)及 2 μ L 不同浓度的 Τ4 PNKP(0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、lU/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、25U/mL)，混合均匀，在37°C恒温条件下孵育80min ；
[0042]步骤三、将上述溶液补充为终体积为100 μ L的MOPS缓冲溶液(1mM MOPS, 150mMNaCl,pH 7.6)，其中包括10 μ L抗坏血酸钠(2mM)和10 μ L硫酸铜(200 μ Μ)，混合均匀，在室温下孵育1min ；
[0043]步骤四、最终的反应液在340nm的激发波长下得到520?660nm的荧光光谱图(见图2a)以及体系荧光强度与T4 PNKP浓度的线性对应关系(见图2b)。
[0044]实施例2
[0045]步骤一、设计探针序列如下:5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTCGC ACC TAA AGG GTG CG-3' (3'端磷酸化修饰);
[0046]步骤二、25yL Tris-HCl 缓冲体系(1mM Tris-HCl, 1mM MgCl，50mM NaCl，pH7.9)中包含 5 μ L探针(I μ Μ), I yL KF 聚合酶(50U/mL)，2 μ L dNTPs (200 μ Μ)，5 μ L不同浓度的肝素(O μ g/mL、0.2 μ g/mL、0.5 μ g/mL、l μ g/mL、2 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL、25 μ g/mL)及2 μ L Τ4 PNKP (25U/mL)，混合均匀，在37°C恒温条件下孵育80min ；
[0047]步骤三、将上述溶液补充为终体积为100 μ L的MOPS缓冲溶液(1mM MOPS, 150mMNaCl,pH 7.6)，其中包括10 μ L抗坏血酸钠(2mM)和10 μ L硫酸铜(200 μ Μ)，混合均匀，在室温下孵育1min ；
[0048]步骤四、最终的反应液在340nm的激发波长下得到体系相对荧光强度与肝素浓度的对应关系(见图3)。
[0049]实施例3
[0050]步骤一、设计探针序列如下:5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTCGC ACC TAA AGG GTG CG-3' (3'端磷酸化修饰);
[0051]步骤二、25yLl%肺癌细胞裂解液 Tris-HCl 缓冲体系(1mM Tris-HCl, 1mMMgCl，50mM NaCl, pH 7.9)中包含 5 μ L 探针(I μ Μ)，I μ L KF 聚合酶(50U/mL)，2 μ LdNTPs (200 μ Μ)及 2 yL 不同浓度的 T4 PNKP (0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、lU/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、25U/mL)，混合均匀，在37°C恒温条件下孵育80min ；
[0052]步骤三、将上述溶液补充为终体积为100 μ L的MOPS缓冲溶液(1mM MOPS, 150mMNaCl,pH 7.6)，其中包括10 μ L抗坏血酸钠(2mM)和10 μ L硫酸铜(200 μ Μ)，混合均匀，在室温下孵育1min ；
[0053]步骤四、最终的反应液在340nm的激发波长下得到520?660nm的荧光光谱图(见图4a)以及体系荧光强度与细胞裂解液中T4 PNKP浓度的对应关系(见图4b)。
【主权项】
1.一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:它是通过以下步骤实现的: 步骤一、设计3'端磷酸化修饰的发夹探针，5'端为富含T碱基的序列； 步骤二、将上述探针用Tris-HCl缓冲溶液稀释到浓度为200?ΙΟΟΟηΜ，并把一定量T4PNKP> Klenow Fragment、dNTPs 与之混合，37°C反应 60 ?120min ； 步骤三、将上述反应液稀释为MOPS缓冲体系，并加入硫酸铜、抗坏血酸钠，在室温下反应 I ?30min ； 步骤四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，确定体系荧光强度与T4 PNKP浓度之间的对应关系。2.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的设计探针5'端T基个数为大于等于20。3.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的探针的浓度为200?ΙΟΟΟηΜ。4.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测Τ4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的Klenow Fragment的用量为10?1000U/mL。5.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的dNTPs的用量为100?5000 μ M。6.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测Τ4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的Τ4 PNK的用量为O?50U/mL。7.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的抗坏血酸钠的用量为ImM?I μΜ。8.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测Τ4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的硫酸铜的用量为50 μΜ?20mM。9.如权利要求1所述的一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶的新方法，其特征在于:所述的探针与T4 PNKP、Klenow Fragment等酶的反应时间为60?120min，所述的步骤三焚光铜纳米颗粒的合成时间优选lOmin。10.一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶抑制剂的新方法，其特征在于:它是通过以下步骤实现的: 步骤一、设计3'端磷酸化修饰的发夹探针，5'端为富含T碱基的序列； 步骤二、将上述探针用Tris-HCl缓冲溶液稀释为所需浓度，并把一定量肝素、T4 PNKP,Klenow Fragment、dNTPs 与之混合，37°C反应 60 ?120min ； 步骤三、在上述反应液中再加入MOPS缓冲溶液、硫酸铜、抗坏血酸钠，在室温下反应I ?30min ； 步骤四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，确定体系荧光强度恢复与肝素浓度之间的关系； 其中，肝素的用量为O?25yg/mL，设计探针5'端胸腺嘧啶碱基个数，探针的浓度，Klenow Fragmen、T4 PNKP、dNTPs、抗坏血酸钠、硫酸铜的用量，探针与肝素、T4 PNKP>KlenowFragment等酶的反应时间，焚光铜纳米颗粒的合成优选时间等参数与上述权利要求2_9检测T4 PNKP时相同。
【专利摘要】本发明公开了一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法，它是通过以下步骤实现的：一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T碱基的序列；二、将上述探针用Tris-HCl缓冲溶液稀释到浓度为100～1000nM，并把一定量T4 PNKP、Klenow Fragment、dNTPs与之混合，37℃反应40～150min；三、将上述反应液稀释为MOPS缓冲体系，并加入硫酸铜、抗坏血酸钠，室温下反应1～30min；四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，得到体系荧光强度与T4 PNKP浓度之间的对应关系，本发明方法操作简单、成本低、灵敏度高、选择性好，能够定量检测并筛选T4 PNKP及其抑制剂，为其他末端修饰酶检测方法的建立和分子生物学诊断提供了潜在的应用价值。
【IPC分类】C12Q1/48, C12Q1/44, C12Q1/68
【公开号】CN104894222
【申请号】CN201510336445
【发明人】张琳, 李朝辉, 葛佳, 董真真
【申请人】郑州大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日