11,泳道13:蛋白质12,泳道14:蛋白质13,泳道15:蛋白质14。

图12:接收载体的示意性图示。

图13:用第一末端序列(16)和第二末端序列(17)延伸的初始编码序列(8)的示意性图示。

图14:tile载体的示意性图示。

图15:目的载体的示意性图示。

具体实施方式

详述

如上文所详述的那样，本发明提供了一种制备tile载体的方法，所述tile载体是包含选择性标记和编码多核苷酸的载体，其中所述编码多核苷酸的前面和后面紧接着iis型识别序列,其中所述前面的和后面的识别序列被相同的iis型限制性内切酶识别，但具有相反的方向。

在该方面，现有技术，例如us2014/0329233,提供了将两个或更多个编码多核苷酸组合成组合的编码多核苷酸(也称作产物核苷酸)的方法。这些方法利用限制性内切酶诸如iis型限制性内切酶的dna消化作用，所述限制性内切酶识别非回文序列，并且在其识别序列外裂解。在通过iis型限制性内切酶裂解dna后，通过此类裂解产生的一个末端缺少识别序列的任何部分。因此能够设计第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含前面和后面侧接有iis型识别序列的编码多核苷酸序列，所述识别序列被定向为使得使用识别所述前面的和后面的识别序列的iis型酶对所述第一多核苷酸的裂解导致所述编码多核苷酸的释放，其中所述释放的编码多核苷酸片段不包含所述前面的和后面的iis型识别序列的任何部分。下文中，这种第一多核苷酸称作tile多核苷酸或tile载体(在此情况下，这种多核苷酸是载体)。

许多iis型限制性内切酶的另一个有趣的特征是它们对多核苷酸的裂解与具有已知方向和长度的突出端的形成相关。因此，能够设计两个或更多个tile多核苷酸，每个tile多核苷酸包含前面和后面侧接iis型识别序列的编码多核苷酸，使得使用相应的iis型酶对所述多核苷酸的裂解导致多个编码多核苷酸的释放，所述多个编码多核苷酸可以依靠所述释放的编码多核苷酸的突出端的设计以定向、随机或半随机的方式组合。

采用本发明，目前可获得的用于生成多核苷酸的技术被进一步改进。具体地，本发明提供了用于大规模改组来自许多不同来源的大量不相关基因片段以形成新蛋白质的方法和工具。本发明可特别地用于产生大量的杂合蛋白质或融合蛋白质。

本发明特别地集中于使用编码延伸序列(3xn)(11)作为编码多核苷酸序列(10)的一部分。在下文中，我们设n＝2，在我们的试验设置中总是使用此设定。

在下表中我们可以看到执行的这些用于三个不同试验设置的选择。

表1:概述所使用的编码延伸序列

¹(a/c)根据所使用的目的载体添加的各个核苷酸(p1目的载体＝accatn；如果目的载体具有赖氨酸(lys)和紧接在产物核苷酸后的终止密码子，则pn+1目的载体＝nagtaa，或如果目的载体具有赖氨酸(lys)和紧接在产物核苷酸后面的酪氨酸(tyr)，则pn+1目的载体＝nagtac。后面的目的载体将c-末端序列(如纯化标签)添加到蛋白质。

²n:此核苷酸可以自由选择用于生成tile。其将在组装期间被移除。

在利用第一iis型识别序列消化后，突出端序列将由每个编码延伸序列(3xn)形成，所述编码延伸序列(3xn)将与混合物中的另一个突出端序列互补。图16图示了用于组装三个初始编码多核苷酸序列(8)的这些，在目的载体(18)中初始编码多核苷酸序列(8)侧接不同的编码延伸序列(11)。就tile位置而言，可以看到哪一个编码延伸序列在初始编码多核苷酸序列的前面和后面。当利用不同的tile载体(或延伸的编码多核苷酸序列)和目的载体进行versatile改组反应时，经消化的编码延伸序列的两个互补突出端将被重组到重组的编码延伸序列(25)中。

1)占据组装体中第一个位置的初始编码多核苷酸序列的前面的编码延伸序列将与目的载体的3xn序列p1重组。目的载体被构建成使得重组的编码延伸序列的第二个三联体是起始密码子，所述起始密码子相对于核糖体结合位点被正确定位，确保在此起始密码子处启动翻译。在目的载体编码n-末端纯化标签或任意其他n-末端序列的情况下，重组的编码延伸序列的第一个三联体将根据目的载体的3xn序列p1的第一个核苷酸产生另一个氨基酸(p,t,a)。

2)占据组装体中第一个位置的初始编码多核苷酸序列的后面的编码延伸序列将与占据组装体中的第二个位置的初始编码多核苷酸序列的前面的编码延伸序列重组。占据组装体中第二个位置的初始编码多核苷酸序列的后面的编码延伸序列将与占据组装体中第三个位置的初始编码多核苷酸序列的前面的编码延伸序列重组。在每个连接区处形成新的重组密码子延伸序列(25)。在两个邻接的编码多核苷酸序列之间的重组密码子延伸序列编码两个氨基酸。突出端序列包含第一个三联体的最后两个核苷酸和第二个三联体的前两个核苷酸。确切的两个氨基酸将由在位置x处的初始编码多核苷酸序列的后面的编码延伸序列的第一个核苷酸和在位置x+1处的初始编码多核苷酸序列的前面的编码序列的最后一个核苷酸决定。

3)占据组装体中最后一个位置的初始编码多核苷酸序列的后面的编码延伸序列将与目的载体的3xn序列pn+1重组。目的载体被构建成使得重组编码延伸序列的第二个三联体是终止密码子(taa,tag；pn+1的第六个核苷酸是a或g)。在目的载体编码c-末端纯化标签或任意其他c-末端序列的情况下，重组编码延伸序列的第二个三联体将是编码氨基酸(y)的tac(pn+1的第六个核苷酸是c)而不是终止密码子。

sarrion-perdigones等人,2011描述了‘goldenbraid,一种首先组装包含启动子、编码序列和终止子的转录单元，然后将不同转录单元的第二个组装体进一步组装在多基因组装体中的方法。对于转录单元的组装，每个元件保持在框内并不重要，因为组装发生在阅读框外。这与本发明的versatile改组方法形成对比，在本发明中所有连接均在阅读框内发生。相反，goldenbraid使用不同的在邻接的构造单元之间重叠的4nt，产生无疤痕克隆。4nt是非编码序列。这与versatile改组相反，在versatile改组中，添加3xn核苷酸的编码延伸序列从而形成两个邻接的tile之间的疤痕(两个氨基酸的接头)。这是必需的以便留在阅读框内并允许组合设计。

vad-nielsen等人，2016利用goldengate技术采用iis型限制性内切/连接方案组装不同的构造单元，产生crisprgrna表达阵列。此阵列也不是一个编码序列，因此不需要所有构造单元都在框内组装。在此，该作者还使用了不同的4nt，所述4nt也是不同grna之间的非编码序列。

在如由engler等人，2009使用的goldengate改组技术中，得到的组装体是编码序列。与sarrion-perdigones等人,2011和vad-nielsen等人,2016相反，连接区因此是编码序列。然而，选择4nt使得它们在将被改组的不同的编码序列(亲本基因)之间是保守的。它们因此可以充当无疤痕组装的连接点，在邻接的构造单元之间不加入额外的氨基酸，这与本发明的versatile改组技术相反。versatile改组适合与完全同源性独立的序列一起使用，对于完全同源性独立的序列而言其不可能鉴定亲本基因间的4个保守核苷酸，使得与现有技术中描述的技术相比versatile改组可用于许多应用。

在us20140329233中，构造单元通过iis型限制性内切/连接进行组装。然而，重组位点不像在本发明的versatile改组方法中那样进行专门设计以形成两个特异的氨基酸。在versatile改组(参见图16)中，重组编码延伸序列由两个编码延伸序列(3xn)与所述4nt突出端的前两个核苷酸(其是第一个三联体的最后两个核苷酸)和所述4nt突出端的最后两个核苷酸(其是第二个三联体的前两个核苷酸)产生。在位置n处的tile载体的后面的编码延伸序列的第一个核苷酸和在位置n+1处的tile载体的前面的编码延伸序列的第6个核苷酸最终决定确切的两个氨基酸。us20140329233提到三个核苷酸的突出端可以是单个密码子，如甲硫氨酸/甘氨酸/丙氨酸，因此突出端完全编码间插的氨基酸。然而，三个核苷酸的突出端在组装过程中不如四个核苷酸的突出端有效，并且更小数目的tile可以包含在单一组装体中。

在本发明的第一个实施例(即，实施例9)(定向组合)中，4个tile多核苷酸被设计成各自释放这样的编码多核苷酸，其中第一个释放的多核苷酸拥有具有与第二个释放的多核苷酸的互补突出端相同的方向和长度的突出端，而所述第二个释放的多核苷酸的另一个突出端拥有具有与第三个释放的多核苷酸的互补突出端相同的方向和长度的突出端，并且其中所述第一个和第三个释放的多核苷酸没有互补突出端。在此实施例中，在dna连接酶的存在下使用适宜的iis型酶释放这些编码多核苷酸导致形成产物多核苷酸，其中第二个编码多核苷酸的序列位于第一个和第三个编码多核苷酸的序列之间。

在第二个实施例(即，实施例11)(随机组合)中，16个(4x4)这样的tile多核苷酸被设计成释放4组4个编码多核苷酸,其中指定组的各个释放的编码多核苷酸包含侧接相同的突出端序列的第一、第二、第三或第四核苷酸序列，并且其中在各个组中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列是相同的。此外，所述第一组的释放的多核苷酸拥有具有与所述第二组的释放的多核苷酸的互补突出端相同的方向和长度的突出端，而所述第二组的释放的多核苷酸的另一突出端拥有具有与第三组的释放的编码多核苷酸的互补突出端相同的方向和长度的突出端，并且其中所述第一组和第三组的释放的多核苷酸不具有互补突出端。此外，所述第四组的释放的多核苷酸拥有具有与所述第三组的释放的多核苷酸的互补突出端相同的方向和长度的突出端，其中所述第一、第二和第四组的释放的多核苷酸不具有互补突出端。在本文中，第一组的突出端与目的载体的互补突出端相同，并且这同样应用于第四组。

在此第二实施例中，在dna连接酶的存在下使用适宜的iis型酶释放这些编码多核苷酸导致形成产物多核苷酸，不同之处在于所述产物多核苷酸内所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列的顺序。

在第三个实施例(实施例10)(半随机组合)中，4个这样的tile多核苷酸被设计成释放4个编码多核苷酸，其中第一个和第二个释放的编码多核苷酸分别包含侧接相同的突出端序列的第一和第二核苷酸序列，而第三个和第四个释放的编码多核苷酸分别包含各自侧接不同的突出端的第三和第四核苷酸序列。此外，所述第一个和第二个释放的编码多核苷酸包含具有与所述第三个释放的多核苷酸的互补突出端相同的方向和长度的突出端，而所述第三个释放的多核苷酸的另一个突出端拥有具有与第四个释放的多核苷酸的互补突出端相同的方向和长度的突出端，并且其中所述第一个和第二个释放的编码多核苷酸不具有与第四个释放的编码多核苷酸的突出端互补的突出端。在此第三实施例中，在dna连接酶的存在下使用适宜的iis型酶释放这些编码多核苷酸导致形成产物核苷酸，不同之处在于它们各自在第一位置处包含所述第一或第二核苷酸序列，分别接着所述第三和第四核苷酸序列。

这种用于组合多核苷酸的方法可以涉及将获得的产物核苷酸整合在载体中，优选整合在环状载体中。这可以使用载体来实现，下文中称此为目的载体，所述目的载体被设计成被裂解，优选使用iis型限制性内切酶裂解，使得在裂解后生成的载体片段在一端包含与产物多核苷酸的第一突出端互补的突出端，并且在另一端包含与所述产物多核苷酸的第二突出端互补的突出端，其中所述载体片段优选地不包含被用来生成所述载体片段或从tile多核苷酸释放所述编码多核苷酸的任一种iis型酶识别的任一种iis型识别序列。在dna连接酶的存在下通过适宜的iis型酶释放所述编码多核苷酸和所述载体片段导致形成这样的环状载体，所述环状载体包含相同或不同的产物多核苷酸。这样的载体可以用来研究产物核苷酸的特性或来自所述产物核苷酸的表达产物的特性。

清楚地是，此类用于组合多核苷酸的方法在蛋白质的研究、设计或改造中是有价值的工具。具体地，这些方法允许通过将从各个tile多核苷酸释放的多个编码多核苷酸定向、随机或半随机组装到相同或大量不同的产物核苷酸中来设计新的蛋白质。随后，可以表达这些产物核苷酸中的每一个，并且可以分析得到的蛋白质以确定他们的物理化学特性、酶促特性、功能特性或其他特性。当对于至少一种释放的编码多核苷酸可获得多个变体时，生成的蛋白质的种类以及因此这些蛋白质中的任一个具有所需的特性的几率可以增加，其中所述变体在所述编码多核苷酸的一个或多个位置处的序列不同，然而不包括在释放的编码多核苷酸的突出端的位置处的任何序列差异。以此方式，可以形成不仅在各个编码多核苷酸序列的次序上不同，而且这些产物核苷酸所包含的编码多核苷酸的序列变体也不同的产物核苷酸。为了在常规蛋白质设计和改造项目中引入此额外水平的变异，对于制备所述tile多核苷酸，特别是tile载体的有效方法存在着需求。优选地，此类方法能够并且有助于从指定的编码蛋白质的多核苷酸的变体集合开始生成大量的tile多核苷酸或tile载体。备选地，此类方法允许在生成此类tile多核苷酸或tile载体期间或之后在编码多核苷酸中引入序列变异。

因此，本发明的第一个目的是提供一种生成此类tile多核苷酸、优选tile载体的方法。所述方法特别适合于有效的生成此类tile多核苷酸的文库，尤其是tile载体的文库，该文库包括指定的编码多核苷酸的大量变体。更具体地，本发明提供了一种制备tile载体(24)的方法(图14)，所述tile载体(24)是优选包含选择性标记(6)和编码多核苷酸(10)的载体，其中所述编码多核苷酸(10)前面和后面紧接着iis型识别序列(12)，其中所述前面的和后面的识别序列被相同的iis型限制性内切酶识别，但具有相反的方向。更具体地，所述前面的和后面的iis型识别序列(12)的位置和方向提供了所述tile载体被相应的iis型限制性内切酶裂解，导致在其各末端处具有已知方向和长度的突出端序列同时缺少所述前面的和后面的iis型识别序列的所述编码多核苷酸的释放。在第一步骤(a)中，此类tile载体的制备涉及提供初始编码多核苷酸(8)，诸如例如编码酶或抗体的功能单位的多核苷酸，并用第一末端序列(16)和第二末端序列(17)延伸所述多核苷酸的各个末端，其中所述末端序列中每一个包含下列元件(图13)：

i.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)邻接所述初始编码多核苷酸(8)的各个末端并在所述初始编码多核苷酸(8)的开放阅读框的框内加入。典型地，所述tile载体的所述编码多核苷酸(10)由用所述编码延伸序列(11)延伸的初始编码多核苷酸(8)组成；

ii.邻接所述编码延伸序列的第一iis型识别序列(12)，其中所述第一识别序列被定向成使得识别所述第一识别位点的iis型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列内裂解，产生突出端，所述突出端的序列在所述初始编码多核苷酸的开放阅读框的框内，并且其中所述第一末端序列和第二末端序列的所述第一iis型识别序列被相同的iis型酶识别，但具有相反的方向；

iii.邻接所述第一iis型识别序列或在所述第一iis型识别序列内的间隔区序列(13)；

iv.邻接所述间隔区序列的第二iis型识别序列(14)，其中所述第二识别序列被定向成使得识别所述第二识别序列的iis型限制性内切酶能够裂解所述间隔区序列从而产生间隔区突出端，并且其中所述第二iis型识别序列不被识别所述第一iis型识别序列的iis型酶识别。在具体的实施方案中，所述第一末端序列和第二末端序列的所述第二iis型识别序列被选择为被相同的iis型酶识别；

v.尾序列(15)，所述尾序列(15)具有足够的长度以便允许iis型限制性内切酶与所述第二识别序列结合。

根据所使用的限制性内切酶的类型，尾序列(15)也可以不存在，只要所选择的限制性内切酶能够在缺少此类另外的尾序列的条件下结合所述第二识别序列即可。因此，在本发明的上下文中，尾序列(15)是末端序列的可选元件。此外，在需要另外的尾序列以允许结合iis型限制性内切酶的情况下，所述尾序列优选包含0-28个核苷酸；更优选地，其包含3-6个核苷酸。

在第二步骤(b)中，此类tile载体的制备涉及提供接收载体(1)，所述接收载体(1)是包含第一核苷酸序列的载体，所述第一核苷酸序列包含定位于第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)之间的选择性标记(6)，使得所述载体可以使用识别所述第一iis型识别序列和第二iis型识别序列的iis型识别酶裂解从而形成：

■填充序列(2)，所述填充序列(2)包含所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)，优选所述填充序列进一步包含反向选择性标记(5)；和

■选择性载体片段(7)，所述选择性载体片段(7)包含所述选择性标记(6)但缺少所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)并且具有非互补性末端突出端，其中一个突出端与在使用识别所述第一末端序列的所述第二iis型识别序列的iis型识别酶裂解所述第一末端序列后获得的间隔区突出端互补，而另一突出端序列与通过使用识别所述第二末端序列的所述第二iis型识别序列的iis型限制性内切酶裂解所述第二末端序列获得的间隔区突出端互补。

典型地，所述接收载体(1)的所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)被相同的iis型酶识别，但具有相反的方向。

在第三步骤(c)中，此类tile载体的制备涉及孵育混合物，其中所述混合物包含：

i.步骤(a)的延伸的初始编码多核苷酸；

ii.步骤(b)的接收载体(1)；

iii.识别所述延伸的初始编码多核苷酸的末端序列的所述第二iis型识别序列的iis型限制性内切酶；

iv.识别所述接收载体的所述第一iis型识别序列和第二iis型识别序列的iis型限制性内切酶；

v.dna连接酶。

为了限制在本发明的方法中要使用的限制性内切酶的数目，优选接收载体(1)的所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)被与所述延伸的初始编码多核苷酸的第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的两个第二iis型识别序列(14)相同的iis型限制性内切酶的识别。以此方式，提供单个限制性内切酶用于裂解延伸的初始编码序列和接收载体的那些序列。

为了以灵活的方式实施本发明的方法，对接收载体进行设计，其中所述第一iis型识别序列和第二iis型识别序列包含在第一个多克隆位点内和第二个多克隆位点内。所述第一个多克隆位点包含一系列多个不同的iis型识别序列，同时所述第二个多克隆位点包含与所述第一个多克隆位点中的那些一样被相同的iis型酶识别的方向相反的iis型识别序列。有利地，这样的包含所述多克隆位点的接收载体可以用于在步骤(c)中使用单个iis型限制性内切酶利用在步骤(a)中获得的任意延伸的初始编码多核苷酸来实施本发明的方法，所述延伸的初始编码多核苷酸包含第一末端序列(16)和第二末端序列(17)，所述第一末端序列(16)和第二末端序列(17)各自包含被相同的iis型识别酶识别的第二iis型识别序列(14)，所述iis型识别酶还识别所述多克隆位点中的识别序列。有趣的是，这样的包含所述多克隆位点的接收载体可以用于组合或改组蛋白质编码序列以外的应用中。因此，所述特定的接收载体是本发明的独立目标。

本发明典型的特征在于，编码多核苷酸序列(10)包含初始编码多核苷酸序列(8)，所述初始编码多核苷酸序列(8)的前面和后面紧接着编码延伸序列(11)(3xn)。所述编码延伸序列(11)典型地由一组3的倍数个核苷酸(3xn)组成，其中n可以是从1开始的任何数目；优选地n在1-10的范围内，更优选地n在1-6的范围内，甚至更优选地n是1、2、3、4、5或6；最优选地，n是2。当n被选择为是2时，6个核苷酸(3x2)编码2个氨基酸。

具体地，优选的编码多核苷酸序列(10)选自包括下列的列表：accatg、ggtgct、gcaggc、ggaagc、aagtaa、agcaca、ccaacg、acgagc、ccgtct、tctggt、ggttca(还参见表1的相应编码延伸序列)。

通过用iis型限制性内切酶消化形成的突出端(大部分为4个核苷酸)包含第一个密码子的最后两个核苷酸，以及第二个密码子的前两个核苷酸。两个邻接的初始编码多核苷酸序列的编码延伸序列没有必要是相同的，只要生成的突出端(大部分为4个核苷酸)是互补的即可。编码延伸序列的第一个和第六个核苷酸因此可以自由选择，这确定两个(或更多个)氨基酸。

在本发明的方法的具体实施方案中，用所述末端序列(16,17)延伸的所述初始编码多核苷酸(8)(参见步骤(a))使用dna合成法制备。

在本发明的方法的具体实施方案中，使用聚合酶链式反应(pcr)用所述末端序列(16,17)延伸初始编码多核苷酸(8)(参见步骤(a))，所述聚合酶链式反应(pcr)涉及使用在所述初始编码多核苷酸的各个末端上退火的加尾的正向和反向引物，其中所述正向引物的所述尾添加第一末端序列(16)，所述反向引物的尾添加第二末端序列(17)。在进一步的具体实施方案中，选择在所述pcr中使用的引物和反应条件以便促进在所述初始编码序列内引入定向突变或随机突变。例如，所述pcr反应条件可以是易错pcr条件，由此生成大量载体，所述载体由于它们包含所述初始编码多核苷酸的随机突变体而彼此不同。

在另一具体实施方案中，本发明的方法包括在包含在所述tile载体中的初始编码多核苷酸的序列中引入一个或多个定向突变的附加步骤，所述附加步骤包括使用kunkel法、利用错配引物的pcr定向诱变或全质粒诱变法(例如quickchange法)。

在第二个目的中，本发明提供了tile载体(24)，其包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着iis型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10)，其中所述前面的和后面的iis型识别序列(12)被相同的iis型限制性内切酶识别但具有相反的方向。所述tile载体的进一步特征在于，所述编码多核苷酸序列(10)包含初始多核苷酸序列(8)，所述初始多核苷酸序列(8)的前面和后面接着两个编码延伸序列(11)(3xn),所述两个编码延伸序列(11)(3xn)在所述初始编码序列(8)的开放阅读框的框内。

在第三个目的中，本发明提供了多核苷酸序列，其包含初始编码多核苷酸序列(8)以及第一和第二末端序列(16,17)，其中所述第一和第二末端序列(16,17)中的每一个包含下列元件：

i.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)紧邻所述初始编码多核苷酸(8)的前面和后面并在所述初始编码多核苷酸(8)的开放阅读框的框内；

ii.邻接所述编码延伸序列(11)(3xn)的第一iis型识别序列，其中所述第一iis型识别序列被定向成使得识别所述第一识别位点的iis型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列(11)(3xn)内裂解，产生突出端，并且其中所述第一和第二末端序列的所述第一iis型识别序列被相同的iis型酶识别，但具有相反的方向；

iii.邻接所述第一iis型识别序列(12)或在所述第一iis型识别序列(12)内的间隔区序列(13)；

iv.邻接所述间隔区序列(13)的第二iis型识别序列(14)，其中所述第二iis型识别序列(14)被定向成使得识别所述第二iis型识别序列(14)的iis型限制性内切酶能够裂解所述间隔区序列(13)从而产生间隔区突出端，并且其中所述第一和第二末端序列的所述第二iis型识别序列(14)不被识别所述第一iis型识别序列(12)的iis型酶识别；

v.尾序列(15)，所述尾序列(15)具有足够的长度以便允许iis型限制性内切酶与所述第二识别序列(14)结合。

在进一步的实施方案中，所述人工多核苷酸序列可以在用于根据如本文上面所概括的本发明的任一实施方案制备tile载体的方法中使用。

在第四个目的中，本发明提供了一种使用此类tile载体连接两个或更多个编码多核苷酸以形成产物多核苷酸的方法。典型地，所述产物多核苷酸被整合在载体中。根据本发明的此第二目的的方法涉及孵育混合物，所述混合物包含：

i.根据本发明的第一个目的的方法获得的两个或更多个tile载体，每个此tile载体包含编码多核苷酸序列(10)，所述编码多核苷酸序列(10)包含两个编码延伸序列(11)(3xn),其中所述编码多核苷酸序列(10)的前面和后面紧接着所述iis型识别序列(12)，其中所述载体的所述前面的和后面的识别序列(12)被相同的iis型限制性内切酶识别；

iii.目的载体(18)(图15)，所述目的载体(18)包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含定位于两个第一iis型识别序列(21)之间的选择性标记，其中所述第一iis型识别序列(21)被iis型限制性内切酶识别，优选被相同的iis型限制性内切酶识别，但具有相反的方向，使得所述载体可以使用识别所述第一iis型识别序列(21)的iis型限制性内切酶裂解以形成：

■填充序列(20)，所述填充序列(20)包含所述第一iis型识别序列(21)，优选地所述填充序列进一步包含反向选择性标记；和

iv.识别所述目的载体的所述第一iis型识别序列(21)的iis型限制性内切酶。在根据本发明的第四个目的的方法的具体实施方案中，所述目的载体(18)的所述第一iis型识别序列(21)被相同的识别所述tile载体的所述前面的和后面的识别序列的iis型限制性内切酶识别。以此方式，相同的iis型限制性内切酶可以用于裂解所述tile载体(24)和所述目的载体(18)；

v.dna连接酶。

优选地，如在根据此第四个目的的方法中使用的tile载体是根据本发明的第一个目的的方法制备的。

典型地，在所述tile载体之间编码多核苷酸的序列有差异。此序列变化可以在于：(i)tile载体包含指定的编码多核苷酸的变体，(ii)tile载体包含编码蛋白质的不同的功能单元或其他单元的编码多核苷酸和/或(iii)tile载体被设计成释放具有不同的突出端序列的编码多核苷酸。

典型地，其中释放的编码多核苷酸在产物核苷酸中组合的次序由各个释放的编码多核苷酸的突出端的互补性决定，所述互补性又由整合在各个编码多核苷酸中的编码延伸序列的设计决定。优选地，在根据本发明的第四个目的的方法中，对tile载体的选择被设计为诱导产物核苷酸的形成，所述产物核苷酸包含预定数目的连接的编码多核苷酸，并且其中释放的编码多核苷酸的突出端序列限定在产物核苷酸中编码多核苷酸的次序内所述编码多核苷酸的位置。此外，tile载体可以被选择为提供核苷酸序列不同但共有相同的突出端序列的两个或更多个释放的编码多核苷酸，其中所述方法导致形成这样的产物核苷酸，所述产物核苷酸在由所述释放的编码多核苷酸的所述共有的突出端序列所限定的所述产物核苷酸中的位置处的核苷酸序列不同。这样的核苷酸序列不同但共有相同的突出端序列的释放的编码多核苷酸可以包括编码指定蛋白质单元的多核苷酸的不同变体或突变体。备选地，这样的核苷酸序列不同但共有相同的突出端序列的释放的编码多核苷酸包含编码不同的蛋白质单元的不同的多核苷酸

典型地，根据本发明的第四个目的的方法使用被设计为释放编码核苷酸的tile载体集合来进行，所释放的编码核苷酸的各个突出端的互补性有助于，优选地限制突出端与具有相同方向的突出端的配对。以此方式，所获得的产物核苷酸将所述编码多核苷酸组合在单一阅读框中。

本发明进一步提供了目的载体(18)，其包含选择性标记(23)、两个第一iis型识别序列(21)和反向选择性标记，其特征在于：

-所述选择性标记(23)被定位在两个(3xn)序列(p1和pn+1)之间，所述序列中的每个后面接着第一iis型识别序列(21)；

-所述两个第一iis型识别序列(21)被相同的识别所述两个第一iis型识别序列(21)的iis型限制性内切酶识别。

在具体的实施方案中，目的载体(18)选自包括下列的列表：pvtsd1-pvtsd9(seqidn°13-seqidn°21)；更具体地，目的载体选自包括下列的列表：pvtsd2(seqidn°14)、pvtsd3(seqidn°15)、pvtsd4(seqidn°16)、pvtsd5(seqidn°17)、pvtsd6(seqidn°18)、pvtsd7(seqidn°19)、pvtsd8(seqidn°20)、pvtsd9(seqidn°21)。

本发明还提供了接收载体(1)，其包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含位于两个多克隆位点之间的选择性标记(6)，第一个多克隆位点包含一系列多个不同的iis型识别序，列且第二个多克隆位点包含与所述第一个多克隆位点中的那些一样被相同的iis型酶识别的方向相反的iis型识别序列，其中所述多克隆位点包含第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)，使得所述载体可以使用识别所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)的iis型识别酶裂解以形成：

-包含所述第一iis型识别序列(3)和第二iis型识别序列(4)的填充序列(2)；和

-包含所述选择性标记(6)但缺少所述第一iis型识别序列和第二iis型识别序列并且具有非互补的末端突出端的选择性载体片段(7)。

接收载体的特征在于，存在大量iis型限制性位点(多克隆位点),如果识别位点中的一个将存在于要被转化成tile载体的编码多核苷酸序列中，则所述接收载体赋予实验者更大的灵活性。两个各自具有相反方向的iis型多克隆位点与侧接的sacb序列一起存在于接收载体中，所述sacb序列作为阴性选择标记被插入。为了具有功能性多克隆位点，那些iis型限制性内切酶的现有识别位点也从主链移除。另外地，全质粒被进一步减小至仅仅充当tile运载体，包括移除启动子、报告基因和表达元件。

实施例

实施例1:用于使用平端连接构建tile载体的一般规程

tile是各个模块的初始编码序列，其每一侧上侧接编码延伸序列(11)且在末端处具有方向向内的第一iis型识别位点(12)。当tile存在于接收载体内时，其将被称作tile载体。一般来说，各个模块的初始编码多核苷酸序列(>100bp)利用校正pcr酶使用标准pcr条件和引物扩增。如果内部iis型识别位点存在于初始编码多核苷酸序列中，则首先使用重叠延伸拼接(soe)技术使用包括突变的错配的重叠引物以修饰iis型识别位点来移除此内部iis型识别位点(图2)。可以使用具有相似结果的不同的定向诱变法。

纯化特异性pcr产物。在非特异性产物的情况下，优化pcr条件或使用凝胶回收操作规程以获得纯的特异性产物。通过引物杂交生成小的初始编码多核苷酸序列(<100bp)。以下述的方式设计引物：它们具有至少15个重叠碱基对，在杂交后产生完整的初始编码多核苷酸序列。引物以等摩尔量(5μm)混合并在微量恒温仪(heatblock)中以95℃的起始温度孵育(5min),接着逐渐冷却至室温(20℃)。对于小于60bp的片段，引物杂交产生完整的初始编码多核苷酸序列，而对于长度介于60bp与100bp之间的片段，需要附加的填平步骤以填平突出的单链dna。利用pfudna聚合酶进行填平反应(在72℃10分钟)。

由puc19载体骨架构建4个使用的接收载体。在此，位于氨苄青霉素(amp)抗性基因中的内部bsai识别位点事先通过定向诱变移除(puc19*)以防止在versatile改组反应期间载体骨架的消化(参见图1)。为了形成四个接收载体(pvtse1、pvtse2、pvtse3、pvtse4,或一般地pvtsex，其中x是指与组装体中的特定位置对应的特定组的编码延伸序列)，含有侧接了两个bsai识别位点的编码延伸序列(pn和pn+1，其中n是组装体中tile的位置，图15)的盒事先被插入在hindiii和xbai识别位点之间的多克隆位点中(图3)。得到的4个空接收载体通过反向pcr(ipcr)线性化。对于每个pvtsex，设计一组引物与插入盒和一部分载体骨架互补(参见表2)。

表2:用于ipcr的引物概况。bsai以粗体显示，编码延伸序列加下划线。

利用pfudna聚合酶(thermoscientific)进行反向pcr(ipcr)。由于所需产物的长度(2710bp)，延伸步骤(72℃)延长至6分钟。得到的线性化pvtsex通过凝胶电泳控制，并利用pcr纯化或凝胶回收进行纯化。使用平端连接在线性化pvtsex中连接插入片段(初始编码多核苷酸序列)。线性化pvtsex(50ng)和插入片段分别以1:3的摩尔比混合。使用的反应混合物的组成在表3中给出(所有组分均订购自thermoscientific)。将反应混合物在22℃孵育1小时，接着在65℃进行10分钟的灭活步骤。

表3:平端连接反应混合物概况。

化学感受态大肠杆菌(e.coli)top10细胞(使用氯化铷法)用pvtsex和插入片段的连接混合物转化。通过加入10μl的各个连接混合物，并将此混合物在冰上孵育30分钟来完成转化。在孵育后，施加热激(42℃)并加入1mllb培养基。随后，将细胞在37℃孵育1小时以允许形成抗生素抗性。在孵育后，将细胞接种(900μl和100μl)在含有100μg/ml氨苄青霉素和x-gal的选择平板上。对于蓝-白筛选，在二甲基甲酰胺中的x-gal溶液(10mg/ml)通过每ml培养基添加2μl来制备。利用位于puc19*载体骨架上的一条引物(m13-正向-d20引物puc19)和在相反方向上的插入物上的一条引物进行定向pcr。仅在初始编码多核苷酸以正确的方向插入时才发生扩增。从选择平板中对每个构建体挑出8个菌落并溶于dreamtaqdna聚合酶(thermoscientific)反应混合物中。使用dreamtaqgreen缓冲液使得在定向pcr后，样品可以立即上样进行凝胶电泳。对于每个被分析的菌落，在新的选择平板上对重复试样划线。通过凝胶电泳分析的合格克隆通过sanger测序进行序列验证，并制备质粒储备液/甘油储备液。

实施例2:使用粘性末端ii型限制性内切酶构建tile载体的一般实验规程

使用标准的限制性内切和连接步骤进行tile构建。初始编码多核苷酸序列现在用引物扩增，随后包含尾序列(15)、限制性位点(hindiii用于正向引物，xbai用于反向引物)、第一iis型识别序列和在每条引物的5’末端中的各个编码延伸序列。用于粘端连接的pvtsei接收载体是通用的，对于最终组装体中的每个位置都是不是特异的，这与实施例1中使用的pvtsex相反。通过定向诱变从puc19起始移除氨苄青霉素抗性基因中的内部bsai识别位点来获得pvtsei载体。将特异性pcr产物纯化，用hindiii和xbai双重消化，并再纯化。准备好通用的pvtsei载体，用hindiii和xbai双重消化，脱磷酸并纯化。采用标准的连接和转化试验规程，获得新克隆，通过pcr克隆分析进行分析并进行序列验证。含有正确的具有初始编码多核苷酸序列的tile载体的克隆保存为质粒和甘油储备液。

实施例3:使用iis型限制性内切酶构建tile载体的一般实验规程

在不同的实验规程中，进一步改进实施例2中的方法。用于pcr的引物中的限制性位点被交换为iis型限制性内切酶bpii(bbsi)的方向向内的识别位点(第二iis型识别序列,14)，接着6nt(间隔区序列，13)。每条引物的不同部分的完整次序因此是尾序列(15)、方向向内的bpii识别位点(14)、6个核苷酸(其中4个是保守的)(13)、方向向内的bsai识别位点(12)、编码延伸序列和与将要扩增的片段末端匹配的核苷酸。从pvtsei起始构建了新的通用接收载体(pvtseii–seqidn°9)。在hindiii和xbai限制性位点之间，盒子随后包含与插入物的正向引物的间隔区序列中相同的6个核苷酸(nngata)、方向向外的bpii限制性位点、sacb基因、方向向外的bpil识别位点和插入物的反向引物的间隔区序列的相同的6个核苷酸(nnaagc)(图4)。

表4:vts反应的反应混合物和组成

将纯化的pcr产物、pvtseii接收载体、bpii和t4dna连接酶在单个试管中混合，接着是在最适连接和消化温度之间的温度程序循环(表4),接着是分别对连接酶和iis型限制性内切酶的逐步热灭活，导致在pvtseii中被第一和第二末端序列侧接的初始编码多核苷酸序列的一步连接。

实验规程的进一步延伸是构建pvtseiii(seqidn°10)，其包含iis型多克隆位点，所述iis型多克隆位点包含几个以与pvtseii(图4)中的bpil相同的方向定向的iis型识别位点(表5)。超过一个iis型识别位点的存在使得实验者能够选择最适合于tile载体构建的iis型限制性内切酶。这归因于此tile载体构建法的通用性，因为所使用的iis型限制性内切酶可以基于在各个tile中缺少其识别位点的情况下来选择，这与仅可以使用bpil的pvtseii相反。

表5:在pvtseiii多克隆位点中存在的iis型限制性内切酶(识别和限制性序列)的概况

从pvtseii起始构建pvtseiii。利用带有尾部的引物以下面的方式将pvtseii线性化：移除sacb片段，随后将方向向外的bseri和方向向内的bsmbi、btgzi和bsai识别位点加入至线性载体。相似地，利用带有尾部的引物扩增sacb片段，产生分别侧接有方向向外的bpii、bfuai、sapi和btgzi识别位点和方向向内的bsai识别位点的sacb片段。在生成的线性载体和sacb片段中存在的bsai识别位点以下列的方式定位：在将两者与t4dna连接酶和bsai混合后，以一个步骤、一个混合物的实验规程构建pvtseiii，由此避免了常规限制性连接反应的繁琐步骤。

使用pvtseiii产生tile载体类似于pvtseii的实验规程(表4,图13)。然而，根据所使用的iis型限制性内切酶的温度曲线，应当调整所使用的酶的孵育时间、温度和量。

实施例4:使用引物盒用于tile载体构建

在不同的实验规程中，除了pcr扩增片段以外，为了引物盒的使用，修改实施例3中的方法(使用iis型限制性内切酶构建tile载体的一般实验规程)。在此，各个初始编码多核苷酸序列被全部地合成为单链dna链，包括第一和第二末端序列。对于具有60个碱基对的最大长度的片段(包括第一和第二末端序列)，两个完全互补的引物被合成并退火(表6),得到包括各个初始编码多核苷酸序列和侧接的第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的双链多核苷酸。在此，正向引物中不同部分的次序如下：三个随机核苷酸的尾序列(15)、方向向内的第二iis型识别位点(14)、6个核苷酸的间隔区序列(13)(其中三个或四个核苷酸是保守的)、方向向内的第一iis型识别位点(12)、正确的编码延伸序列(3xn)(11)、初始编码多核苷酸序列(8)、正确的编码延伸序列(3xn)(11)、方向向内的第一iis型识别位点(12)、6个核苷酸的间隔区序列(13)(其中三个或四个核苷酸是保守的)、方向向内的第二iis型识别位点(12)和3个随机核苷酸的尾序列(15)。反向引物是所述第一引物的完全相反的互补体，并且因此是完全互补的。以相等的浓度添加两个引物产生包括初始编码多核苷酸序列和各个末端序列的双链多核苷酸，类似于在实施例1-3中的pcr扩增的片段。

表6:用于生成引物盒的实验规程

对于长度超过60bp的初始编码多核苷酸序列，将多个引物退火，接着进行最终的填平聚合酶反应(表7)以便填平双链多核苷酸序列中的最终空隙。以下列的方式设计引物：将它们以相等的浓度混合产生包括第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的完整的初始编码多核苷酸序列。在此，在两个连续的重叠引物之间存在最小15个氨基酸的重叠，这样设计使得它们确保引物以正确的顺序退火。第一引物包含第一末端序列(16)和初始编码多核苷酸序列的第一部分。后面的引物包含与第一引物的末端反向互补的至少15个核苷酸和初始编码多核苷酸序列的第二部分。重复此过程直至初始编码多核苷酸序列被完全覆盖。最后的引物具有与前面的引物的末端反向互补的15个核苷酸，初始编码多核苷酸序列的最后一部分和第二末端序列(17)。将这些引物以相等的浓度混合，接着加热并逐渐冷却得到覆盖初始编码多核苷酸序列以及第一末端序列(16)和第二末端序列(17)两者的dna分子，所述dna分子是部分双链的但仍含有其中引物没有互补部分的单链的序列段。得到的片段用作最终填平聚合酶反应中的模板(表7)以填平单链序列段，得到与实施例1-3类似的双链多核苷酸(末端序列和初始编码多核苷酸序列)和完全重叠的引物盒。

表7:重叠引物组的最终填平聚合酶反应

用于在各个接收载体中克隆双链多核苷酸(通过如本实施例中所述的引物退火获得)的实验规程完全类似于实施例3中所解释的实验规程。

这使用引物盒(至多60bp)和由完全重叠以及部分重叠的引物构成的dna片段(>60bp)来测试和验证。对在各个接收载体中所构建的引物盒/双链多核苷酸的克隆以大于95％的效率完成。

实施例5:使用通过基因合成产生的dna片段构建tile载体

在不同的实验规程中，进一步改进实施例3和4的方法以用于化学合成双链多核苷酸片段(例如，dna串、gblocks)。在此，通过基因合成完全地生成包括第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的各个初始编码多核苷酸序列。在这些合成的双链片段中各个不同部分的次序如下：尾序列(15)、第二iis型识别位点(14)、间隔区序列(13)、第一iis型识别序列(12)、编码延伸序列(11)、初始编码多核苷酸序列(8)、编码延伸序列(11)、第一iis型识别位点(12)、间隔区序列(13)、第二iis型识别位点(14)和尾序列(15)。在化学合成的片段中不同部分的次序与实施例1-4中的pcr扩增片段或引物盒完全类似，并且不同之处仅在于用来获得包含编码序列和各个末端序列(16,17)的多核苷酸的方法。用于在各个接收载体中克隆化学合成的片段的实验规程与实施例3中所解释的实验规程完全类似。

实施例6:用于在接收载体中克隆pcr扩增的多核苷酸的优化实验规程

进一步优化来自实施例3的实验规程用于从pcr扩增的多核苷酸起始构建tile载体以避免对可能由pcr反应导致的引物二聚体的非预期克隆。事实上，经常发生的问题是由于添加到各个末端序列(16,17)的长引物尾部导致形成引物二聚体。对得到的引物二聚体的优先克隆显著地降低了tile构建实验规程的效率，并且因此对于优化存在很大的余地。为了防止此问题，应用两种优化：(1)引入2步pcr规程，和(2)对扩增的片段进行附加的凝胶回收。2步pcr规程(表8)采用两个不同的退火温度，在第一步骤中仅使用具有初始编码多核苷酸序列(8)的重叠部分的退火温度，而在第二步骤中，使用具有初始编码多核苷酸序列(8)和末端序列(16,17)的重叠部分两者的退火温度。第二步骤的较严格条件减少了引物二聚体的形成量。第二种优化是使用凝胶回收(例如利用市售试剂盒，诸如thermoscientific的genejet凝胶回收试剂盒)从而完全移除引物二聚体并选择性地纯化具有正确长度的扩增子，不包括小得多的引物二聚体。这些优化产生了效率大于95％的用于tile构建的实验规程。

表8:减少引物二聚体形成的用于tile扩增的2步pcr实验规程

*ta1初始编码多核苷酸重叠部分的退火温度

*ta2初始编码多核苷酸和末端序列重叠部分的退火温度

实施例7:2-步组装

在不同的实验规程中，进一步推敲来自前面实施例的方法从而同时将多个编码多核苷酸序列克隆进一个tile中。在此，类似于实施例3-5形成各个编码多核苷酸序列，并使用相同的实验规程克隆进接收载体中。与将一个编码多核苷酸克隆为tile相反，多个编码多核苷酸序列的同时克隆需要添加不同的末端序列，确保在接收载体中以正确的顺序组装以及有效的克隆。

在此，第一编码多核苷酸包含下列的以其各自的顺序的部分：尾序列、方向向内的第二iis型识别位点、间隔区序列、方向向内的第一iis型识别位点、正确的编码延伸序列、第一片段初始编码多核苷酸序列、与第二片段互补的编码延伸序列、方向向内的第二iis型识别位点和尾序列。后面的编码多核苷酸序列由下列部分组成：尾序列、方向向内的第二iis型限制性位点、与第一片段互补的编码延伸序列、初始编码多核苷酸序列、与后面的片段互补的编码延伸序列、方向向内的第二iis型识别位点和尾序列。后面的编码片段的顺序和不同部分与前面的片段类似，不同之处仅在于它们的编码延伸序列。最后的片段由下列的以其各自的顺序的部分组成：尾序列、第二方向向内的iis型识别位点、与前面的片段互补的编码延伸序列、初始编码多核苷酸序列、编码延伸序列、方向向内的第一iis型识别位点、间隔区序列、方向向内的第二iis型识别位点和尾序列。在此，不同的编码延伸序列必须在两个邻接的初始编码多核苷酸序列之间是互补的。它们可以被选择为初始编码多核苷酸序列之一的一部分从而产生无疤痕组装体或它们可以被选择为使得它们在各个初始编码多核苷酸序列之间添加最小3个核苷酸。最后，此tile因此包含被组装的不同的子片段，并且其本身可以与其他tile以合理、半随机或随机的方式在第二个组装体中使用。

对于在pvtseii中将两个子片段组装到一个tile中进行测试。克隆的效率与单一片段的versatile克隆以及versatile改组的效率相当，并且超过95％。此2-步法对于较大基因产物的组装和tile文库的生成是特别有意义的，所述tile文库可以用于versatile改组。

实施例8:优化versatile改组实验规程

作为对实施例5-6的改进(合理、半随机、随机)，在时间以及成本方面优化用于versatile改组的实验规程。测试一定范围的不同条件，其中改变循环次数、连接酶和bsai的量。这些试验产生了新的经优化的实验规程，其中与原始试验规程相比，所需的时间和使用的酶量减少两倍。对于合理实验规程(表9)(其中仅需要一个正确的克隆)以及半随机和随机实验规程(表10)(其中变异需要保持尽可能高)的优化可以做出区分。因此，合理实验规程与半随机和随机实验规程相比具有更严格的条件。

表9:用于合理组装的versatile改组实验规程的优化

表10:用于半随机和随机组装的优化实验规程

实施例8:利用不同的启动子和纯化标签构建一组通用目的载体

目的载体充当用于通过versatile改组形成的最终构建体的表达和组装载体。获得一组通用目的载体使得实验者能够容易地调整用于各个蛋白质的表达系统。这绕过了与常规克隆所伴随的问题，同时容许一种简易的方式来筛选就蛋白质表达、纯化、稳定性和溶解度而言最适的表达系统。构建基于pnic28-bsai骨架的9个目的载体(图5)。在本文中，启动子、n-末端标签、阴性选择标记和c-末端标签被认为是在不同的载体骨架之间可互换的模块(图5)。9个目的载体包含卡那霉素抗性基因，和用于阴性选择的sacb模块。

从pnic28-bsa4载体起始构建pvtsd通过以下步骤完成：将pnic28-bsa4载体线性化，接着利用改良的引物扩增和纯化各个载体元件(例如，启动子、sacb、标签)。引物以下列的方式设计：通过使用标准的限制性连接实验规程，各个模块和载体骨架以定向的方式串接，生成新的pvtsdx。对于这些目的载体，使用常规的iip型限制性内切酶，然而，为了更有效的制备，可以采用iis型限制性内切酶。这通过产生新的目的载体(pvtsd4)来确认，其中插入sacb模块，且氨苄青霉素抗性标记交换为卡那霉素抗性标记。考虑到此组装的效率，iis型限制性内切酶是用于载体的产生和定制组装的便利工具。

与versatile改组相容的目的载体的组成不限于在这些实施例中使用的模块(启动子、选择标记、标签)。可以使用任意的载体骨架、启动子(诱导型、组成型、组织特异型、…)、阴性选择标记(例如，rpsl、ccdb、ura3、tetar、…)和n-或c-末端标签(例如，gst、mbp、flag、…)来设计与versatile改组相容的定制目的载体。

实施例9:用于4个tile的合理或定向组装的versatile改组反应

为了进一步扩展versatile改组在位置数目方面的可能性，设计具有4个tile的系统。下面的实施例仅包括，但不限于工程化细胞内溶素。这些修饰的噬菌体来源的酶可以分成4个模块。根据实施例3，形成由对工程化细胞内溶素(肽、接头、酶促活性的结构域和细胞壁结合结构域)特异的tile载体组成的库使得能够容易的选择和组装任意的合理设计的工程化细胞内溶素。

基于对96个不同的工程化细胞内溶素的合理设计平行地评估versatile改组法的效率。这96个工程化细胞内溶素基于在文献中得到的信息设计，目标是提高它们的抗菌活性和耐盐性。第一个步骤是将所有4个相应的tile与目的载体(在此例中是pvtsd3)、bsai和t4dna连接酶一起移液到多孔pcr板的每个孔中，接着如表11和12中所示进行versatile反应。随后，大肠杆菌bl21(de3)plyss感受态细胞用反应混合物转化，并接种在选择性培养基(kan⁵⁰和5％蔗糖)中。预先制备感受态细胞(氯化铷法)并将其保存在多孔板中以简化转化步骤并将96个工程化细胞内溶素排成阵列。在q-tray板上完成接种，这是对96个单独的皮氏培养皿在时间上更有效的替代方案。每个板由48个孔组成，每个孔中接种各个培养物。

表11:versatile反应混合物的组成

表12:versatile改组的温度程序

过夜孵育后，q-tray显示96个构建体中有95个的大量菌落，表明versatile反应是成功的。进行克隆分析以进一步确认每个构建体的单一菌落以及那些构建体的各个纯化质粒dna两者。作为合理设计的结果，可以计算所得的工程化细胞内溶素构建体的预期碱基对长度，并将其与通过凝胶电泳分析的菌落pcr所获得的长度进行比较。95个克隆中有90个显示出具有正确长度的条带，由此表明具有95.7％的效率。此外，对9个阳性克隆和1个阴性克隆测序。所有9个阳性克隆显示了tile的正确组装。经测序的阴性克隆具有错误的tile顺序和组成，其最可能是由于在versatile反应的制备中在吸取tile的过程中的失误导致的。

总之，结果表明利用4个tile的versatile反应是非常有效的，即使以多孔的规模也是非常有效的。与常规形成包含不同来源的4个片段的重组组装体相比，库的利用极大地简化了过程。库与多孔形式中的阵列排列相组合允许我们将所需的时间减少至刚好3天，由此突出了versatile形式用于高通量生成没有序列相似性的tile的dna组装的潜力。

实施例10:用于4个tile的半随机组装的versatile改组反应

在不同的实验规程中，采用versatile改组来半随机地生成大量工程化细胞内溶素。半随机设计提示，对于至少一个位置，从库中选择超过一个tile。在其他的位置上，可以选择仅一个tile。在此，与合理设计(实施例9)相反，增加了所生成的构建体的变化。

为了评估versatile改组的半随机特性，设置下列试验：在位置1处的24个外膜透化肽，在位置2处的一个接头，在位置3处的4个细胞壁结合结构域和在位置4处的13个酶促活性结构域。这产生了1248个不同的可能性。所选择的tile与versatile反应混合物一起混合，并根据versatile实验规程(表11和12)组装。

为了控制是否所有tile以均匀分布的方式被内嵌，化学感受态大肠杆菌top10细胞用半合理改组的versatile反应混合物转化并接种在具有卡那霉素(kan⁵⁰)和蔗糖(5％)的lb上。挑取192个菌落并用菌落pcr接着用琼脂糖凝胶电泳评估以便观察不同的组装产物的长度分布。对条带进行手工计数，并使用dna梯度(phagelambda(psti)和generuler100bpdna梯度)估计长度。将菌落根据它们的长度(例如，1000-1100bp)分成不同的组。计算每组的比例并用利用r(统计软件，www.r-project.org)计算的理论长度分布曲线绘图(图6)。

半随机改组的组装体的长度分布没有显示在理论数据和实验数据之间的显著差异，因为两张图几乎重叠。实验数据包含每个长度类别的组装产物。

组装反应进行两次，每次测序25个克隆以评估组装产物是否是正确的。没有一个克隆显示在组装产物中有错误，证明versatile改组以正确的方式以高效率组装终产物。50个获得的序列中有48个彼此不同，确认组装的产物实际上主要是随机产生的(图7)。

实施例11:用于4个tile的随机组装的versatile改组反应

在另一个实验规程中，评估了versatile改组用于随机组装tile的可行性。随机改组意指对于每个位置选择超过一个tile。这与实施例6是可比较的，然而与半随机改组相比，随机改组带来大得多的多样性。

为了确定versatile改组是否以随机的方式组装不同的tile，设置下列的实验：选择在长度上具有明显差异并存在于每个pvtse中的4个tile。因此，每个tile存在于每个位置(1、2、3或4)处，产生了256(4⁴)种不同的可能性。由于tile间长度差异较大，使它们成为等摩尔浓度。这通过对肽12设置50ng/μl的浓度(tile的理想浓度)来完成。使用下列等式计算其他tile的所需浓度：

取在4个混合物中每个tile的所需量并制备4个混合物。混合物的浓度利用nanodrop2000测量，并且当需要时，稀释到到50ng/μl。之后将这些混合物放在一起，并根据versatile改组实验规程(表11和12)进行改组。为了评估组装体的长度，对192个菌落进行克隆分析，其中25个样品送去进行测序。

192个挑选的菌落中有189个在琼脂糖凝胶上有可见的条带。对这些条带进行手工计数并估计长度以便确定随机改组的tile的各个长度分布。类似于实施例6，所以克隆根据它们的长度分成不同的组。计算每组的比例并利用采用r计算的理论分布曲线绘图(图8)。

对于每个类别，理论预期值和实验数据的图相关良好。可以得出结论：versatile改组可以用来进行随机改组并且短的、中等长度或长的tile以接近相似的优先性被整合。

为了验证组装的产物是否在tile或编码延伸序列中不包含任何突变，对25个样品进行测序(上面提到的)。所有组装体均是正确的，例如，tile的数目是四个，编码延伸序列是正确的，tile不具有突变，等等。这证实versatile改组以正确的方式以高效率组装了终产物。另外，25个获得的序列中23个彼此不同，表明组装的产物事实上主要是随机产生的。

实施例12:在不同的目的载体中的versatile改组反应(包括用于在不同于大肠杆菌的宿主中的表达)

使用versatile改组的主要优点是目的载体的可互换性。任意的载体可以容易地被制成与versatile改组技术相容。就表达生物体和系统(例如，启动子、纯化标签、…)而言，这带来了宽范围的选项，由此促进了此技术的通用性。

对使用不同pvtsd的初步验证在大肠杆菌中完成。生成9个不同的pvtsd(pvtsd1–pvtsd9,即，seqidn°13-seqidn°21)(图5所示)并用来改组一组重组蛋白质(例如，工程化细胞内溶素、gfp、碳水化合物降解酶)，如在实施例9-11、13、14和17中说明。对生成的构建体的分析确认了versatile改组反应的高效率是保守的，不依赖于pvtsd组成。此外在9个生成的pvtsd中的每一个中versatile改组的重组蛋白质的表达和纯化显示这些都发挥作用。这些结果提示可能的pvtsd的范围不限于实施例4中生成的这9个，并且任何大肠杆菌表达系统可以被制成为与versatile改组相容。

在不同的实验规程中，构建两个新的目的载体用于在不同的宿主中表达(图9,乳酸乳球菌(lactococcuslactis)和巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))。类似于在大肠杆菌中的实施例，两个目的载体都在其各自的宿主生物体中验证。构建plvtsd(seqidn°12)专门用于在乳酸乳球菌中的蛋白质表达。与vts目的载体的一般设计相反，sacb阴性选择标记不包括在plvtsd中，因为sacb的表达对于乳酸乳球菌没有毒性。在经versatile改组的蛋白质的n-末端处存在的usp45信号肽确保了表达的重组蛋白质被乳酸乳球菌分泌。

在巴斯德毕赤酵母中对pyvtsd(seqidn°11)完成相同的实验。在巴斯德毕赤酵母中利用此目的载体进行vts以及蛋白质表达与在大肠杆菌和在乳酸乳球菌中一样有效。这些实施例证实versatile改组不被限于固定的pvtsd设计也不被限于宿主生物体。在大肠杆菌、乳酸乳球菌和巴斯德毕赤酵母中的确证提示此方法可以用于大范围的表达宿主(细菌、真核生物)和目的载体中。

实施例13:利用不同的编码延伸序列的versatile改组反应

vts不限于在前面实施例中所使用的编码延伸序列。理论上可以选择任意的编码核苷酸序列(3的倍数个核苷酸)来起编码延伸序列的作用。在此，编码延伸序列是将不同的tile连接在一起的保守核苷酸，它们是序列独立的，并且可以被设计成符合实验者的特定需求。然而，在蛋白质水平，编码延伸序列中存在的核苷酸所编码的氨基酸则需要被考虑。不同的氨基酸具有不同的结构，意味着它们可以是较大、较小、柔性的或更刚性的。就维持其协同的蛋白质-蛋白质相互作用、折叠、结构、活性和稳定性而言，这些参数在蛋白质的模块组装中具有重要作用。为了对此进行确认，设计并测试了具有不同的编码延伸序列的系统(参见表1)。无论使用哪种特异性编码延伸序列，均获得相似的dna组装效率。

实施例14:其中一个位置被包含指定的初始编码多核苷酸序列的诱变变体的tile载体的诱变文库占用的versatile改组反应

在此实验规程中，versatile改组的通用性被进一步扩展到使用诱变tile的库。借助于随机或合理诱变，tile库中存在的变异可以被进一步扩展。因此，versatile改组法与诱变技术的组合形成了产生前所未有的变异的可能性，当补充以适宜的筛选方法时所述变异可以用于蛋白质的定向演化。在此实施例中，通过易错pcr生成的一个tile的诱变库被直接用于versatile反应中以评估其可行性。

易错pcr实验规程描述在表13中，并且用来诱变完整的kz144细胞内溶素tile。在扩增步骤后，使用琼脂糖凝胶电泳控制得到的扩增子，随后进行纯化。纯化的片段含有必需的部分(尾序列、第一iis型识别序列和编码延伸序列)，使得它们可以直接用于versatile改组。versatile反应如实施例5中所示使用位置1上的肽1、位置2上的接头1和位置3上的kz144细胞内溶素的诱变文库来完成。大肠杆菌感受态细胞用完整的vts混合物转化并接种在选择培养基(卡那霉素、蔗糖)上。这产生了大量的菌落，表明使用诱变的tile不影响versatile法的效率。对192个菌落的克隆分析进一步证实这一点，因为大多数(74％)在琼脂糖凝胶上显示出正确的迁移模式。5个样品送去测序以验证存在突变。所有5个样品均含有kz144细胞内溶素tile中的突变，大多数突变是置换，由此证实versatile改组与诱变相容，对效率没有任何减小。除了直接使用诱变的pcr产物用于改组，还通过在pvtse接收载体中克隆这些诱变的片段来形成突变体的质粒文库。因此，各个序列可以使用加尾的引物(尾序列、第二iis型识别位点、间隔区序列、第一iis型识别序列、编码延伸序列)扩增(图13)，在易错条件下进行，或使用各个序列的事先诱变的文库作为模板进行。由于iis型克隆在pvtseii和pvtseiii两者中的效率，导致在扩增步骤中形成的变异在pvtse中的克隆期间是保守的，由此形成了质粒文库，所述质粒文库可以容易地被复制并且用于改组。这通过使用therminatordna聚合酶的诱变文库作为模板以产生tile来确认。对用各个tile改组得到的改组产物的测序证实在tile形成期间诱变文库的初始变异是保守的。

表13:易错实验规程。开始取96μl主反应混合物(mastermix)并加入2μl模板dna、1μldreamtaqdna聚合酶和1μl50mmmncl2。在10次循环后，取10μl反应混合物，并加入到90μl新鲜主反应混合物中。重复此过程三次以便增加突变比。

实施例15:其中两个位置被源自各自包含指定的初始编码多核苷酸序列的诱变变体的tile载体的两个不同的文库的序列占用的versatile改组反应

作为实施例10的扩展，versatile反应中的两个位置被诱变的tile的文库占用。kz144细胞内溶素被分成两个tile，即kz144cbd和kz144ead,将它们两个都进行易错pcr(表13)以产生诱变的tile的两个独立文库。用于vts的实验规程与实施例14完全类似。

在转化各个vts混合物后，可见大量菌落。分析24个克隆，其中18个在克隆分析后显示正确的模式，6个测序克隆中的6个含有正确的构建体。在所有测序的克隆中，存在两个诱变的tile中的突变。

实施例14和15两者表明诱变的tile的库可以容易地与versatile改组技术组合，表明诱变可以应用于所有使用的tile。在这些实施例中，tile的诱变限于易错pcr，然而可以采用其他诱变技术(例如，定向诱变)来生成诱变的tile库。这极大地增加了vts法的通用性，因为诱变与dna改组的组合形成了巨大的蛋白质变异库，这可以开发具有所需功能和特性的蛋白质。

实施例16:使用不同的iis型限制性内切酶(不同于bsai)的versatile改组反应

在之前的实施例中，bsai用于vts反应。然而vts不限于bsai，也可以采用其他iis型限制性内切酶(表5)。然而，目的载体应当针对各个iis型限制性内切酶进行调整。

为了对此进行确认，我们利用bfuai进行vts反应(表5)。使用加尾引物生成了4个tile。引物尾部包含分别与初始编码多核苷酸序列、编码延伸序列和bfuai识别位点互补的部分(第一iis型识别位点)。将得到的pcr产物纯化，并立即用于vts反应中，在vts反应中pvtseiii充当目的载体的作用。由于bfuai识别位点以正确的顺序和方向存在于多克隆位点中并侧接阴性选择标记，因此pvtseiii可以用作目的载体。因此，此实验也表明pvtseii和pvtseiii可以用来组装改组的片段。vts反应混合物的转化得到大量的菌落，所述菌落的大部分(92％)在克隆分析后显示正确的模式。此外，4个测序的克隆全部含有完美串接的序列。

为了加强此实施例，我们还使用sapi进行了vts反应(表5)。与bfuai和bsai相比，sapi生成了3个核苷酸的突出端，但优点是其具有7个核苷酸的识别位点。使用sapi限制性内切酶对4个tile的vts组装类似于利用bfuai和bsai的vts。效率没有减小，表明3个核苷酸的突出端足以用于正确的组装。然而，与4个核苷酸的突出端相比，不得不考虑编码延伸序列的数目减小。

不同的iis型限制性内切酶的成功使用，包括具有不同的切割特性的酶，证明vts不限于bsai。全部范围的iis型限制性内切酶可以被用于vts，使得实验者有可能基于在各个tile中缺少其识别位点来选择iis型限制性内切酶。尽管这使得vts更通用，但要考虑的是，对于每种iis型限制性内切酶，不得不建立相容的目的载体。

实施例17:利用对编码延伸序列的选择杂合versatile改组和goldengate改组，所述编码延伸序列是保守的核苷酸(goldengate改组)或编码两个邻接的模块之间的接头的附加核苷酸(versatile改组)

设置此实验来验证保守的核苷酸和自由选择的核苷酸两者在vts反应期间可以同时使用。这使得能够对同源的和非同源的部分(保守的核苷酸作为编码延伸序列)进行无疤痕改组，同时还允许对通过一组选择的要被同时改组的编码延伸序列连接的非同源的部分进行无疤痕改组(添加的核苷酸作为编码延伸序列)。

第一个实施例包括therminatordna聚合酶以及dna聚合酶的环结构。therminator基于在不同变体中存在的同源区被分成7个tile，并且选择保守的核苷酸充当编码延伸序列。然而，dna聚合酶显示与terminator具有很少或没有同源性，因此，为引入此环结构，选择6个额外的核苷酸充当将的非同源的环结构连接到therminatordna聚合酶的手掌型和手指型结构域的编码延伸序列。这使得能够同时(同源)改组therminatordna聚合酶，同时允许容易地引入环结构。与仅仅使用同源dna改组可以实现的程度相比，非同源部分的引入可以大幅度地改变dna聚合酶活性、特异性和延续性。类似于上面所述的实施例，所有被分析的克隆具有正确的序列。

第二个实施例由被分成5个tile的工程化细胞内溶素组成。4个tile(pep46、link2、cbd3和ead11)构成工程化细胞内溶素编码序列并以无疤痕的方式组装(邻接的tile编码序列的编码延伸序列部分)。第五个tile是纯化标签(例如，strep、his、gst…)，并且通过6个精心选择的编码2个额外氨基酸的核苷酸连接到工程化细胞内溶素。此实验利用在工程化细胞内溶素的n-以及c-末端处的纯化标签来完成。加入纯化标签作为额外的tile带来了许多通用性，因为其使得实验者能够关于重组蛋白质来选择所使用的纯化方法。保守的核苷酸和自由选择的编码延伸序列两者的使用与常规通用反应一样有效。这通过对8个克隆的克隆分析来确认，所述8个克隆全部都显示正确的长度，并且对2个克隆的测序显示两者都具有正确的序列。

实施例18:对利用versatile改组产生的蛋白质的纯化和分析

此技术的关键是使用不同的模块之间的附加核苷酸接头，因为这使vts成为通用的改组方法，包括同源和非同源序列两者。在蛋白质水平，额外的核苷酸导致在模块之间加入额外的氨基酸。为了在蛋白质水平验证vts，除了确定额外氨基酸对得到的蛋白质的作用以外，对几个经vts生成的蛋白质进行表达、纯化和筛选。除了实施例8(其中已经显示了在乳酸乳球菌中有活性的经vts生成的蛋白质的表达)以外，在大肠杆菌中对几种经vts生成的蛋白质进行大规模(500ml)和小规模(96孔)的表达。

由在位置1上的肽1、位置2上的cbd1和在位置4上的ead12组成的工程化细胞内溶素在500ml含有卡那霉素的溶原性肉汤中表达并使用hisgravitrap柱(gehealthcare)纯化。图10显示了各个蛋白的清晰表达，而且产生的蛋白质的量与通过常规克隆法生成的类似蛋白质相同。另外，酶促和抗菌测定显示经vts产生的蛋白质是有功能活性的。

在不同的实验规程中，平行地表达、纯化和筛选96种不同的经vts生成的蛋白质。bl21-密码子+(de3)-ril细胞用各个质粒转化并以阵列的方式(96孔)接种在自诱导培养基中。培养物在37℃孵育5小时，接着在16℃孵育24小时。使用用于多孔规模的his-标签纯化的市售试剂盒(来自thermoscientific的hispur^tmni-nta旋转板)完成纯化。蛋白质收率在sds-page上显现(图11)。此外，酶促和抗菌测定显示大部分经vts生成的蛋白质是有活性的。

大规模和小规模表达两者产生了活性蛋白质，由此验证了versatile改组在蛋白质水平的有用性。蛋白质模块之间的额外氨基酸接头没有消除蛋白质三级结构、其被表达的能力或其活性，使vts成为用于产生新的重组蛋白质的有前景的方法。

实施例19:用于无疤痕组装的versatile改组。选择编码延伸序列使得它们允许进行无疤痕组装。这要求对于每个组装体，不得不根据邻接tile的序列末端来获取编码延伸序列。

vts法的主要优点是其可以用来改组前所未有的量的模块，而不依赖于它们的序列同源性。然而，在一些情况下，不同蛋白质部分之间的额外氨基酸的引入可能是不合乎需要的。在这些情况下，也可以使用vts，然而，需要调整和选择专门用于每个设想的组装体的编码延伸序列。所选择的侧接tile的编码延伸序列应当与后面的(或前面的)tile序列的起始(或结束的)核苷酸相同。这样，可以实现无疤痕组装，因为在两个邻接的tile之间没有加入间插核苷酸。然而，与常规versatile改组的通用特性相比，无疤痕组装提示，对于每个特定的组装体而言，需要设计一组新的编码延伸序列，消除了随机或组合改组的可能性。

在此实验规程中，三个tile(肽1、cbd6和ead9)以下面的方式被改组：即它们的组装是无疤痕的。编码延伸序列被选择为前面的tile的编码序列的一部分。组装的效率类似于实施例5-7。除了无疤痕组装以外，此方法也可以被用于定向诱变。在此，点突变可以下面的方式被引入tile的引物中：在串接不同的tile后，在各个编码多核苷酸序列中的预定位置处引入突变。

序列表

<110>universiteitantwerpen

universiteitgent

<120>多核苷酸改组方法

<130>tto-055

<150>gb1621589.9

<151>2016-12-19

<160>21

<170>bissap1.3.6

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse1正向引物

<400>1

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<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse1反向引物

<400>2

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse2正向引物

<400>3

gcaggtgagacctctagagg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse2反向引物

<400>4

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<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse3正向引物

<400>5

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<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse3反向引物

<400>6

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<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse4正向引物

<400>7

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<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pvtse4反向引物

<400>8

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<210>9

<211>3811

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<213>人工序列

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