gcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccct catgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaact ggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtg gtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccat cccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgataccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttctt cctctacagcgatctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgagg ctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
[0077]鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列（序列号7)
[0078] METDTLLLWVLLLWVPGSTG
[0079] 鼠kappa链的前导肽序列核酸序列（序列号8)
[0080] atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt
[0081] 2.双特异性抗体基因克隆
[0082] 选择pCHOl. 0作为表达载体去克隆和表达抗⑶19的重链和轻链基因，pCHOl. 0-潮 霉素表达载体是通过用潮霉素抗性基因替换PCH01. 0载体中的嘌呤霉素基因改造而来，被 选择用来克隆和表达抗-CD3的ScFv-Fc融合基因。表1中的引物根据克隆方案设计好 后，发送到苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。以表1中的引物进行PCR扩增，模板 为早期实验中基因合成或亚克隆到PCDNA3. 1或pUC57上的基因质粒，PCT/CN2012/084982 专利有详细描述，然后分别将抗-CD19重、轻链分别构建到pCHOl.O的表达载体上，将 抗-⑶3ScFv-Fc构建到pCHOl. 0-潮霉素的表达载体上。
[0083] 表1.双特异性抗体基因克隆中使用的引物
[0084]
【主权项】
1. 双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该 轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细胞表面抗原是 ⑶19、⑶20、⑶30和⑶133,更优选地该肿瘤细胞表面抗原是⑶19 ;和（b)单链单元，为融合 肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段， 其中该融合肽针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细胞；优选地，该融合肽对免疫 细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。
2. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单链单元的CH2结构域位于 ScFv片段和CH3结构域之间。
3. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述单链可变片段由轻链可变 区和重链可变区结构域组成，它们都靶向于抗原表位CD3。
4. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：在所述单价单元中，轻链通过二 硫键与重链结合；所述重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。
5. 权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单价单元包括针对人源CD19的抗体 抗-CD19 ; 优选地，所述的抗-CD19重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-CD19的 轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述的抗-CD3 ScFv-Fc的氨基酸序 列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-CD19重链在227位点上的半胱氨酸与抗-CD19 的轻链218位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-⑶19重链在233和236位 点上的半胱氨酸与抗-CD3 ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式 连接，所述的抗-⑶19重链在399和416位点上与抗-⑶3 ScFv-Fc的428和397位点上形 成盐桥连接，所述的抗-⑶19重链在373位点上与抗-⑶3 ScFv-Fc的436位点上形成隆 突-入-穴连接。
6. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元中的重链包含人 或者人源化的Fc片段，优选地，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段；所述融合肽的Fc片 段包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
7. 根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元的人IgG Fc段和 所述单链单元的IgG Fc通过盐桥和隆突-入-穴结构连接。
8. 制备权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，所述的方法 包括步骤： (1) 分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表 达载体上； (2) 将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清； (3) 将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述的细胞是CHO-S细胞； 或者优选地，所述的分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域 的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓 缩置换缓冲液PBS。
9. 根据权利要求8所述的方法，所述的第一表达载体是pCHOl. 0 ;所述的第二表达载体 是是pCHOl.O-潮霉素。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法的步骤（1)中： 所述单价单元为抗^：019抗体，扩增其轻链所用引物为1(〇231^出(3〇1?^，]\0(-前导序 列（EcoRV)F，AC19-VL Fl，hIgK(PacI)R，通过重叠 PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及 酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II)F，K-前导序 列（AvrII)F, AC19-VH Fl，hlgGl (sbfl) R，通过重叠 PCR扩增将将Kozak序列、前导序列及 酶切位点AvrII与BstZ17I引入重链；扩增好的轻链基因片段与用EcoR V与PacI酶切 过的pCHOl. 0表达载体进行同源重组，获得装入抗-⑶19轻链的表达载体；然后用AvrII 与BstZ17I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-⑶19的pCHOl.O表达载体，质粒命名为 pCHOL O-抗-CD19-HL-KKW ; 所述单链单元为抗-⑶3 ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak (Avr II) F，L2K-VH(MK) Fl，hlgGl (sbfl) R，将 Kozak 序列、前导序列及酶切位点 AvrII 与 BstZ17I 引 入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHOl.O-潮霉素表达载体进行同源重组，获 得装入抗-CD3ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHOl. O-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。
11. 权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制 备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗 CD19特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达CD19细胞。
12. 权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制备的 双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞 系中筛选用于治疗表达CD19特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表达 CD19特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物的药效。
【专利摘要】本发明提供了一种双特异性抗体、其制备方法及用途。本申请的双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单价单元对肿瘤细胞表面抗原CD19具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(ScFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途。
【IPC分类】C12N15-85, C07K16-30, A61P35-00, C07K16-46, A61K39-395
【公开号】CN104592393
【申请号】CN201510031737
【发明人】周鹏飞, 王涛, 刘杨, 刘勇, 罗振, 范克索
【申请人】武汉友芝友生物制药有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月21日