-RGD发生自切割，透析至pH8.0缓冲液中。SDS-PAGE跑胶鉴定；
[0046]6) IL10-RGD 纯化
[0047]0.1M Tris-Cl (pH 8.0),0.1M NaCl缓冲液平衡柱，上样后缓冲液平衡柱后用含0.01,0.02,0.15,0.25M咪唑线性洗脱，收集各个峰样品，浓缩后SDS-PAGE鉴定；银染结果证明样品纯度达95%以上，即为rhIL-10-R⑶。
[0048]本发明的有益效果是:
[0049]上述重组载体pTWINl-his-1L10诱导表达后，在蛋白纯化过程中大大减少了纯化的难度。在前期的实验过程中，尝试很多种表达载体，表达效果都不理想，即使采用PTWINl原始载体的特性进行纯化也没有达到纯化的目的，因此采用二次构建，即将PTWIN1-1L10载体中Intein-1LlO-RGD再次PCR，而后将PCR产物与pTWINl-1L10同时酶切，连入。诱导表达，SDS-PAGE灰度扫描鉴定目的蛋白诱导表达量45%以上，证明此表达系统的可靠性；多次纯化均得到目的蛋白，进而表明其稳定性。后期实验表明此表达纯化系统可有效重复。
[0050]本发明通过基因工程手段将人白介素10 (human interlenkin 10，hIL_10)与新生血管内皮细胞特异结合的RGD多肽在基因水平融合表达，重组形成新的蛋白(rhIL-ΙΟ)，并赋予了该蛋白抗肿瘤以及机体免疫功能活性。更为重要的是其在伤口愈合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕纤维化的形成。
【附图说明】
[0051]图1是本发明重组载体的质粒图谱。
[0052]图2是本发明纯化工艺流程图。
【具体实施方式】
[0053]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0054]实施例1:
[0055]rhIL-ΙΟ重组载体的构建及在大肠杆菌中表达、纯化
[0056]( 一 )rh-1L10 基因的扩增
[0057]I)总RNA的提取
[0058]正常人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤2次，重悬于10%PRMI1640培养液，加入终浓度为10g/L的ConA，置5% 0)2培养箱，37°C培养48h，收集细胞。根据Sigma RNA抽提试剂盒方法，提取总RNA，_80°C保存备用；
[0059]2) RNA反转录及IL-10 cDNA的扩增
[0060]利用Takara公司反转录试剂盒，按照说明进行RT-PCR反应:第一步去除基因组DNA,5 X gDNA Eraser Buffer 2 μ I, gDNA Eraser I μ I, Total RNA 500ng, Rnase FreedH20 加至 10 μ 1，42°C温育 2min ;第二步反转录，分别加入 PrimeScript RT Enzyme MixI I μ I, RT Primer Mixl μ 1，5XPrimeScript Buffer 24μ1，第一步反应液 10 μ 1，RnaseFree dH20 加至 20 μ 1，37°C温育 30min，85°C反应 3min 后得到 cDNA。
[0061]( 二 )重组载体的构建、表达及其鉴定
[0062]l)pTWINl-1L10表达载体的构建
[0063]按大肠杆菌惯用密码子设计RGD基因序列、引物及相应的酶切位点，合成如下2条引物F1、R1 ；
[0064]RGD 导向肽氨基酸序列如下:H2N-Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH ；
[0065]RGD 基因序列:5，tgt gat tgc cgt ggt gat tgt ttc tgt 3，；
[0066]Fl:5' GCTCTTCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAG3' BspQI
[0067]Rl:5' CTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACGGCAATCACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3' PstI
[0068]以Fl、Rl 为引物，cDNA 为模板，随之按 95°C 1s 预变性，95 °C 30s, 55 °C 30s，72 °C Imin，30个循环后72 °C进行延伸5min，得到PCR产物，产物及pTWINl载体分别经BspQI/Pst I双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化DH5a，挑取单克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定，得到pTWINl-1LlO-RGD表达载体。
[0069]2)pTWINl-his-1L10 表达载体的构建
[0070]带有his标签his-1L10-R⑶扩增引物:
[0071]F2:5，CGCAACATATGCATCATCATCATCATCATAACAACGGTAACAACGGTCTCG3，Nde1/6 X his
[0072]R2:5，AACTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACG 3，PstI
[0073]以F2、R2为引物，pTWINl-1LlO-RGD为模板，随之按95 °C 1s预变性，95 0C 30s,60 °C 30s, 72 °C 1.2min，30 个循环后 72 °C 进行延伸 5min，得到 PCR 产物，产物及pTWINl-1L10-RGD载体分别经Ndel/PstI双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化Rosetta，挑取单克隆，抽提质粒，酶切鉴定，进一步经测序鉴定，构建成pTWINl-his-1LlO-RGD表达载体的工程菌；
[0074]3)rhIL-10重组蛋白在大肠杆菌中的表达
[0075]上述工程菌pTWINl-his-1L10-RGD/Rosetta接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养过夜，次日以I %的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素发酵培养基中，继续在37°C震荡培养至对数生长中期，培养液光密度0D_为0.6时，加入ImM IPTG继续培养5hr诱导表达，离心收集菌体。
[0076]4)rhIL_10蛋白表达的检测及鉴定
[0077]将诱导表达的菌体培养物离心，收集菌体，采用12%的SDS-PAGE电泳分析表达产物，IPTG诱导与未诱导样相比，在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带，与预计融合蛋白的分子量大小相符。将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上，常规Western blot分析，ECL发光，可见一明显显色带，分子量一致，未诱导菌株，标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性反应。
[0078](三)rh-1L10融合蛋白的纯化方法，如图2所示
[0079]I)融合蛋白 his-1ntein-1L10-RGD 的粗提
[0080]如图1所示，取诱导表达的菌体20g，用200ml裂解液(1mM Tris-Cl，pH8.5 ；lmMEDTA, pH 8.0)，磁力搅拌器充分搅拌15min后，加入200 μ I溶菌酶(50 μ g/ml)，充分搅拌15min，4°C静置 Ihr，取样 50 μ 1，12000rpm 离心 5min，上清中加入 2 X loading buffer 混勾，沉淀中加入50 μ I ddH20重悬，加入2Χ loading buffer混勾。废水煮5min，12000rpm离心5min，经SDS-PAGE检测发现表达的融合蛋白存在于沉淀中，说明诱导表达的重组蛋白是以包涵体形式存在的；
[0081]2)包涵体洗涤
[0082]第一步，加入0.1% (w/v)脱氧胆酸钠(DOC)，继续加入ImM MgCl2，加入2.5 μ g/ml DNA酶(Dnase I)，磁力搅拌器充分搅拌20min，取样50 μ I后静置lOmin，4°C离心，12000rpm/min，离心 20min，弃上清；
[0083]第二步，加入200ml裂解液，0.5% DOC(w/v)进行洗涤，磁力搅拌器搅拌15min，取样 50 μ I 后静置 lOmin, 4°C离心，12000rpm/min,离心 20min，弃上清；
[0084]第三步，加入200ml裂解液，0.5% Triton X-100 (v/v)，磁力搅拌器搅拌15min，取样 50 μ I 后静置 lOmin, 4°C离心，12000rpm/min,离心 20min，弃上清；
[0085]第四步，重复上一步操作；
[0086]3)包涵体溶解
[0087]第一步，400ml溶解液(0.1M Tris-Cl (pH 10.0) ,0.1M NaCl，8M 尿素，1mM 2-巯基乙醇(β -ME))溶解包涵体，磁力搅拌器搅拌1.5hr，4°C静置过夜；
[0088]第二步，将上述溶解液12000rpm离心20min，收集上清；
[0089]第三步，将上清装入透析袋，用pH8.0溶解液不含β -ME透析24_36hr，换液2_3次，离心收集上清。
[0090]4)融合蛋白 his-1ntein-1L10-RGD 的纯化
[0091]取GE 公司镇柱基质 NI Sepharose Fast Flow 装柱，柱体积 5.4X 15cm，用 ρΗ8.0溶解液不含β -ME平衡，上样后分别用含0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3Μ咪唑ρΗ8.0溶解液线性梯度洗脱，收集各个峰样品，SDS-PAGE鉴定；
[0092]5)融合蛋白his-1ntein-1L10-RGD的复性及自切割
[0093]于4°C在复性缓冲液的逐渐稀释下缓慢复性。最终在pH6.0缓冲液中融合蛋白his-1ntein-1L10-RGD发生自切割。透析至pH8.0缓冲液中。SDS-PAGE跑胶鉴定；
[0094]6) ILlO-RGD 纯化
[0095]0.1M Tris-Cl (pH 8.0),0.1M NaCl缓冲液平衡柱，上样后缓冲液平衡柱后用含
0.01,0.02,0.15,0.25M咪唑线性洗脱，收集各个峰样品，浓缩后SD