br>[0016] 在阅读本发明的详述和考虑附图（drawings/figures)后将理解本发明的进一步 方面、特征和优点。
[0017] 附图（drawings/figures)描述 图IA和IB显示使CHO细胞（克隆A)适应在没有生长因子（GF)的培养基中生长。如 实施例1中所述，将细胞在有（实心柱；GF)或没有（空心柱；不含GF)生长因子（GF)的培 养基中每3或4天传代。在适应的不同阶段的（A)细胞活力和（B)倍增时间。早：第1至 4代冲：第5至8代；晚：第9至12代。
[0018] 图2显示克隆B的活细胞密度（VCD)、百分比活力和倍增时间。该研宄中使用的 CHO细胞系最初从DG44亲本细胞亚克隆并且在不含生长因子/蛋白/肽的基础培养基（不 含GF)或具有生长因子（GF)胰岛素的基础培养基中培养，如实施例1中所述。
[0019] 图3显示当在有（INS)和没有胰岛素（INS-F)的情况下生长克隆A细胞时，来自 mTOR通路的蛋白的表达/磷酸化的变化，如实施例2中所述。
[0020] 图4A-D显示在具有lmg/L胰岛素的基础培养基中和具有10mg/L胰岛素的补料培 养基（INS)或不具有胰岛素的基础或补料培养基（不含INS)中生长的克隆A的活细胞密 度（V⑶）、百分比活力、a⑶40L蛋白滴度、百分比a⑶40L单体，如实施例3中所述。
[0021] 图5A-D显示使用克隆A的分批补料培养方法评估的不同龄或群体加倍的不含GF 和GF细胞。比较的是因素，包括分批补料培养的峰值活细胞密度（A)、终末活力（B)、均一 化的蛋白滴度（C)和均一化的比生产率（D)，如实施例3中所述。注：不含GF的细胞维持 与GF细胞的那些相比相对稳定的因素。
[0022] 图6A-D显示不含GF培养改善了克隆B的终末活力和蛋白滴度，并且降低了高分 子种类。适应在没有生长因子（不含GF)的培养基中生长的细胞在与总是暴露于胰岛素 (GF)的细胞类似的代数。不含GF和含GF的细胞遵循相同过程以分批补料模式培养，如实 施例3中所述。使用的基础培养基和补料培养基两者是化学上确定的。对于分批补料培养 过程，在第14天的（A)峰值活细胞密度（峰值VCD)、（B)终末细胞活力和（C)均一化蛋 白滴度。在培养结束时（第14天），从不含GF和GF细胞产生的蛋白的（D)总高分子种类 (HMW)〇
[0023] 图7A-C显示不含GF的培养改善了克隆C的细胞生长、终末活力和蛋白滴度。适应 在没有生长因子（不含GF)的培养基中生长的细胞在与总是暴露于胰岛素（GF)的细胞类 似的代数。不含GF和含GF的细胞遵循相同过程以分批模式培养，如实施例3中所述。用 于培养的培养基是化学上确定的。分批培养过程的（A)峰值活细胞密度（峰值VCD)、（B) 终末细胞活力和（C)均一化蛋白滴度。
[0024] 图8A-D显示不含GF的培养改善了克隆D的终末活力，并且降低了高分子种类。适 应在没有生长因子（不含GF)的培养基中生长的细胞在与总是暴露于胰岛素（GF)的细胞 类似的代数。不含GF和含GF的细胞遵循相同过程以分批补料模式培养，如实施例3中所 述。用于培养的基础培养基和补料培养基是化学上确定的。对于分批补料培养过程，在第 14天的（A)峰值活细胞密度（峰值VCD)、（B)终末细胞活力和（C)均一化蛋白滴度。在 培养结束时（第14天），从不含GF和GF细胞产生的蛋白的（D)总高分子种类（HMW)。
[0025] 图9A-D显示反向添加 （added back)至不含GF的培养物的GF改善了克隆B的细 胞生长、终末活力和蛋白滴度。适应在没有生长因子（不含GF)的培养基中生长的细胞在 与总是暴露于胰岛素（GF)的细胞类似的代数。不含GF和含GF的细胞在有或没有GF的化 学上确定的基础和补料培养基中以分批补料模式培养，如实施例4中所述。不含GF :细胞培 养基中不存在GF ;不含GF+ INS :在具有I mg/L胰岛素的基础培养基中和具有10 mg/L胰 岛素的补料培养基中培养的不含GF的细胞；类似地，不含GF + LR3:基础培养基中的4 Pg/ L L0NG?R3 (LR3)和补料培养基中的40 Pg/L LR3;GF:基础培养基中的I mg/L胰岛素和 补料培养基中的10 mg/L胰岛素 ；GF + LR3 :基础培养基中的I mg/L胰岛素和4 Pg/L LR3 和补料培养基中的10 mg/L胰岛素和40 Pg/L LR3。在上述条件下以分批补料模式培养的 细胞的（A)峰值活细胞密度（峰值VCD)、（B)终末细胞活力和（C)均一化蛋白滴度。在 培养结束时（第14天），在指定条件下产生的蛋白的（D)总高分子种类（HMW)。
[0026] 图10A-C显示反向添加至不含GF的培养物的GF改善了克隆C的细胞生长、终末活 力和蛋白滴度。适应在没有生长因子（不含GF)的培养基中生长的细胞在与总是暴露于胰 岛素（GF)的细胞类似的代数。不含GF和含INS的细胞在有或没有GF的化学上确定的基 础和补料培养基中以分批补料模式培养，如实施例4中所述。不含GF + INS:在具有I mg/ L胰岛素的基础培养基中和具有10 mg/L胰岛素的补料培养基中培养的不含GF的细胞；类 似地，不含GF + INS + LR3:基础培养基中的I mg/L胰岛素和4 Pg/L LR3和补料培养基 中的10 mg/L胰岛素和40 Pg/L LR3 ;GF + INS + LR3 :在基础培养基中存在I mg/L胰岛 素和4 Pg/L LR3和补料培养基中存在10 mg/L胰岛素和40 Pg/L LR3的情况下培养的GF 细胞。在上述条件下以分批补料模式培养的细胞的（A)峰值活细胞密度（峰值VCD)、（B) 终末细胞活力和（C)均一化蛋白滴度。
[0027] 图IlA-C显示反向添加至具有较低GF浓度的培养物的GF改善了克隆C的终末活 力，并且维持了细胞生长和蛋白滴度。适应在具有较低胰岛素浓度（0.01 mg/L;低INS)的 培养基中生长的细胞在与总是在具有较高胰岛素浓度（I mg/L;高INS)的相同培养基中培 养的细胞类似的代数。使用与实施例4中所述的相同的分批补料过程，低INS细胞在具有 0. 01 mg/L胰岛素的基础培养基中和具有10 mg/L胰岛素的补料培养基中培养；高INS细 胞在具有I mg/L胰岛素的基础培养基中和具有10 mg/L胰岛素的补料培养基中培养。对 于在上述条件下培养的细胞，在第14天的（A)峰值活细胞密度（峰值VCD)、(B)终末细胞 活力和（C)均一化蛋白滴度。
[0028] 图12A-C显示反向添加至不含GF的培养物的GF改善了克隆D的终末活力和蛋白 滴度。适应在没有生长因子（不含GF)的培养基中生长的细胞在与总是暴露于胰岛素（1 mg/L ;GF)的细胞类似的代数。不含GF和含GF的细胞在有或没有GF的化学上确定的基础 和补料培养基中以分批补料模式培养，如实施例4中所述。不含GF + INS + LR3:没有GF 的基础培养基中和具有10 mg/L胰岛素和40 Pg/L L0NG?R3 (LR3)的补料培养基中培养的 不含GF的细胞；类似地，GF + INS + LR3 :在基础培养基中存在I mg/L胰岛素和补料培养 基中存在10 mg/L胰岛素和40 Pg/L LR3的情况下培养的GF细胞。对于在上述条件下培 养的细胞，在第14天的（A)峰值活细胞密度（峰值VCD)、（B)终末细胞活力和（C)均一 化蛋白滴度。
[0029] 图13A-D显示GF反向添加策略最大限度地降低对于类似过程表现所需的GF浓 度。适应在没有生长因子（不含GF)的培养基中生长的克隆B细胞在与总是暴露于胰岛素 (I mg/L ;GF)的细胞类似的代数，如实施例4中所述。用相同的过程，不含GF的细胞