](3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.5mol/l EDTA溶液5ml，4°C下震荡反应lh，于3000rpm离心洗涤lOmin，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
[0048]经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为91.7%。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留76.4%。
[0049](4)对照试验
[0050]将质量比为8:1柱状假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH=，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5%的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000r/min离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为75%。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为37.7%。
[0051]实施例5
[0052](I)将质量比为7:1皱褶假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH = 7.5，摩尔浓度为0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.4mol/l氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4?25°C温度条件下磁力搅拌lmin，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaC0#j粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加ISOmL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
[0053](2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)溶液1.2ml，4°C下缓慢震荡lmin，静置45min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2?3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
[0054](3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.3mol/L的EDTA溶液8ml，4°C下震荡反应lh，于3000rpm离心洗涤lOmin，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
[0055]经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为97.7%。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留86.5%。
[0056](4)对照试验
[0057]将质量比为7:1皱褶假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH =7.5，摩尔浓度为0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加180mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5%的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000rpm离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为77%。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为47.5%。
【主权项】
1.一种可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将游离态脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于磷酸盐缓冲液中配制成酶溶液；加入氯化钙溶液中混合均匀后，再加入碳酸钠溶液，经搅拌、静置，得到球形碳酸钙颗粒；滴加饱和硫酸铵溶液，经震荡、静置、离心洗涤，得到脂肪酶共沉淀颗粒； (2)向步骤(I)得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入二硫苏糖醇溶液，经震荡、静置、离心洗涤以去除二硫苏糖醇，得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液悬浮分散后，静置，得到分子间交联自组装固定化脂肪酶微粒； (3 )向步骤(2 )得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入EDTA溶液，经震荡洗涤后，离心洗涤3?5次以去除氯化钙和碳酸钠的反应产物碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。2.根据权利要求1所述的可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (O将质量比为10?5:1的游离态脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于浓度为0.1?1.0mol/L、pH值为5.8?8的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为10?15mg/ml的酶溶液，加入0.2?0.5mol/L氯化钙水溶液，混合均匀后，快速加入等量、等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在4?25°C条件下磁力搅拌I?2min，静置2?3h，通过共沉淀让游离态脂肪酶分子均匀分散于碳酸钙微粒内部，形成稳定的球形碳酸钙颗粒；再滴加酶溶液体积3?4倍的饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25 °C下震荡I?2min，静置2?3h后，3000rpm离心洗涤3min，得到脂肪酶共沉淀颗粒； (2)向步骤(I)得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入50mmol/L的二硫苏糖醇溶液，4?25°C下震荡I?2min，静置30?45min以打开酶分子内的二硫键，然后3000rpm离心洗涤3min以去除二硫苏糖醇，将获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2?3h，使游离的巯基在脂肪酶分子间重新形成新的二硫键，得到分子间交联自组装固定化酶微粒； (3)向步骤(2)得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入0.05?0.5mol/L的EDTA溶液，4?25°C下震荡洗涤lh，再离心洗涤3?5次以去除碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。3.根据权利要求1或2所述可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、扩展青霉脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶或皱褶假丝酵母脂肪酶。4.根据权利要求1或2所述可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述脂肪酶与碳酸钙的质量比为0.1?1:1 ;所述脂肪酶与二硫苏糖醇的质量比为0.01?0.1:1 ;所述EDTA与碳酸钙的质量比为0.05?0.1:1。5.权利要求1?4中任意一条权利要求所述制备方法制得的可控多孔无载体固定化脂肪酶。
【专利摘要】本发明公开了一种可控多孔无载体固定化脂肪酶及其制备方法。本发明所述可控多孔无载体固定化脂肪酶是通过脂肪酶、氯化钙、碳酸钠和硫酸铵共沉淀制备脂肪酶/碳酸钙微球，再加入二硫苏糖醇进行脂肪酶交联自组装，然后用乙二胺四乙酸二钠去除碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。本发明所述可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备过程是在常温常压下进行，操作条件温和，制得的可控多孔无载体固定化脂肪酶具有结构稳定，形貌、孔道尺寸可调控，微粒内成分单一，酶活性高，可有效降低底物分子的传质限制，提高了酶催化效率，适合推广应用。
【IPC分类】C12N9/20, C12N11/00
【公开号】CN104911162
【申请号】CN201510358156
【发明人】袁振宏, 苗长林, 吕鹏梅, 庄新姝, 王忠铭, 罗文 , 李惠文, 杨玲梅, 刘姝娜
【申请人】中国科学院广州能源研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月24日