本发明涉及一种发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
l-丙氨酸是一种非必需氨基酸，也是人体血液中含量最高的氨基酸，在l-丙氨酸在工业、日化、食品等领域用途广泛。在日化领域，l-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的重要原料，在食品领域，l-丙氨酸可以作为天然甜味剂对改善调味剂的味感和有机酸的酸。在医药领域，l-丙氨酸也是合成维生素b6和氨基丙醇的主要原料。
l-丙氨酸的生产工艺包括提取法、化学合成法、酶催化法和发酵法。目前工业生产上主要采用酶催化法，即通过培养富有l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd(ec4.1.1.12)活力的微生物细胞，催化l-天冬氨酸得到l-丙氨酸。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备要求简易，提取工艺简单，但野生型微生物培养生产asd需要以富马酸或谷氨酸钠为碳源，生长周期长、且培养成本高，同时主要原材料l-天冬氨酸价格高，造成其生产成本高。徐友强等通过克隆来源于睾丸酮丛毛单胞菌(comonastestosteroni)的asd基因，在一株具有l-天冬氨酸酶(aspa)生产能力的大肠埃希氏菌cicc11022s中异源表达，构建转化富马酸生产l-丙氨酸的重组工程菌，重组菌9h转化富马酸产生112.7g/l的l-丙氨酸，转化率93.8％。该方法以大escherichiacoli为酶源菌株和富马酸为底物，生产的原料成本显著降低，但是富马酸是经石油炼制生产的，其价格受困于原油价格，同时石油资源日渐短缺且不可再生。张学礼等利用基因工程手段删除l-丙氨酸合成的关键5条竞争途径，过量表达限速步骤酶l-丙氨酸脱氢酶，强化丙酮酸向l-丙氨酸的生产路径，构建大肠杆菌重组菌，以葡萄糖为原料，自来水配制培养基，发酵48h可以生产114g/ll-丙氨酸。发酵原料葡萄糖廉价易得，培养基成分简单，厌氧发酵动力消耗低，产品收率高。目前构建l-丙氨酸生产菌株的构建方法单一，涉及多条竞争路径，基因工程操作复杂。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明通过大肠杆菌发酵生产富马酸，利用天冬氨酸酶aspa转化为天冬氨酸，进一步利用l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd转化天冬氨酸生产l-丙氨酸，构建了高效生产l-丙氨酸的新型菌种。
本发明的第一个目的是提供一种大肠杆菌重组菌，所述大肠杆菌重组菌是通过在能够产富马酸的大肠杆菌中，过表达天冬氨酸酶aspa和l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸酶aspa和l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd通过核苷酸序列如seqidno.4所示的rbs1相连接。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸酶aspa编码基因aspa的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd编码基因asd的核苷酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述产富马酸的大肠杆菌为大肠杆菌cicc.23846。
在本发明的一种实施方式中，通过petac质粒串联表达所述天冬氨酸酶aspa和l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌在l-丙氨酸转运蛋白alae编码基因ygaw上游整合了组成型启动子j23119。
在本发明的一种实施方式中，所述l-丙氨酸转运蛋白alae编码基因ygaw的核苷酸序列如seqidno.3所示。
本发明的第二个目的是提供所述大肠杆菌重组菌的构建方法，所述方法具体是：
(1)使用petac质粒，以核苷酸序列如seqidno.4所示的rbs1作为连接肽，串联表达核苷酸序列如seqidno.1所示的天冬氨酸酶aspa和核苷酸序列如seqidno.2所示的l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd，构建重组质粒petac-aspa-asd；
(2)将重组质粒petac-aspa-asd导入大肠杆菌cicc.23846中；
(3)在核苷酸序列如seqidno.3所示的l-丙氨酸转运蛋白alae基因上游离整合组成型启动子j23119，再导入步骤(2)所述的重组菌中，获得重组大肠杆菌e.colip-119。
本发明第三个目的是提供一种利用所述重组大肠杆菌e.colip-119发酵生产l-丙氨酸的方法，所述方法具体是：将摇瓶种子3～5％接种量接种于发酵培养基，稀硫酸和氨水控制ph在6.8～7.2，通气量0.1～1vvm，温度34～36℃，搅拌80～120rpm，当od600达到10～15时，加入2～3g/l乳糖诱导天冬氨酸酶和l-天冬氨酸-β-脱羧酶的表达，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/l时，补加500～700g/l葡萄糖溶液，每升发酵液补加20～40g葡萄糖，共补加2～6次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。
本发明的一种实施方式中，发酵培养基成分为：初始葡萄糖60～80g/l，酵母粉4～6g/l，胰蛋白胨1～3g/l，(nh4)2so41～3g/l，k2hpo4·12h2o3～5g/l，kh2po43～5g/l，mgso4·7h2o0.4～0.6g/l，一水合柠檬酸0.2～0.4g/l，mncl2·4h2o0.06～0.1g/l。
本发明的第四个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在生产l-丙氨酸中的应用。
本发明的有益之处：
大肠杆菌做为最常用的细胞工厂，遗传背景清晰，在能够发酵生产富马酸的大肠杆菌中引入天冬氨酸酶aspa和l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd，将发酵生产的富马酸直接转化为l-丙氨酸，进一步过量表达alae强化了重组菌中l-丙氨酸的转运能力，构建了可以利用廉价葡萄糖发酵生产l-丙氨酸的高产菌株，目前该生产路径目前尚无相关报道。
附图说明
图1：petac-aspa-asd共表达质粒的构建。
具体实施方式
下述实施例中，都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。
下述实施例中，大肠埃希氏菌(escherichiacoli)为出发菌株，购自于cicc，编号23846，也适用于其他可以生产富马酸的大肠杆菌。
氨基酸检测采用常规的高效液相色谱检测。
天冬氨酸酶aspa酶活检测：将27ml浓度约为180g/l的富马酸氨水(ph＝8.5)溶液37℃预热，分别称取0.5g左右的湿菌体于250ml锥形瓶中，加入0.09gctab粉末和2.5ml离子水，加入预热的转化液中，保鲜膜封口后置于37℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。
l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd酶活检测：将15ml浓度为30g/l的天冬氨酸溶液(用氢氧化钠溶液调节ph7.0)37℃预热，分别称取1g左右诱导12h的湿菌体于250ml锥形瓶中，加入0.09gctab粉末和14ml去离子水，加入预热的转化液中，保鲜膜封口后置于37℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。
酶活力单位(u)：每分钟生产1μmol产物所需要的酶量定义为1个酶活单位。
葡萄糖测定方法：使用sba-40生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行分析。
生产强度的计算：生产强度(g/l/h)＝l-丙氨酸产量(g/l)/发酵时间(h)。
实施例1：双酶共表达菌株的构建
(1)使用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌k12和睾丸酮丛毛单胞菌的基因组dna；
(2)使用表1中引物aspa-up和aspa-down从大肠杆菌基因组dna中克隆得到aspa基因，使用saci和noti双酶切连接于表达载体petac,得到petac-aspa；
(3)根据rbs强度与所调控蛋白表达量在统计学上的线性关系，设计rbs1、rbs2、rbs3、rbs4调节两酶的表达强度，使用引物asd-up1和asd-down、asd-up2和asd-down、asd-up3和asd-down、asd-up4和asd-down从睾丸酮丛毛单胞菌的基因组dna中克隆得到asd基因；
(4)将上述克隆得到的4段asd基因测序正确后，使用hindiii和noti双酶切，分别连接于petac-aspa质粒得到petac-aspa-asd(如图1)，将质粒热击转化于大肠埃希氏菌cicc23846，得到重组菌株e.colipad；
(6)上述4株工程菌株使用lb培养基(100mg/l硫酸卡那霉素)，35℃培养10h，按照4％接种量接种于摇瓶发酵培养基中，od600＝2.0时加入2g/l乳糖，继续培养，当葡萄糖消耗尽结束发酵，离心检测上清液中l-丙氨酸产量，收集菌泥检测酶活；
发酵培养基成分：初始葡萄糖60g/l，酵母粉3g/l，胰蛋白胨1g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo4·12h2o4g/l，kh2po44g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，一水合柠檬酸0.3g/l，mncl2·4h2o0.08g/l。
(7)l-丙氨酸产量和酶活检测如结果如表2，在相同培养条件下，两基因间为rbs1序列时l-丙氨酸产量最高为37.6g/l，发酵结束时aspa和asd酶活分别为301u/g和478u/g。
表1共表达质粒构建使用引物
表2重组菌发酵生产l-丙氨酸
实施例2：高产l-丙氨酸大肠杆菌的构建
利用red同源重组的原理在ygaw基因组上游加入组成型启动子j23119(bba23119)，强化alae蛋白表达，促进l-丙氨酸由胞内转化至胞外。
(1)利用软件primerpremier5设计同源重组引物(如表3)，以kan-s、kan-a为引物，pkd4为模板，扩增kan基因，以ygaw-s、ygaw-a为引物，大肠杆菌k12基因组为模板，扩增ygaw基因，采用融合pcr得到kan+ygaw片段，连接至pmd19进行基因测序；
(2)以119-s和ygaw-a为引物，连接测序正确kan+ygaw片段的pmd19质粒为模板，pcr得到带有同源臂、j23119启动子、kan基因的敲除框；
(3)将pkd46质粒导入大肠杆菌cicc23846中，制备电击感受态细胞，将敲除框片段电击转化于感受态细胞进行同源重组，筛选得到带有kan抗性的阳性克隆菌株；
(4)带有kan抗性的阳性克隆菌株43℃培养后使其丢失pkd46质粒，制备电击感受态细胞，电击转化质粒pcp20。转化液涂布于含有氨苄青霉素的lb平板，30℃培养12h，筛选阳性转化子。
(5)转化子再转入43℃培养12h筛选氨苄青霉素和卡那霉素抗性同时缺失的重组菌，此时j23119启动子整合成功，将实施例1中构建共表达质粒petac-aspa-asd(rbs1)导入重组菌，得到l-丙氨酸生产菌株e.colip-119
(6)将上述工程菌株e.colipadrbs1和e.colip-119按照实施例1中的方式培养，发酵结束检测发酵液中l-丙氨酸含量，发酵48h，e.colip-119生产l-丙氨酸49.8g/l，相比于e.colipadrbs1的37.6g/l提高了32.4％。
表3ygaw基因构建j23119启动子使用引物
实施例3：e.colip-119发酵生产l-丙氨酸
种子培养基成分：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5.0g/l，mgso4·7h2o1.0g/l。
发酵培养基成分：初始葡萄糖70g/l，酵母粉5g/l，胰蛋白胨2g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo4·12h2o4g/l，kh2po44g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，一水合柠檬酸0.3g/l，mncl2·4h2o0.08g/l。
从斜面挑取适量e.colip-119接种于种子培养基中，35℃，200rpm振荡培养10～12h，摇瓶种子按照10％接种量接种于发酵罐中，5l发酵罐中培养基装液量为3l，稀硫酸和氨水控制发酵ph为6.8～7.2，通气量0.5vvm，温度35℃，搅拌100rpm，当od600达到25～30时，加入2g/l乳糖诱导天冬氨酸酶和天冬氨酸-β-脱羧酶表达，当葡萄糖浓度低于10～15g/l时，补加600g/l葡萄糖溶液，每升发酵液补加60g葡萄糖，共补加2次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。
结果：发酵45h，l-丙氨酸产量达到122.0g/l，糖酸转化率64.2％。
实施例4：重组菌株e.coliδ5d2发酵生产l-丙氨酸
种子培养基成分：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5.0g/l，mgso4·7h2o1.0g/l。
发酵培养基成分：初始葡萄糖70g/l，酵母粉5g/l，胰蛋白胨2g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo4·12h2o4g/l，kh2po44g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，一水合柠檬酸0.3g/l，mncl2·4h2o0.08g/l。
从斜面挑取适量e.colip-119接种于种子培养基中，35℃，200rpm振荡培养10～12h，摇瓶种子按照4％接种量接种于发酵罐中，5l发酵罐中培养基装液量为3l，稀硫酸和氨水控制发酵ph为6.8～7.2，通气量0.5vvm，温度35℃，搅拌100rpm，当od600达到10～15时，加入2g/l乳糖诱导天冬氨酸酶和天冬氨酸-β-脱羧酶表达，当葡萄糖浓度低于10～15g/l时，补加600g/l葡萄糖溶液，每升发酵液补加30g葡萄糖，共补加4次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。
结果：发酵45h，l-丙氨酸产量达到147g/l，糖酸转化率79.0％，实现l-丙氨酸的高效生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌及其应用
<160>16
<170>patentinversion3.3
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<213>人工序列
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