本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组及试剂盒。
背景技术：
裂谷热(riftvalleyfever，rvf)是由裂谷热病毒(riftvalleyfevervirus，rvfv)引起的一种人兽共患病，是由节肢动物传播的发热性、急性传染病，主要通过蚊媒传播，也可通过气溶胶和接触传播，主要宿主是绵羊、山羊和牛，其流行特征是妊娠动物出现出现急促流产，幼小动物的死亡率高，同时伴有人群的发病和死亡。该病流行于非洲和阿拉伯半岛地区，流行常伴随着特大降雨的周期循环，较少发生在半干旱地区，或者较频繁发生在较大雨量的草原地区，病变特征为肝损伤。who已将其列为生物战剂之一，世界动物卫生组织(oie)将其列为a类疫病。
裂谷热病毒归属布尼亚病毒科白蛉热病毒属，有囊膜，呈球形，直径为90～100nm，表面有糖蛋白突起，其核酸位于病毒的核衣壳内，为单股负链rna。裂谷热病毒为一种单一血清型的病毒，具有布尼病毒的典型形态学和理化特性。病毒有囊膜，直径90～110nm，呈球形，表面有清楚的糖蛋白突起，突起直径长10mm。病毒核酸位于病毒的核衣壳内，为单股负链rna，rna可分为l(大)、m(中)、s(小)三个节段。其中的s节段为双意义的rna，即具有双定向编码功能，编码n蛋白和另外一种非结构蛋白(ns)；m节段编码g1与g2两种外膜糖蛋白和两种非结构蛋白qnsm，大小分别为14kd和78kd)，g1和g2糖蛋白都能刺激机体产生抗体，但在体内只有g2能刺激机体产生中和抗体；l节段编码l蛋白，l蛋白具有病毒转录酶的功能。病毒粒子不含基质蛋白。该病毒只有一种血清型，目前还未发现裂谷热病毒的分离株和实验室传代株的特异性抗原差异。此病毒对脂溶剂和热敏感，56℃40分钟可灭活。
近年来，由于国际合作的加深，各国间贸易往来频繁，旅行者数量逐年递增，这些都增大了裂谷热传入我国的可能性。因此，在国境口岸建立该病毒的快速检验方法，并应用于口岸裂谷热病毒的监测工作，对防治该病传入我国具有重要意义。
目前诊断裂谷热病毒的方法有病毒分离法、血清学诊断法如血凝抑制试验、病毒中和试验以及酶联免疫吸附法。但是这些方法或是需操作活病毒，或是操作复杂、费时、费力，或是敏感度不够高，不能在早期得出诊断结果。近年来，发展起来的分子生物学方法如聚合酶链式反应(rt-pcr)以及等温核酸技术中的rt-lamp法已经建立起来，并且在裂谷热病毒的检测上已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。以rt-pcr技术为代表如多重rt-pcr、rt-巢式pcr以及实时定量rt-pcr以其高度的特异性及敏感性在裂谷热病毒检测方面取得了重大的突破。但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。等温核酸技术中的rt-lamp方法克服了rt-pcr技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点。但是，rt-lamp技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，假阳性率也比较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组及试剂盒。本发明提供的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，使用该试剂盒能在15min内检测出裂谷热病毒rna。
本发明提供了raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述探针为在seqidno.3所示核苷酸序列的第28位碱基修饰荧光报告基团、第29位碱基替换为四氢呋喃残基和第30位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。
优选的是，所述荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5。
优选的是，所述荧光淬灭基团包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。
本发明还提供了一种raa荧光法检测裂谷热病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组。
优选的是，所述的探针使用浓度为0.01～0.03mm。
优选的是，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立地为0.02～0.05mm。
优选的是，所述试剂盒还包括raa基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。
优选的是，所述反应缓冲液包括：使用浓度为500mmph值为7.4的tris-hcl缓冲液、240mm的mgac和质量分数为10％的peg10000。
优选的是，所述试剂盒还包括：阴性质控品和阳性质控品；
所述阴性质控品为ddh2o或纯化水；
所述阳性质控品为裂谷热病毒重组dna质粒。
本发明提供了raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组。本发明提供的引物探针组能够实现裂谷热病毒的快速准确鉴定，操作简便，检测时间短，特异性高达100％。试验结果表明，本发明提供的引物探针组只需15min内即可完成，无需通过高温使dna解旋，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测，检测快速、灵敏，特异性好，无假阳性；对未来检测裂谷热病毒传播具有非常重要的意义，具有很大的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的不同浓度质粒dna灵敏度检测结果图；
图2为本发明实施例3提供的裂谷热病毒质粒dna重复性检测结果图；
图3为本发明实施例4提供的裂谷热病毒的特异性检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述探针为在seqidno.3所示核苷酸序列的第28位碱基修饰荧光报告基团、第29位碱基替换为四氢呋喃残基和第30位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。
在本发明中，所述上游引物的核苷酸序列seqidno.1为5’-cattttcatcatcatcctcckgggcttrttg-3’；所述下游引物的核苷酸序列seqidno.2为5’-garctcytaaagcagtatggtggggctgact-3’；本发明对所述上游引物和下游引物的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行人工合成即可，如生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明所述探针为在seqidno.3所示核苷酸序列的第28位碱基修饰荧光报告基团、第29位碱基替换为四氢呋喃残基和第30位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。在本发明中，所述探针在修饰前，即seqidno.3所示的核苷酸序列为5’-gggagaaggatgccaagaaaatgattgttctggctctractcgtg-3’。在本发明中，所述荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5，更优选为fam或hex；所述淬灭基团包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl，更优选为bhq1或bhq2；本发明对不同的荧光报告基因和淬灭基团的组合没有特殊的限定，上述荧光报告基团和猝灭基团进行组合都可以达到相同的效果，本发明对荧光检测的仪器没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的相应荧光检测用仪器即可，如当所述荧光报告基团为fam，所述荧光猝灭基团为bhq1时，采用无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的raa-f1620荧光基因检测仪进行检测。
本发明所述修饰后得到探针的序列为：
5’-gggagaaggatgccaagaaaatgattgt(bhq1-dt)(thf)(fam-dt)ggctctractcgtg-3’，其中，fam为荧光报告基团，bhq1为荧光淬灭基团，thf为四氢呋喃残基。本发明对所述引物和探针的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行合成即可。
本发明还提供了raa荧光法检测裂谷热病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组。本发明对所述引物和探针在试剂盒中的储存浓度没有特殊的限定。在本发明中，所述的探针使用浓度为0.01～0.03mm，更优选为0.02mm。在本发明中，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立地为0.02～0.05mm，更优选独立地为0.03mm。
在本发明中，所述试剂盒还包括raa基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。在本发明中，所述raa基础荧光通用反应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉；在本发明的实施例中，所述raa基础荧光通用反应试剂的来源可以为江苏奇天基因生物科技有限公司、商品货号为f00001的市售商品，raa基础荧光通用反应试剂的反应规格为50μl，使用前应用反应缓冲液进行重溶。在本发明中，所述raa基础荧光通用反应试剂也可根据raa荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为raa基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。本发明对所述反应缓冲液在试剂盒中的储存浓度没有特殊的限定；所述反应缓冲液包括：使用浓度为500mmph值为7.4的tris-hcl缓冲液、240mm的mgac和质量分数为10％的peg10000。本发明中，所述tris-hcl缓冲液、mgac和peg10000的浓度均为终浓度。本发明对所述tris-hcl缓冲液、mgac和peg10000的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明实施例中所述tris-hcl、和peg10000的购自sigma-aldrich，mgac购自国药沪试。
在本发明中，所述试剂盒还包括：阴性质控品和阳性质控品；
所述阴性质控品为ddh2o或纯化水；
所述阳性质控品含为裂谷热病毒重组dna质粒，所述裂谷热病毒重组dna质粒的浓度为1.0×103～1.0×106copies/μl。在本发明中，所述阳性质控品的使用浓度更优选为1.0×104～1.0×105copies/μl，最优选为1.0×105copies/μl。本发明所述阳性质控品优选通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。本发明所述阳性质控品还能用作灵敏度实验的阳性标准品，通过调节阳性质控品的浓度，实现灵敏度的检测，当所述阳性质控品用作阳性标准品时，所述阳性标准品的浓度优选调整为1.0×100～1.0×1010copies/μl备用。
本发明所述试剂盒用于检测裂谷热病毒，在本发明中，所述试剂盒的使用方法，优选包括如下步骤：
(1)提取待测样品(疑似裂谷热病毒)的rna；本发明所述提取的方法优选采用市售商品化的病毒核酸提取试剂，按说明书进行操作，或采用西安天隆的核酸自动提取仪，或西安天隆的配套核酸提取试剂进行rna的提取；提到得到的rna在-20℃保存备用；
(2)将检测仪器raa-f1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39℃，反应时间：20min。
(3)将提取得到的rna进行体外反转录；在本发明中，反转录酶优选为promegam-mlv(200u/μl)或takaram-mlv(200u/μl)，体外反转录过程中加入反转录酶的量按不同厂家的说明书中的推荐使用量。具体地，本发明直接在每个raa基础荧光通用反应试剂中加入反转录酶0.2～0.6μl，优选加入0.4μl；直接实现rt-raa反应；
(4)在42.6μl反应缓冲液中加入1μl探针和1μl引物，0.4μl反转录酶充分混合后添加到raa基础荧光通用反应试剂中混合；得到反应混合液；
(5)将5μl所述步骤(1)中得到的待测样品与所述步骤(4)中得到的反应混合液充分混合，得到的反应体系进行放入检测仪器raa-f1620进行检测荧光信号；
(6)根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值k≥20时，判定为阳性。斜率值k＜20时判定为阴性。
在本发明中，所述待测样品为有可能含有裂谷热病毒的样本，本发明对待测样本的提取方法没有特殊的限定，采用质粒dna或病毒rna的常规提取方法即可。
在本发明中，所述实时raa荧光法反应条件优选为：反应温度30～42℃，反应时间5～20min，针对荧光实时荧光更优选39℃，反应时间20min。
本发明提供的试剂盒检测裂谷热病毒时与其他虫媒传染病乙脑、登革热病、黄热、马尔堡无交叉反应，具有特异性强，特异性达100％。灵敏度高，每反应检测灵敏度达到为10copies。且本发明提供的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。
下面结合具体实施例对本发明所述的raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
本发明提取裂谷热病毒样本rna进行验证，根据基因名称裂谷热病毒(riftvalleyfevervirus，rvfv)，在genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用dnastar软件进行同源性分析和b1ast序列分析，筛出裂谷热病毒高度保守序列如seqidno.4所示：gttgatgagagcctccacagttgctttgccttctttcgacattttcatcatcatcctccggggcttgttgccacgagtcagagccagaacaatcattttcttggcatccttctcccagtcagccccaccatactgctttaagagttcgataaccctacgagcatcaaacccttgataagcaaactctcggacccact。
本发明依据高度保守序列作为检测的目的基因，合成裂谷热病毒重组dna质粒并设计引物探针。
根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成裂谷热病毒重组dna质粒，质粒大小197bp；
1引物探针设计
根据raa技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，最终确定的：
上游引物序列5’-cattttcatcatcatcctcckgggcttrttg-3’；
下游引物序列5’-garctcytaaagcagtatggtggggctgact-3’；
未修饰的探针为：
5’-gggagaaggatgccaagaaaatgattgttctggctctractcgtg-3’。
2选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团
根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的raa-f1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为fam荧光，因此荧光修改基团选为fam，荧光淬灭基团选为bhq1。
3所述探针的修饰方法包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数28bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离5'端碱基数30bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基c，该碱基用四氢呋喃残基替换。经过修饰的探针为：5’-gggagaaggatgccaagaaaatgattgt(bhq1-dt)(thf)(fam-dt)ggctctractcgtg-3’；
其中，fam为荧光报告基团，bhq1为荧光淬灭基团，thf为四氢呋喃残基。
4引物探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
5裂谷热病毒重组dna质粒阳性标准品制备
裂谷热病毒重组dna质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备成1.0×100copies/μl～1.0×1010copies/μl备用。
6组成试剂盒
本发明试剂盒包括raa基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品，引物和探针；
上游引物和下游引物的浓度独立为0.04mmol/l。
探针的浓度为0.03mmol/l。
raa基础荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为f00001。raa基础荧光通用反应试剂的反应规格为50μl，使用前应用反应缓冲液进行重溶。
重溶raa基础荧光通用反应试剂的反应缓冲液包括以下含量的组分：浓度为500mmol/l的tris-hcl(ph7.4)缓冲液、浓度为240mmol/l的mgac和质量分数为10％的peg10000。
阳性质控品：含有裂谷热病毒重组dna质粒，所述裂谷热病毒重组dna质粒的浓度为1×105copies/μl。
阴性质控品：ddh2o。
实施例2
灵敏度实验
上游引物：
5’-cattttcatcatcatcctcckgggcttrttg-3’；
下游引物：
5’-garctcytaaagcagtatggtggggctgact-3’。
探针序列为：
gggagaaggatgccaagaaaatgattgttctggctctractcgtg
荧光报告基团采用fam，荧光淬灭基团采用bhq1；
修饰后的探针为：
gggagaaggatgccaagaaaatgattgt(bhq1-dt)(thf)(fam-dt)ggctctractcgtg；
试剂盒组成如表1所示：
表1试剂盒成分表
裂谷热病毒重组dna质粒阳性标准品制备好的不同浓度的工作标准品，分别为：
工作标准品(阳性质控品)1，含有1.0×106copies/μl裂谷热病毒重组dna质粒。
工作标准品(阳性质控品)2，含有1.0×105copies/μl裂谷热病毒重组dna质粒。
工作标准品(阳性质控品)3，含有1.0×104copies/μl裂谷热病毒重组dna质粒。
工作标准品(阳性质控品)4，含有1.0×103copies/μl裂谷热病毒重组dna质粒。
工作标准品(阳性质控品)5，含有1.0×102copies/μl裂谷热病毒重组dna质粒。
工作标准品(阳性质控品)6，含有1.0×101copies/μl裂谷热病毒重组dna质粒。
实施方法：
1反应缓冲液的配制
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取301μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入16μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引物的浓度为0.05mmol/l)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
2raa荧光基础反应试剂重溶
准备7个raa荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液45μl分别加入到准备好的7个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为raa反应体系。
3、加样反应
在以上7个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、5μl工作标准品6、5μl工作标准品5、5μl工作标准品4、5μl工作标准品3、5μl工作标准品2、5μl工作标准品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。
将反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图1所示。结果显示最快5分钟明显有扩增，15分钟内所有标准工作品均有扩增，最低灵敏度可以达到1.0×101copies/μl，表明本发明灵敏度高，检测时间短。
实施例3
重复性实验
引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。
试剂盒组成如表2所示：
表2试剂盒成分表
反应缓冲液配制：
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取173μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入8μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引物的浓度为0.04mmol/l)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
2raa荧光基础反应试剂重溶
准备4个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的4个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为raa反应体系，并做好标记。
3、加样反应
在以上4个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、其他3个反应管中分别加入5μl阳性质控品；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。
将混匀的4个反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图2所示。结果显示扩增反应重复性好。
实施例4
特异性实验
引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。
试剂盒组成如表3所示：
表3试剂盒成分表
特异性实验中样本来源：乙脑、登革热病、黄热、马尔堡。
其中乙脑、登革热病样本由浙江国际旅行保健中心提供，并通过西安天隆全自动核酸提取仪提取病毒rna，黄热病毒rna从黄热疫苗中提取所得、马尔堡质粒dna由中国疾病预防控制中心病毒病所提供。裂谷热使用质粒dna。
实施方法：
1反应缓冲液的配制
样本rna反应缓冲液配制：从试剂盒中反应缓冲液管里吸取127.8μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入6μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.03mmol/，引物的浓度为0.05mmol/l)，再加入1.2μlpromegam-mlv(200u/μl)反转录酶，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液1。
dna反应缓冲液配制：从试剂盒中反应缓冲液管里吸取130μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入6μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.03mmol/，引物的浓度为0.05mmol/l)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液2。
2raa荧光基础反应试剂重溶
准备3个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液2分别加入到准备好的3个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为raa反应体系，并做好标记。
另准备3个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液1分别加入到准备好的3个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为rt-raa反应体系，并做好标记。
3、加样反应
在以上3个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、5μl马尔堡质粒dna、5μl阳性质控品；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。在以上3个配制好的rt-raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl乙脑病毒rna、5μl登革热病病毒rna、5μl黄热病毒rna为模板，每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。
将混匀的6个反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图3所示。结果显示只有裂谷热质粒dna有扩增，为阳性，其他样本如马尔堡质粒dna、乙脑病毒rna、登革热病病毒rna、黄热病毒rna及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。表明本发明提供的检测方法特异性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>浙江国际旅行卫生保健中心（浙江出入境检验检疫局口岸门诊部）
江苏奇天基因生物科技有限公司
<120>raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组及试剂盒
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cattttcatcatcatcctcckgggcttrttg31
<210>2
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
garctcytaaagcagtatggtggggctgact31
<210>3
<211>45
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gggagaaggatgccaagaaaatgattgttctggctctractcgtg45
<210>4
<211>197
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gttgatgagagcctccacagttgctttgccttctttcgacattttcatcatcatcctccg60
gggcttgttgccacgagtcagagccagaacaatcattttcttggcatccttctcccagtc120
agccccaccatactgctttaagagttcgataaccctacgagcatcaaacccttgataagc180
aaactctcggacccact197