r>[0036] 图13是CH0细胞株K70E10-1D6表达的抗体的亲和力检测；
[0037] 图14是CH0细胞株K70E10-1D6表达的抗体抑制乳腺癌细胞MCF7的生长。
【具体实施方式】
[0038] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0039] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0040] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0041] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress,1989andThirdedition,2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSIN MOLECULARBIOLOGY,Johnffiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates；theseries METHODSINENZYM0L0GY,AcademicPress,SanDiego；ffolffe,CHROMATINSTRUCTUREAND FUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego, 1998 ；METH0DSINENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P.M.ffassarmanandA.P.ffolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego, 1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol. 119,ChromatinProtocols(P.B.Becker, ed.)HumanaPress，Totowa，1999 等。
[0042] 实施例1
[0043] CH0细胞株K70E10-1D6表达抗AGR2人源化单克隆抗体的稳定性检测
[0044] 1实验方法
[0045] (1)细胞株的连续传代
[0046] 将保藏号为CCTCCNO:C2014189 的CH0 细胞株K70E10-1D6 按照 3X105个/ml接 种到4ml体系中，该体系是在6孔细胞培养板中，培养基为EX-CELLKCDCH0Serum-Free MediumforCH0Cells(Sigma-Aldrich)，加入终浓度为8mM的谷氨酰胺、加入40iil的 Anti-clumpingAgent。由于该细胞株含有嘌呤霉素抗性标签，需要平行做两份，其中一份 加入终浓度为10Ug/ml的嘌呤霉素。放置在37°C，相对湿度70-80%，5%二氧化碳细胞培 养箱中的摇床上培养，转速为：125±5rpm。
[0047] 培养2天后观察细胞生长情况，计数。计数时先取50L，加入50L的0. 4%台 盼蓝染色液，而后加150iiL的PBS溶液稀释，用血细胞计数板进行计数。每次记录活细胞 数、死细胞数（被台盼蓝染成蓝色的为死细胞），计算重悬到lml后重新接种为3X105个/ ml浓度所需要的体积。计数后，通过lOOOrpm离心5分钟收集所有细胞，移除所有上清留 样，加入lml新鲜的培养基重悬，按照计算后的体积接种入一个新的6孔细胞培养板。如此 操作记为传1代。
[0048] (2)细胞培养上清液中抗体浓度的检测
[0049] 按照以上方法培养K70E10-1D6细胞株的各代上清液收获后，按照酶联免疫吸附 法（ELISA法）测定各代上清液中的抗AGR2人源化单克隆抗体的浓度。测定的方法如下。
[0050]包被抗原：抗原（AGR2-MBP)用抗原包被液（pH= 9. 6)稀释至5yg/ml，用多道移 液器（ThermoScientific)每孔加入100iiL，用自封袋封口，4°C过夜，次日弃去全部液体， 用PBS-T洗3遍，每孔200uL，每遍3分钟，拍干。
[0051] 封闭：配置封闭液,用多道移液器（ThermoScientific)每孔加入200iiL,用自封 袋封口，4°C过夜，次日弃去全部液体，用PBS-T洗3遍，每孔200iiL，每遍3分钟，拍干。
[0052]ELISA检测：
[0053] 1)将待测样品（CH0细胞株K70E10-1D6的细胞培养上清液）、标准品（1iig/ml的 抗AGR2人源化单克隆抗体标准品）均经抗体稀释液梯度稀释后，加入板中，每孔100yL设 置阴性对照（举例：细胞培养基），用抗体稀释液作为空白对照。可以做几个平行孔以减小 误差，用自封袋封口，4°C过夜。
[0054] 2)次日将液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200iiL，每遍3分钟，拍干。
[0055] 3)拍干后加入用二抗稀释液以1:10000的比例配置的二抗（goat-antihumanIgG H+LHRPconjugate，ProteinTech),每孔lOOuL，用自封袋封口，37°C孵育 1 小时。
[0056] 4)将上述液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200iiL，每遍3分钟，拍干。
[0057] 5)每孔加入底物显色液A、底物显色液B各80iiL，用自封袋封口，于37°C显色 30-60分钟，最后每孔加入50yL的终止液。用酶标仪在450nm处读数，并拍照或扫描保存 结果。
[0058] 数据处理：
[0059] 1)用阴性对照和空白对照的平均值作为本底值，测得数据减去本底值即为真实 值。
[0060] 2)以不同稀释梯度标准品的抗体浓度作为横坐标，以不同稀释梯度标准品对应的 真实值作为纵坐标，作图，在一定范围内拟合出线性的标准曲线，并使得R2>〇. 95,由此获得 标准曲线的拟合公式，此范围成为线性范围。
[0061] 3)在待测样品的真实值中寻找3个在线性范围内的值，代入拟合公式，计算出的 浓度乘以待测样品的稀释倍数，最后取平均值，即为待测样品中抗AGR2人源化单克隆抗体 的浓度。
[0062] (3)数据处理
[0063] 以传代次数为横坐标，绘制每一代的生长2天后细胞数的变化曲线、每一代的生 长2天后的抗体表达量曲线。
[0064] 将传代次数换算成细胞倍增次数，换算方法如下所示。该公式中，细胞密度的单位 是10 6个/ml，n指传代次数。
[0065]
【主权项】
1. 一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国 仓鼠卵巢细胞CH0-S/K70E10-1D6,所述细胞株的保藏号为：CCTCC N0:C2014189。
2. 如权利要求1所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株在制备抗 AGR2人源化单克隆抗体中的应用。
3. -种抗AGR2人源化单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO :C2014189的CH0细胞株或 其传代细胞株分泌产生。
4. 如权利要求3所述的一种抗AGR2人源化单克隆抗体，其特征在于，所述抗体与AGR2 抗原特异性结合。
5. 如权利要求1所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CH0细胞株和权利要求 3-4任一权利要求所述的抗AGR2人源化单克隆抗体在制备检测试剂或诊断试剂中的应用。
6. 如权利要求1所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CH0细胞株和权利要求 3-4任一权利要求所述的抗AGR2人源化单克隆抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应用。
7. 如权利要求6所述的抗AGR2人源化单克隆抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应 用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用。本发明提供一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株K70E10-1D6，所述细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2014189。本发明所提供的CHO细胞株K70E10-1D6能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，且制备获得的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与AGR2特异性结合，亲和力高达9.09×108L/mol，并能够抑制乳腺癌细胞MCF7的生长。CCTCC NO：C201418920141010
【IPC分类】A61K39-395, G01N33-577, A61P35-00, C12N5-20, C12R1-91, G01N33-574, C07K16-40
【公开号】CN104593333
【申请号】CN201410769174
【发明人】李大伟, 陈昊, 郭昊, 马少司, 杲光伟, 李东升, 荣荣, 武正华, 李哲奇, 朱奇, 苏琪达
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月12日