tabolic Explorer W02010/020681)的 yncA 基因（bl448，ECK1442)，
[0258] k)编码 RpoS 〇 因子的 rpoS 基因（b2741, ECK2736)。
[0259] 非常特别优选的特征选自：
[0260] a)编码L-甲硫氨酸生物合成的转录调节子（MetJ)的metj基因 (b3938,ECK3930)，
[0261] b)编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶（MetK, EC No. 2. 5. 1. 6)的metK基因 (b2942, ECK2937)，
[0262] c)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基（MetQNI)的metQ基因（b0197, ECKO197)，
[0263] d)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基（MetQNI)的metl基因（b0198, ECK0198)，
[0264] e)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基（MetQNI)的metN基因（b0199, ECKO199)，
[0265] f)编码推定的 N-酰基转移酶（YncA, Metabolic Explorer W02010/020681)的 yncA 基因（bl448，ECK1442)，
[0266] g)编码 RpoS 〇 因子的 rpoS 基因（b2741, ECK2736)。
[0267] 在适当情况中，除了所述增强基因以增加甲硫氨酸生产的措施，或者，如果需要， 与所述措施组合，执行弱化措施。
[0268] 根据本发明，在本发明的措施之前产生L-氨基酸的微生物不包括野生型菌株及 经常使用的实验室菌株，尤其是例如DH5 a、DH5 a mcr、W3110、MG1655、MC4100、Y1089、H560、 BL21 和 MM152。
[0269] 然而，产生L-氨基酸的微生物可以衍生自所述野生型菌株及经常使用的实验室 菌株。
[0270] 因此，微生物起始菌株优选衍生自大肠杆菌MG1655、大肠杆菌W3110、大肠杆菌 DH5 α、大肠杆菌DH10B、大肠杆菌BW2952、大肠杆菌REL606。
[0271] 根据本发明优选的分泌或产生L-甲硫氨酸的菌株的例子是大肠杆 菌生产菌株 MG1655AmetJ metA*llPtrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHPΔpurU Ptrc36-ARNmstl7-metF,具有 生产质粒 pME101-thrA*l-cysE_Pgap-metA*ll 和 pCClBAC-serB-glyA-serA-serC( W02009/043803)。
[0272] 根据本发明优选的分泌或产生L-甲硫氨酸的菌株的另一实例是大肠杆菌生产菌 株 MG1655AmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09_gcvTHP， 具有生产质粒 pME101-thrA*l-cysE_Pgap-metA*ll。
[0273] 大肠杆菌生产菌株 MG1655 Δ met J Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09_gcvTHP可以通过一系列Pl转导和固化而克隆，如专利申请 W02009/043803所述。该菌株基于大肠杆菌K12MG1655野生型菌株。在这个菌株的基因组 中导入如下修饰：
[0274] ?删除L-甲硫氨酸生物合成的阻抑物metJ基因。
[0275] ?将强trc启动子插入metH基因（编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶）的上游。
[0276] ?将强trc启动子插入metF基因（编码5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶）的上游。
[0277] ?将强trcF启动子插入在cysPUWAM操纵子上游。cysPUWA编码硫酸盐/硫代硫 酸盐摄取转运蛋白。cysM编码半胱氨酸合酶B。
[0278] ?将强trcF启动子插入cysJIH操纵子的上游。cysjl编码亚硫酸盐还原酶及cysH 编码3' -磷酸腺苷-硫酸还原酶。
[0279] ?将强trc09启动子插入gcvTHP操纵子的上游。gcvT、gcvH和gcvP编码甘氨酸 裂解系统的三种成分。
[0280] 大肠杆菌生产质粒pME101-thrA*l-cysE_Pgap-metA*ll的克隆在专利 申请W02007/077041和W02009/043803中描述。该质粒是基于载体pCL1920的 低拷贝数质粒（低拷贝质粒）（Lerner，C.G. and Inouye，M·，Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955])。空白质粒pMElOl具有IacItl基因，其编码lac阻抑物的 强表达的等位基因。将thrA*l基因克隆在可以被Lac阻抑物抑制的强trc启动子的下游。 其编码大肠杆菌ThrA天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的反馈抗性变体。相同方向的下游 是cysE基因及其天然启动子。其编码大肠杆菌丝氨酸乙酰转移酶。cysE的下游是强大肠 杆菌gapA启动子，其控制metA*ll基因的表达。metA*ll编码大肠杆菌高丝氨酸0-琥?白酰 转移酶的具有反馈抗性的变体。
[0281] 可能提及的根据本发明优选的其它分泌或生产L-甲硫氨酸的微生物的例子是如 下菌株：
[0282] -大肠杆菌 TF4076BJF metA#10+metYX(Lm) (W02008/127240 ;page46);
[0283] -大肠杆菌[110八1/?即451出卩 144531081，口&86 7,6叉&1^16 4);
[0284] -大肠杆菌 WΔ thrBC ΔmetJmetK32pMWPthrmetA4 Δ 5 Δ 9 (Yoshihiro Usuda and Osamu Kurahashi, 2005, Applied and Environmental Microbiology, VoI. 71, NO:6, pp.3228-3234)；
[0285] -W3110/pHC34(W001/27307 第 13 页，实施例 3);
[0286] -大肠杆菌 ECM2 (EP2205754A2、EP2326724A1 和 EP12156052. 8)。
[0287] 各种合适的微生物的进一步实例在Gomes等（Enzyme and Microbial Technology 37(2005),3-18)中描述。
[0288] 大肠杆菌的基因或开放读框（ORFs)的核苷酸序列属于现有技术且可在由 Blattner等（Science 277:1453-1462(1997))公开的大肠杆菌基因组序列中找到。已知宿 主内源性酶（甲硫氨酸氨基肽酶）能除去N-末端氨基酸甲硫氨酸。
[0289] 关于遗传和分子生物学术语的更详细的解释见于已知的遗传和分子生物学教科 书，例如 Birge 的教科书（Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed·，Springer Verlag，New York (USA) ,2000)或者 Berg、Tymoczko 和 Stryer 的教科书（Biochemistry, 5th ed·，Freeman and Company, New York (USA) ,2002)或者 Sambrook 等的手册（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (3-volume set), Cold Spring Harbor Laboratory PressjCold Spring Harbor(USA), 2001) 〇
[0290] 术语"基因"是指脱氧核糖核酸（DNA)上的一段，其包括首先产生（转录）核糖核 酸（RNA)的信息，RNA包括产生（翻译）蛋白质（多肽）的信息，在这种情况中，多肽具有 (p)ppGpp合成酶II的活性。基因或多核苷酸包括产生蛋白质的信息的事实也称作由基因 或者由RNA编码蛋白质或多肽。内源基因和多核苷酸分别是指存在于种群中的开放读框 (ORFs)、基因或等位基因及其多核苷酸。术语"基因"和"0RF"（开放读框）在本发明中同 义使用。
[0291] 术语"多核苷酸"通常是指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的 RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。
[0292] 术语"多肽"是指含有通过肽键连接的两或多个氨基酸的肽或蛋白质。术语多肽 和蛋白质可同义使用。蛋白质是所有细胞的基本构件。其不仅提供细胞结构，而且还是，转 运物质、催化化学反应及识别信号物质的分子"机器"。
[0293] "蛋白原性氨基酸"是指在天然蛋白质中，即在微生物、植物、动物和人的蛋白质 中，发现的氨基酸。其更特别地包括选自如下的L-氨基酸：L_天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏 氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲 硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨 酸、L-脯氨酸和L-精氨酸，以及硒代半胱氨酸。蛋白原性氨基酸总是α -氨基酸。α -碳 原子对于除了甘氨酸之外的所有蛋白原性氨基酸（其是手性分子）是不对称的：每个这些 氨基酸存在两种对映异构体。两个对映异构体之一是蛋白原性的，其是L-氨基酸：合成蛋 白质所需装置一一核糖体、tRNA、氨酰基-tRNA合成酶（其给tRNA提供氨基酸）等-自身 是手性的，且仅可识别L-变体。
[0294] 术语"基因表达"（简称"表达"）通常是指遗传信息经由表型的表现。狭义地讲， 基因表达是指基因转录为RNA，随后RNA翻译为可能具有酶活性的多肽。
[0295] "起始菌株"（亲代菌株）是指微生物菌株，对其进行增加一或多种氨基酸、肽或蛋 白质生产性的措施，或者增加一或多种酶活性的措施（例如导致过表达的措施）。起始菌 株可以是野生型菌株，或者是已经预先修饰的菌株（例如产生L-氨基酸的微生物（生产菌 株））。
[0296] 细胞的"野生型"优选是指其基因组是通过进化自然发生的状态。该术语用于完 整细胞及单独的基因。术语"野生型"因此特别不包括其基因序列已经至少部分通过人工 重组方法修饰的那些细胞或那些基因。
[0297] 本发明基于举例的实施方案在下文更详细阐明。
[0298] 用于大肠杆菌的最小（M9)和完全（LB)培养基已经由J. H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述。 除非另外描述，从大肠杆菌中分离质粒DNA及关于限制性酶切、连接、Klenow处理和碱性磷 酸酶处理的所有技术根据 Sambrook 等（Molecular cloning-A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述进行。除非另外描述，大肠杆菌的转化根据 Chung 等（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86:2172-2175(1989))所述进行。
[0299] 除非另外描述，产生菌株和转化体的温育温度是37°C。
[0300] 实施例1 :筛诜L-甲硫氨酸-耐#件突夺体
[0301] 生产L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株ECM2基于K12野生型菌株MG1655。如 EP2205754A2、EP2326724A1和EP12156052. 8所述，ECM2菌株具有具有反馈抗性的metA等 位基因，基因 metJ、yncA、pykA和pykF的删除，spoT基因的变体，及metH、metF、gcvT、cysP 和cysj每个基因上游的启动子增强。
[0302] L 1将serC基闵克降讲质粒DUC18
[0303] 借助于聚合酶链式反应（PCR)扩增来自大肠杆菌MG1655的serC基因，然后克隆 进 pUC18 质粒（Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany)中。
[0304] PCR引物serCF(XbaI)和serCR(HindIII)在每种情况中在其5'末端具有6个 随机的核苷酸，随后分别是限制性核酸内切酶XbaI (TCTAGA)和HindIII (AAGCTT)的识别 序列。serCF(Xbal)的核苷酸13-38结合在大肠杆菌MG1655基因组位置956619-956644。 serCR(Hindlll)的核苷酸13-37结合在大肠杆菌MG1655基因组的位置958028-958004。
[0305] serCF(Xbal) (SEQ ID NO:25)
[0306] 5' AGGTGCTCTAGAGTCCGCGCTGTGCAAATCCAGAATGG 3'
[0307] serCR(Hindlll)(SEQ ID NO:26)
[0308] 5' TACACCAAGCTTAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC 3'
[0309] 将serC基因使用聚合酶链式反应（PCR)扩增，使用引物serCF (XbaI)和 serCR(Hindlll)及 Phusion DNA 聚合酶（Finnzymes 0y, Espoo, Finland)进行。大肠杆菌 MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1434bp。将其用XbaI和HindIII限 制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany)纯 化。非甲基化的PUC18质粒DNA通过XbaI和HindIII限制性核酸内切酶裂解，并借助于 QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany)纯化。然后将裂解质粒与PCR产物连 接，转化进大肠杆菌DH5a中。含有serC基因的质粒克隆通过限制裂解和DNA测序鉴定。 所得质粒称作pUC18_serC。
[0310] I. 2将serA基闵克降讲pUC18-serC质粒中
[0311] 将大肠杆菌MG1655的serA基因借助于聚合酶链式反应（PCR)扩增，然后克隆进 质粒 pUC18_serC 中。
[0312] PCR引物serAF(Xbal)在其5'末端具有6个随机改核苷酸，随后是XbaI限制 性核酸内切酶的识别序列（TCTAGA)。核苷酸12-33结合在大肠杆菌MG1655基因组位置 3055199-3055220。PCR引物serAR(SHSSNB)在其5'末端具有6个随机核苷酸，随后是限制 性核酸内切酶SacI、HindIII、SphI、SmaI、NotI和BglII的识别序列。核苷酸49-58结合 在大肠杆菌MG1655基因组位置3056880-3056861。
[0313] serAF(Xbal) (SEQ ID NO:27)
[0314] 5'CTGTAGTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG 3'
[0315] serAR(SHSSNB)(SEQ ID NO:28)
[0316] 5' CAAGAGCTCAAGCTTGCATGCGATTCCCGGGCGGCCGCAATAAGATCTCCGTCAGGGCGTGGTGAC CG 3，
[0317] 将serA基因使用聚合酶链式反应（PCR)扩增，使用引物serAF (XbaI)和 serAR(SHSSNB)及 Phusion DNA 聚合酶（Finnzymes 0y, Espoo, Finland)。大肠杆菌 MGl655 的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1731bp。
[0318] 将其用XbaI和SacI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒 (Qiagen, Hilden, Germany)纯化。将pUC18_serC质粒同样通过XbaI和SacI限制性核酸内 切酶裂解及借助于QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany)纯化。然后将裂 解的质粒与PCR产物连接，并转化进大肠杆菌DH5a中。含有serA基因的质粒克隆通过限 制性裂解和DNA测序鉴定。所得质粒称作pUC18-serAC。
[0319] L 3将serB基闵克降讲pUC18-serAC质粒中
[0320] 将大肠杆菌MG1655的serB基因借助于聚合酶链式反应（PCR)扩增，然后克隆进 pUC18_serAC 质粒中。
[0321] PCR引物serB(Sphl)在其5'末端具有6个随机核苷酸，随后是SphI限制性 核酸内切酶的识别序列（GCATGC)。核苷酸13-34结合在大肠杆菌MG1655基因组位置 4622816-4622837。
[0322] PCR引物serB(Smal)在其5'末端具有6个随机核苷酸，随后是Sail (GTCGAC)和 SmaI (CCCGGG)限制性核酸内切酶的识别序列。核苷酸54-75结合在大肠杆菌MG1655基因 组位置 4623887-4623866。
[0323] serB(Sphl) (SEQ ID NO:29)
[0324] 5' CCATGCGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC 3'
[0325] serB(Smal) (SEQ ID NO:30)
[0326] 5' CCGCATGTCGACATCCCGGGGCAGAAAG