细胞的感染效率。分别 于感染后1，4, 7,14d用Trizol法提取各组骨髓间充质干细胞的总RNA，反转录为cDNA，设 计引物如下表1所示，用RT-qPCR法检测成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、 碱性磷酸酶的表达水平。为消除样品量的差异，引入内参基因GAPDH进行校正。记录Ct值 (基本循环数），即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经过的循环数。根据内参 基因GAPDH的循环数计算出ACt(基本循环与内参循环数差值），依据2_aAet相对定量法： A A Ct=(Ct目的基因一Ct管家基因）实验组一(Ct目的基因一Ct管家基因）对照组，计算出目的基因的相对拷 贝数。上述计算可采用统计学分析，即：应用SPSS13.0软件包作统计学处理，计量资料采 用；士S表示。采用AN0VA方差分析目的基因在不同时间点的表达水平有无显著性意义，当 P〈0. 05为差异有显著性意义。
[0047] 本发明实施例中，以大鼠骨髓间充质干细胞中作为对象，荧光定量PCR检测骨髓 间充质干细胞中骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平，结 果显示为：与空载体组及空白对照组相比，实验组各成骨因子表达水平显著增高，其P值分 别为0. 037,0. 047,0. 038,0. 033,均小于0. 05。其中，实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨形 态发生蛋白2的表达水平在转染后1，4, 7,14d分别为空载体组的2. 96倍、6. 85倍、6. 48倍、 6. 17倍，见附图7A所示；实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨钙蛋白的表达水平在转染后1， 4, 7,14d分别为空载体组的2. 50倍、5. 33倍、7. 13倍、7. 07倍，见附图7B所示；实验组大鼠 骨髓间充质干细胞中骨桥蛋白的表达水平在转染后1，4, 7,14d分别为空载体组的2. 44倍、 4. 98倍、6. 27倍、7. 32倍，见附图7C所示；实验组大鼠骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶的 表达水平在转染后1，4, 7,14d分别为空载体组的2. 27倍、4. 43倍、5. 81倍、5. 38倍，见附图 7D所示。空载体组与空白对照组相比，各成骨因子表达水平差异无显著性意义（P>0.05)。
[0048] 本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，从Hela细胞 中扩增出低氧诱导因子1a基因片段，然后利用慢病毒载体将低氧诱导因子1a导入至大 鼠骨髓间充质干细胞基因组DNA中，未见到明显的毒性反应，细胞生长良好；由于慢病毒载 体自带增强型绿色荧光蛋白，荧光显微镜下观察见骨髓间充质干细胞能大量表达低氧诱导 因子la(荧光强）；通过全骨髓贴壁培养法分离培养出大鼠骨髓间充质干细胞，形态学观 察到细胞的生长形态变化情况与文献相符，同时流式细胞仪检测了分离得到的骨髓间充质 干细胞表面标记物⑶90与⑶105表达呈阳性（分别为99. 8%、97. 3% )，证明成功的获得大 鼠骨髓间充质干细胞；使用荧光定量PCR法对携带低氧诱导因子1a的慢病毒感染过的骨 髓间充质干细胞的cDNA进行检测分析发现实验组成骨因子骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、 骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达水平显著高于空载体组及空白对照组（P〈〇. 05)，表明在体外实 验中低氧诱导因子la可以提高骨髓间充质干细胞中成骨因子的表达水平，提高其成骨活 性。
[0049]表1
[0050]
【主权项】
1. 一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，所述方法利用携带 低氧诱导因子1 α的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下述步骤： 构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-I a -eGFP :从Hela细胞中提取总RNA，反转录成 cDNA，分别设计含酶切位点BamH I的引物HIF-I a -F和含酶切位点和PspX I的引物 HIF-I a-R，利用上述引物对cDNA进行PCR扩增获得扩增基因片段一低氧诱导因子I α 基因；将慢病毒包装质粒载体Lenti-eGFP与所述扩增基因片段分别进行酶切处理，将 酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提，得到慢病毒表达载体 Lenti-HIF-I a -eGFP ; 携带低氧诱导因子1 α的慢病毒载体Lenti-HIF-1 a -eGFP的包装：将慢病毒表达载体 Lenti-HIF-Ια-eGFP与病毒包装质粒Lenti Pac HIV共转染至293Ta细胞中，进行病毒包 装，获得携带低氧诱导因子1 α的慢病毒载体Lenti-HIF-1 a -eGFP，收集病毒原液，并对病 毒滴度进行监控； 慢病毒载体Lenti-HIF-Ια-eGFP感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质干细 胞，当骨髓间充质干细胞融合度达70 %时，当病毒滴度以MOI为50时加入慢病毒载体 Lenti-HIF-1 a -eGFP进行慢病毒感染，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。
2. 如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，构 建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1 a -eGFP的步骤中，所述引物HIF-I a -F的序列为：5' -ACT AGA TGC TTT ATT GGA TCC GGT ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AA-3' ；所述引物 HIF-I a -R 的序列为：5' -AGC TGG GTT GCG GCC GCA CTC GAG CTA AAT AAT TCC TAC TGC TTG AAA AA-3'。
3. 如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，在 获得感染骨髓间充质干细胞后，还包括采用荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中骨形态 发生蛋白2、骨质蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平。
4. 如权利要求3所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，为 了评价所述感染骨髓间充质干细胞成骨因子的表达水平，分成三组进行平行实验并检测骨 髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2、骨质蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平： 用所述携带低氧诱导因子Ia的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为实验组、用不携带低氧 诱导因子I α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为空载体组、不进行处理的骨髓间充质干 细胞作为空白对照组。
5. 如权利要求1-3任一所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在 于，所述骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁培养法进行分离、培养、纯化获得。
6. 如权利要求5所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，所 述骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁培养法进行分离、培养、纯化的方法为：将大鼠脱颈 处死，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨；从股骨干和胫骨干中间剪断，用5mL无菌注射器 抽取SD大鼠骨髓间充质干细胞完全培养液反复冲洗骨髓腔，将冲洗液反复吹打混匀，制成 细胞悬液后转移至60_培养皿中，置于37°C、体积分数5% C02、饱和湿度的细胞培养箱内 培养；48h后首次换液，以后每2d换液1次；五六天细胞生长融合达80%以上，以0. 25% Trypsin-EDTA消化后按1 : 3的比例传入25cm2培养瓶中；用上述方法传代2次，获得第3 代骨髓间充质干细胞备用。
7.如权利要求1-3所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于， 所述慢病毒载体Lenti-HIF-I a -eGFP的包装方法如下： (1) 取细胞状态良好，处于对数生长期的293Ta细胞，接种于6孔细胞培养板，37°C、体 积分数为5% CO2饱和湿度细胞培养箱中培养； (2) 取慢病毒表达载体 Lenti-HIF-I a -eGFP 1 μ L，加入 5. 0 μ L LentiPac-HIV 混合包 装质粒，以Opti-MEMI稀释至200 μ L ; (3) 以Opti-MEMI稀释30 μ L EndoFectin转染试剂至400 μ L，室温培养20min后，边 轻柔进行祸旋，边往步骤（2)中加入稀释的EndoFectin转染试剂200 μ L ; (4) 将上述混合液体加入到6孔细胞培养板中，轻柔涡旋平板使复合物分散，放置在 37 °C、体积分数为5% CO2饱和湿度细胞培养箱中继续培养； (5) 培养12h后，吸出旧培养基，加入含体积分数为5%胎牛血清、青霉素和链霉素的新 鲜DMEM培养基，再加入4 μ L TiterBoost试剂，在37°C、体积分数为5% C02饱和湿度细胞 培养箱中继续培养； (6) 转染48h后收集培养基，以500r/min离心10min去除细胞碎片，获得含慢病毒载体 Lenti-HIF-I a -eGFP 的培养基。
【专利摘要】本发明适用于生物医药领域，提供了一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法。该方法利用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下述步骤：构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP；携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装；慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP感染骨髓间充质干细胞，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。
【IPC分类】C12N15-867, C12Q1-68
【公开号】CN104830907
【申请号】CN201510136473
【发明人】熊建义, 王大平, 张巨峰, 付志杰, 李庆庆, 廖福朋
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年3月26日