本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法。
背景技术：
尤文肉瘤家族肿瘤(ewingsarcomafamilyoftumors，esft)是一组低分化且高度恶性的小圆细胞肿瘤，包括尤文肉瘤(ewingsarcoma，es)、askin瘤和原始神经外胚层肿瘤(primitiveneurotodermaltumour，pnet)。患者中位年龄为15岁，超过半数患者为青少年。每年15岁以下儿童的esft发病率为3人/百万人，且诊断时发现已伴有肺、骨等其他部位转移的患者约占30％。
目前，在esft患者中发现了7种染色体易位现象，而t(11；22)(q24；q12)易位，即位于11号染色体q24上的fli1基因与22号染色体上的ews基因发生融合,产生的融合蛋白ews-fli1约占esft染色体易位的85％。染色体断裂位点不同可以产生不同的融合亚型，通常单个esft患者中只表达一种亚型。目前已经发现ews-fli1有12种不同的融合亚型，其中最常见的2种亚型是ews基因的7号外显子分别与fli1基因的7号外显子(ⅰ型融合)和6号外显子(ⅱ型融合)(根据人类基因组参考hg38)组成，各占整个ews-fli1融合基因比例的60％和25％。
ews基因位于22号染色体上，由17个外显子组成，编码一种多功能蛋白。ews蛋白的5’氨基末端是转录引导区域，3’羧基末端是rna结合区，在基因表达、细胞信号调节以及rna的加工处理和运输等方面发挥重要作用。fli1基因位于11号染色体上，由9个外显子组成，编码一种转录因子。fli1蛋白5’氨基末端是转录活性区域，3’羧基末端是dna结合区，主要功能是在促进细胞增殖和肿瘤发生等方面。融合蛋白ews-fli1是ews的5’端与fli1的3’端发生融合，形成了由ews转录活性区与fli1的dna结合区反常连接的融合蛋白。融合蛋白ews-fli1没有稳定的结构，5’端相对有序，主要由螺旋-转角-螺旋构成；而3’端含有多个芳香族氨基酸残基的重复多肽，构成了ews-fli1的无序区域，这种无序结构有利于与其他转录因子的结合和分离。
目前在临床上,对ews-fli1融合基因的检测主要是运用探针荧光原位杂交技术(fish)，特异性的检测出尤文氏肉瘤相关基因ewsr1基因的断裂分离情况，从而为尤文氏肉瘤的临床诊断提供辅助判断依据。但是fish检测耗时长、探针成本较为昂贵且需要经过专业培训的技术人员进行较为繁琐的操作、结果判读耗时且存在主观误差等。
技术实现要素：
本发明提出一种用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法，利用该试剂盒可实现对融合基因ews-fli1的检测，操作方法较为简便，且检测结果客观准确。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对，包括：
用于融合基因ews-fli1i型融合的如seqno.1序列所示的正向引物ews_f、如seqno.2序列所示的反向引物fli1_exon7&8r；和
用于融合基因ews-fli1ii型融合的如seqno.1序列所示的正向引物ews_f、如seqno.4序列所示的反向引物fli1_exon6&7r。
本发明还提供了一种用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的探针，包括：用于融合基因ews-fli1i型融合的如seqno.3序列所示的探针prfam7&7r以及用于融合基因ews-fli1ii型融合的如seqno.5序列所示的探针prcy7&6，其中所述探针带有发光基团，所述发光基团为fam或cy。
本发明提供了一种用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的试剂盒，包括如上述技术方案所述的引物对和如上述技术方案所述的探针。
本发明还提供了一种利用如上述任一项技术方案所述的试剂盒对肿瘤融合基因ews-fli1进行的两步检测法，包括以下步骤：
从肿瘤组织中提取totalrna,对其进行反转录，得到反转录产物cdna；
利用试剂盒中对应的正向引物、反向引物和探针分别制备反转录产物的ews-fli1i型融合的pcr反应液和ews-fli1ii型融合的pcr反应液，同时制备各自的阴性对照的pcr反应液；
对上述三种pcr反应液分别进行taqman探针定量pcr反应，得到反转录产物中ews-fli1i型融合和ews-fli1ii型融合的循环交叉点。
作为优选，对样品进行反转录包括以下步骤：
利用所述样品配制rna-primermix，混匀后进行短暂离心，于65℃将rna变性5min后立即放置冰上；
利用rna变性后的rna-primermix配制反转录反应液，混匀后短暂离心，于50℃孵育1h；
待孵育结束后，70℃灭活处理15min，最后-20℃保存反转录产物。
作为优选，利用所述样品配制rna-primermix包括在预冷的rnasefree的反应管内加入以下试剂至总体积13μl，具体为：
作为优选，利用rna变性后的rna-primermix配制反转录反应液包括在rna-primermix反应管内加入以下试剂至总体积20μl，具体为：
作为优选，反转录产物的ews-fli1i型融合的pcr反应液具体配制如下：
作为优选，反转录产物的ews-fli1ii型融合的pcr反应液具体配制如下：
作为优选，pcr反应具体如下：
95℃预变性10min；然后40个循环,95℃变性10sec，60℃退火30sec后，72℃延伸1sec；最后再40℃冷却10sec。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供了一种用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的试剂盒，该试剂盒中包含有分别用于检测ews-fli1i型融合和ii型融合的正向引物、反向引物和探针，其可有针对性的对其进行检测。结合两步法rt-qpcr可实现对融合基因ews-fli1的定量检测，操作方法较为简便，且检测结果客观准确。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的a673cdna和z63cdna的含量检测图；
图2为本发明实施例所提供的z63肿瘤totalrnaqc结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
材料说明：
模板cdna:本实施例提供的样本为从肿瘤组织或细胞中提取的totalrna反转录而成的cdna，但由于尤文肉瘤的发病率很低,极难得到样品,因此，本实施例中使用尤文肉瘤细胞系a673（
1、样品反转录
反转录采用thermofishersuperscriptiiireversetranscriptase试剂盒，具体步骤包括：
1)融解反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，进行短暂离心后放置冰上待用；
2)在冰上配制rna-primermix：在预冷的rnasefree的反应管内加入以下试剂至总体积13μl：
3)rna变性：混匀rna-primermix后短暂离心，于65℃孵育5分钟立即放置于冰上；
4)在冰上配制反转录反应液：在rna-primermix反应管内加入以下试剂至总体积20μl：
5)反转录反应：混匀反转录反应液后短暂离心，于50℃孵育1h；
6)灭活并保存反转录产物：反应结束后，70℃灭活处理15min，最后-20℃保存反转录产物。
2、反转录产物taqman探针定量pcr实验(
1)pcr反应用试剂前处理
将
2)配制反转录产物pcr反应液
在冰上分别配制ews-fli1i型融合的pcr反应液和ews-fli1ii型融合的pcr反应液，具体如下：
ews-fli1i型融合pcr反应液总体积10μl：
ews-fli1ii型融合pcr反应液总体积10μl：
同时，设计了ntc(notemplatecontrol)作为阴性对照，即在反应中用水来代替模板cdna，其它试剂不变，从而质控体系是否有污染。
其中，正向引物、反向引物和探针的序列具体如下：
正向引物ews_f：5’-atcctacagccaagctccaa-3’
用于ews-fli1i型融合的反向引物fli1_exon7&8r:
5’-ccaaggggaggacttttgtt-3’
用于ews-fli1i型融合的探针prfam7&7r:
5’-ataagaagggttctgctgcccgt-3’
用于ews-fli1ii型融合的反向引物fli1_exon6&7r:
5’-gaagggtcttctttgacactc-3’
用于ews-fli1ii型融合的探针prcy7&6:
5’-gcagcagagttcactgctggcc-3’
上述探针均带有fam或cy的发光基团。
迅速将上述pcr反应液混匀，并加入96或者说384孔的反应平板中。
3)将上述反应平板进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部；
4)pcr反应：95℃预变性10min；然后40个循环,95℃变性10sec，60℃退火30sec后，72℃延伸1sec；最后再40℃冷却10sec。
3、试验结果及分析
如图1所示，当我们使用十倍稀释的从1μgtotalrna反转录得到的cdna作为模板,采用两步法rt-qpcr可准确测得作为ews-fli1i型融合的阳性对照a673(
序列表
<110>青岛普泽麦迪生物技术有限公司
<120>用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atcctacagccaagctccaa20
<210>2
<211>20
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ccaaggggaggacttttgtt20
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<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ataagaagggttctgctgcccgt23
<210>4
<211>21
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gaagggtcttctttgacactc21
<210>5
<211>22
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gcagcagagttcactgctggcc22